王志偉，閆慧嬌，王曉，陳躍，林云良

(山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南250014)

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

氫核磁共振法測定中藥茜草中大葉茜草素和羥基茜草素的含量

王志偉，閆慧嬌，王曉，陳躍，林云良*

(山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南250014)

綜合運用一維和二維核磁共振波譜技術，對茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素的信號進行指認歸屬，并建立氫核磁共振法同時測定茜草中大葉茜草素、羥基茜草素含量的方法。在綜合考慮茜草提取物的信號分離度及溶解性的基礎上，最終選定氘代二甲基亞砜為測試溶劑，以大葉茜草素的烯烴信號(δH5.77, H-2′)和羥基茜草素的H-3信號(δH6.67)為定量峰，以順丁烯二酸為定量內標。該方法具有較好的穩(wěn)定性、重復性、精密度和準確性，且測定結果與HPLC-UV方法所得數(shù)據(jù)基本一致。所建立的氫核磁定量方法操作簡單，測試時間短，且定量過程中不需要對照品，可用于中藥茜草的質量控制及評價。

茜草；大葉茜草素；羥基茜草素；定量氫核磁共振；質量控制

茜草(RubiacordifoliaL.)作為常用中藥，已被《中國藥典》收錄[1]。茜草含有萘醌類、蒽醌類、三萜類等活性成分[2-3]。其中，大葉茜草素的含量較高，具有抗血小板聚集、保護神經(jīng)等功效[4-5]；而羥基茜草素與茜草質量的優(yōu)劣存在直接的相關性[6]。因此，大葉茜草素、羥基茜草素的含量常被用于茜草的質量評價。目前，對這兩種成分的測定多采用HPLC-UV法，存在耗時、需要標準品等缺點。而羥基茜草素穩(wěn)定性較差，易被氧化。因此，建立一種快速、可靠的測定茜草中大葉茜草素、羥基茜草素含量的方法具有一定的現(xiàn)實意義。

近年來，定量氫核磁共振法已被廣泛應用于中藥材、食品、生化樣品等復雜體系中活性成分的定量分析[7-15]。2010版《中國藥典》已將該方法收錄其中。該方法用于定量分析的理論基礎是：在適當?shù)膶嶒灄l件下，定量峰的積分面積與其質子數(shù)成正比。當選用合適的內標后，可用于目標化合物的含量測定。該方法簡單、快捷，定量分析過程中無需相應化合物的標準品，且對測試樣品無損壞。

鑒于目前對茜草提取物中化學成分的相關核磁共振波譜學數(shù)據(jù)相對不足，對其中主要化學成分的信號歸屬的基礎研究工作相對缺乏等實際問題，本研究在對茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素結構確定的基礎上，采用氫核磁共振建立了茜草中大葉茜草素、羥基茜草素的含量測定新方法，并對18批市售茜草樣品進行了分析，測定結果與HPLC-UV所得數(shù)據(jù)基本一致。

1 材料與儀器

BrukerAvance III 400共振波譜儀，配備Bruker Topspin 3.2工作站(德國布魯克公司)；Varian INOVA-600核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Mettler Toledo MX5 電子分析天平(梅特勒-托利多公司)。

大葉茜草素(質量分數(shù)99.0%，批號110884-201405)、羥基茜草素(質量分數(shù)86.7%，批號111898-201102)標準品購自中國食品藥品檢定研究院；順丁烯二酸(質量分數(shù)99.0%，批號30318)，德國奧格斯堡；DMSO-d6(氘代純度，摩爾分數(shù)99.9%)，Cambridge Isotope Laboratories。

茜草(RC-1～RC-18)購自各地藥店，共計18批，所有樣品均經(jīng)山東省分析測試中心劉偉副研究員鑒定為茜草科茜草屬茜草的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 核磁共振(NMR)波譜儀參數(shù)設置

2.1.1 BrukerAvance III 400的儀器參數(shù)

zg30脈沖序列；弛豫延遲時間(d1) 為6.0 s；采樣時間為4.1 s；采樣次數(shù)為128次；譜寬為11 996 Hz；以Bruker Topspin 3.2軟件采集、處理數(shù)據(jù)。采用手動調整相位和基線，并進行手動積分, 實驗過程中以四甲基硅烷信號作為參考確定化學位移標準。每個定量峰重復積分6次，取平均值。

2.1.2 Varian INOVA-600儀器參數(shù)

1H NMR的質子共振頻率為599.78 MHz，譜寬為7 197 Hz，自由感應衰減信號(free induction decay signal, FID)累加128次。為了對NMR信號歸屬，采集了樣品的氫-氫化學位移相關譜(1H-1H correlated spectroscopy,1H-1H COSY)，1H檢測的異核多量子相干相關譜(1H detected heteronuclear multiple-quantum coherence,1H-13C HMQC)，1H檢測的異核多鍵相關譜(1H detected heteronuclear multiple bond connectivity,1H-13C HMBC)等2D NMR譜。其中，1H-1H COSY的F2(1H)和F1(1H)維的譜寬均為7 634.3 Hz，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1= 2 290×128，每一條FID累加8次；HMQC的F2(1H)和F1(13C)維的譜寬分別為7 634.3 Hz 和37 700.3 Hz，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1= 2 290×128，每一條FID累加16次；HMBC的F2(1H)和F1(13C)維的譜寬分別為7 634.3 Hz 和37 700.3 Hz，采樣數(shù)據(jù)點陣t2×t1= 2 290×400，每一條FID累加32次。

