王 飛，宓捷波，李淑靜，陳其勇,吳 華

(1.天津出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心,天津 300461;2.安捷倫科技有限公司,北京 100102)

實驗技術(shù)

改良的QuEChERS樣本前處理/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉中四環(huán)素類獸藥的殘留

王 飛1*，宓捷波1，李淑靜1，陳其勇1,吳 華2

(1.天津出入境檢驗檢疫局 動植物與食品檢測中心,天津 300461;2.安捷倫科技有限公司,北京 100102)

采用Agilent公司的增強型脂質(zhì)去除產(chǎn)品Bond Elut EMR-Lipid,建立了針對豬肉中四環(huán)素類藥物殘留的更快更高效的QuEChERS樣品前處理方法。樣品經(jīng)酸化乙腈提取，Bond Elut EMR-Lipid QuEChERS凈化后，采用HPLC-MS/MS檢測，方法檢出限可達5.0 μg/kg；四環(huán)素、金霉素和強力霉素的回收率為75.6%～89.4%，土霉素的回收率為53.4%～61.0%，相對標準偏差均不大于7.7%。

EMR-Lipid；QuEChERS；四環(huán)素類；獸藥殘留；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

四環(huán)素類藥物是畜牧飼料中常用的抗生素[1]，由于動物源性食品中的四環(huán)素類抗生素殘留不易降解，消費者食用后可能產(chǎn)生抗藥性[2-3]。此外，四環(huán)素類藥物能夠與骨骼中的鈣結(jié)合，導致骨質(zhì)發(fā)育障礙甚至骨骼畸形。因此，對動物源性食品中四環(huán)素類抗生素的檢測尤為重要。

目前，四環(huán)素類抗生素的檢測多采用液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-7]，前處理大多采用EDTA-Mcllvaine 緩沖液為提取溶劑[8-9]，再以固相萃取柱凈化。傳統(tǒng)方法用于含油脂較多的動物源性樣品時，往往凈化過柱速度緩慢，且回收率不穩(wěn)定。QuEChERS前處理方法快速、簡單[10-11]，在獸藥殘留分析方面的應用日趨廣泛[12-13]。本方法采用Agilent公司的Bond Elut EMR-Lipid新型除脂吸附劑對豬肉組織樣品進行凈化，建立了新的四環(huán)素類藥物殘留分析的QuEChERS前處理方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Applied Biosystems 公司API4000 Q-trap 型質(zhì)譜儀，配Shimadzu 20A 型液相色譜儀。四環(huán)素、強力霉素、金霉素、土霉素標準品均購于Dr.Ehrenstorfer試劑公司，純度≥98%。配制標準溶液時，先以甲醇溶解標準樣品，再以甲醇稀釋至所需濃度。甲醇、甲酸、乙腈(色譜純，迪馬公司)。除另有說明，其他試劑均為分析純，實驗用水為Milli-Q 純水儀凈化生產(chǎn)的超純水(密理博公司，美國)。QuEChERS樣品制備所用增強型脂質(zhì)去除吸附劑Bond Elut EMR-Lipid和鹽析試劑Bond Elut EMR-Polish購于安捷倫科技有限公司。

EDTA-Mcllvaine 緩沖液：分別稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉10.9 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，用去離子水溶解并定容至1 L(溶液pH值約4.0)。實驗所用豬肉樣品均購于超市；雞肉陽性樣品來源于養(yǎng)雞場。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理方法 在室溫條件下，準確稱取凍去骨豬肉樣品2.0 g于50 mL離心管內(nèi)，加入10 mL含有5%甲酸的乙腈提取液，渦旋振蕩提取2 min后，在10 ℃以8 000 r/min的速度離心5 min，取上清提取液備用。EMR-Lipid吸附劑首先以5 mL水充分潤濕活化，隨后加入5 mL酸化乙腈提取液，渦旋振蕩1 min，在10 ℃ 8 000 r/min高速低溫離心5 min，取5 mL上清液加入預裝有NaCl和無水Na2SO4的EMR-Polish管中，充分振搖進行鹽析，在10 ℃ 8 000 r/min高速低溫離心5 min，取適量上層乙腈過0.22 μm有機尼龍濾膜，過濾后上機進行液質(zhì)分析。

1.2.2 儀器條件 色譜柱：Poroshell 120 SB-C18柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm,美國Agilent公司)；柱溫：25 ℃；流動相：乙腈(A)+0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：1～4 min，10%～50%A，至5 min時升至90%A，保持該比例至9 min，然后恢復至初始比例；進樣量：10 μL；流速：0.15 mL/min。

API 4000Q-Trap質(zhì)譜，離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；采集模式：多反應監(jiān)測模式；毛細管電壓：5.5 kV；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣流速：15 L/h；碰撞氣流速：中速；待測目標物的定性、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量見表1。

表1 4種四環(huán)素類獸藥的選擇離子與保留時間Table 1 Selected ions and retention time of four tetracyclines

*the daughter ion and its precursor ion were used as quantitative ion pair

圖1 不同溶劑對四環(huán)素類藥物的提取效果Fig.1 Effect of different solvent on extraction efficiencies of tetracyclines

圖2 四環(huán)素類藥物標準混合溶液(10 μg/L，以凍去骨豬肉基質(zhì)提取液配制)的多反應監(jiān)測離子流色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring(MRM) chromatograms of four tetracyclines standard solution(10 μg/L) in pork sample

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

分別嘗試了以含有5%甲酸的乙腈、EDTA-Mcllvaine 緩沖液以及EDTA-Mcllvaine 緩沖液-乙腈(2∶5，體積比)作為提取溶劑時對4種四環(huán)素類藥物的提取和回收效果(見圖1)。從圖中可以觀察到，酸化乙腈的效果明顯優(yōu)于其它兩種提取液，最終選擇含5%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。為獲得更充分的提取，采取了酸化乙腈均質(zhì)提取的方式。

EMR-Lipid吸附劑除雜脫脂過程中，振蕩應盡可能劇烈，以有利于吸附劑與待凈化液之間充分作用。由于鹽析的過程中會釋放大量熱，兩次離心均采用低溫條件，以防止過熱導致殘留藥物分解。

2.2 儀器條件的選擇

本研究選擇薄殼型填料Poroshell 120SB-C18色譜柱對四環(huán)素類藥物進行分離，此填料(2.7 μm)和規(guī)格(2.1 mm×150 mm)的色譜柱具有較高的分離柱效，同時具有較低的色譜壓力和較高的柱載量，非常適合分析動物源樣品基質(zhì)中的藥物殘留。由于前處理過程中有鹽析步驟，為了防止殘留無機鹽對離子化效率的影響以及對質(zhì)譜離子源的污染，優(yōu)化色譜條件使目標物在色譜柱上有充分的保留，并采用閥切換的方式將初始無機鹽流出時間段的流動相切至廢液，應用過程中檢測靈敏度穩(wěn)定，且質(zhì)譜前端撇分器入口處未見鹽結(jié)晶。為避免四環(huán)素類藥物與金屬離子形成螯合物，同時減弱四環(huán)素類藥物在反相柱上的吸附，流動相中加入0.1%甲酸。以凍去骨豬肉基質(zhì)溶液配制濃度為10 μg/L的四環(huán)素類混合標準溶液，得到的多反應監(jiān)測色譜圖如圖2所示。

以流動注射的方式，優(yōu)化4種四環(huán)素類標準溶液的質(zhì)譜參數(shù)，以確定母離子、子離子及去簇電壓、碰撞能量(見表1)。

2.3 線性范圍與相關(guān)系數(shù)

在優(yōu)化條件下，配制系列濃度的 4種四環(huán)素(0.5，5，10，20，50 μg/L)的豬肉基質(zhì)加標溶液，以目標物質(zhì)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)對其峰面積(y)進行線性擬合，考察其線性關(guān)系。結(jié)果顯示，4種四環(huán)素在0.5 ～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，其信號響應與質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99(見表2)。

2.4 回收率、精密度與檢出限

稱取空白豬肉樣品18份，分別添加25，50,100 μg/kg 3個不同濃度水平的四環(huán)素標準品，每個濃度做6個平行，按照優(yōu)化方法進行前處理實驗，結(jié)果顯示，在上述3個濃度下，四環(huán)素、金霉素和強力霉素的平均回收率為75.6%～89.4%，土霉素的平均回收率為53.4%～61.0%，略低于其它3種藥物。雖有文獻[5]指出可能是由于實驗中接觸到的金屬離子與四環(huán)素類藥物的相互作用所致，但從圖1可以看出，以EDTA- Mcllvaine-乙腈混合溶液為提取溶劑時，并未明顯改善土霉素的提取效果。根據(jù)GB/T 27404-2008[14]的要求，在本實驗添加濃度范圍內(nèi)，回收率需達到60%～120%，因此在檢測實際樣品中的土霉素時，可以通過折算回收的方式進行彌補。

表2 四環(huán)素類獸藥在豬肉樣品中的線性方程、相關(guān)系數(shù)與加標回收率Table 2 Regression equations,correlation coefficients(r) and average recoveries of tetracyclines residues in pork sample

本方法的檢出限采用添加回收法實際測定得到，4種四環(huán)素類藥物在空白豬肉基質(zhì)中的檢出限為5.0 μg/kg，其定量離子的多反應監(jiān)測色譜圖如圖3所示。

2.5 陽性樣品的測定

為了進一步驗證方法的可靠性，采用本方法對1個含有土霉素的雞肉陽性樣品進行實際測定，并以國標GB/T 21317-2007 法進行對照。結(jié)果顯示，兩種方法的檢測結(jié)果分別為18.7 μg/kg和18.3 μg/kg，測定結(jié)果相當。而與國標方法相比，新的EMR-Lipid QuEChERS方法步驟簡單，且無需過柱和氮吹，大大節(jié)省了樣品的前處理時間。

3 結(jié) 論

本研究將新型EMR-Lipid脂質(zhì)去除產(chǎn)品引入標準QuEChERS前處理工作流程，應用于動物源性樣品獲得了理想的除脂凈化效果,整體方法快速易行，且簡單可靠，能夠滿足日常檢測的需要。

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Determination of Tetracyclines Residues in Pork by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Modified QuEChERS Sample Pretreatment

WANG Fei1*,MI Jie-bo1,LI Shu-jing1,CHEN Qi-yong1,WU Hua2

(1.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Plants Animals and Foods Inspection Center,Tianjin 300461,China;2.Agilent Technologies,Beijing 100102,China)

A modified QuEChERS sample pretreatment method was established for the determination of tetracycline residues in pork.The new method adopted a novel lipid-removal material(EMR-Lipid) in QuEChERS procedure,and provided fast and effective sample extraction and cleanup of high-fat sample such as pork.The LODs of the method were 5.0 μg/kg.The recoveries of tetracycline,chlortetracycline,doxycycline were in the range of 75.6%-89.4% and the recoveries of oxytetracycline were in the range of 53.4%-61.0%,with RSDs not more than 7.7%.

EMR-lipid;QuEChERS;tetracyclines;residue detection;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2016-08-28；

2016-10-20

檢驗檢疫行業(yè)標準(2014B358)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.021

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)02-0272-04

*通訊作者：王 飛，碩士研究生，工程師，研究方向：農(nóng)獸藥殘留及食品添加劑分析，Tel:022-66273154，E-mail：wangf@tjciq.gov.cn