2.2 色譜條件

色譜柱為ThermoAcclaimTM120 C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，進樣量10 μL，其他條件與《中國藥典》一致。

2.3 供試樣品的制備

2.3.1 用于茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素信號歸屬的樣品制備方法

稱取4 g經(jīng)粉碎的茜草藥材于錐形瓶中，加入300 mL甲醇，在30 ℃下，超聲提取3次，每次15 min，合并后減壓回收溶劑至干，加入體積分數(shù)為10%的鹽酸溶液、氯仿各150 mL，超聲2 min，然后在85 ℃下加熱回流30 min(重復3次)，取氯仿層，合并氯仿層，減壓回收溶劑至干，以600 μL DMSO-d6溶解，取500 μL于核磁管中，進行1D NMR及2D NMR測試。

2.3.2 用于定量的樣品制備方法

精密稱取200 mg經(jīng)粉碎的茜草藥材于錐形瓶中，加入30 mL甲醇，在30 ℃下，超聲提取3次，每次15 min，合并后減壓回收溶劑至干，加入體積分數(shù)為10%的鹽酸溶液、氯仿各15 mL，超聲2 min，然后在85℃下加熱回流30 min(重復3次)，取氯仿層，合并氯仿層，減壓回收溶劑至干，以600 μL DMSO-d6溶解，精密量取480 μL于核磁管中，并加入20 μL順丁烯二酸內標溶液(207.16 μg/mL)，進行1H NMR測試。精密量取剩余樣品溶液100 μL，以900 μL甲醇稀釋至1 000 μL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，用于HPLC-UV 分析。用于樣品測試及方法學考察的順丁烯二酸內標溶液的配制方法：精密稱取5.179 mg順丁烯二酸，以1 mL DMSO-d6溶解。

2.4 定量化合物的NMR數(shù)據(jù)歸屬

首先，我們通過2D NMR對茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素1D NMR數(shù)據(jù)進行了歸屬。在COSY譜中，在δH5.77的雙重峰(d, 8.4 Hz)與δH6.85的雙重峰(d, 9.0 Hz)存在相關；在HMQC譜中，該質子與δC130.3處的叔碳信號相關；在HMBC譜中，在δH1.40處的甲基氫信號與δC130.3和δC75.3相關，通過以上信息并結合其他信號歸屬，確定δH5.77為大葉茜草素中H-2′的烯氫信號。在HMQC譜中，δH6.67處的單峰與δC110.4叔碳信號存在相關；在HMBC譜中，該氫信號與δC160.8，δC157.6，δC149.7，δC105.6處的季碳信號相關，以上信息表明δH6.67應為羥基茜草素的H-3信號。詳細的大葉茜草素、羥基茜草素的化學位移數(shù)據(jù)見表1，結構見圖1。這是首次對茜草提取物中大葉茜草素、羥基茜草素的NMR數(shù)據(jù)進行指認歸屬。

圖1 大葉茜草素、羥基茜草素的結構式Fig.1 Structures of mollugin and purpurin

化合物位置δH(J/Hz)δCHMQC1H?1HCOSYHMBC大葉茜草素1-151．9--H?82-106．0--H?1′3-112．8--H?2′4-141．2--H?1′，H?558．04(d，8．0)121．9+H?6H?767．61(t，6．6)129．4+H?5，H?7H?877．53(t，7．2)127．0+H?6，H?8H?588．19(d，8．4)123．8+H?7H?64a-127．8--H?6，H?88a-125．1--H?5，H?71′6．85(d，9．0)121．6+H?2′-2′5．77(d，8．4)130．3+H?1′H?4′/5′3′-75．3--H?4′/5′4′/5′1．40(s)27．0+-H?2′?COOCH33．91(s)53．0+--?COOCH3-170．6--?COOCH3羥基茜草素1-149．7--H?32-157．6--H?336．67(s)110．4+--4-160．8--H?358．08(d，7．8)126．9+H?6H?767．86(m)134．6+H?5H?577．81(t，7．8)134．3+H?8H?888．13(d，7．2)127．0+H?7H?69-184．0--H?810-182．6--H?54a-105．6--H?310a-133．1--H?88a-133．0--H?79a-113．0---

2.5 定量峰的確定

以DMSO-d6為1H NMR測試溶劑時，順丁烯二酸的信號峰δH6.28，大葉茜草素的烯烴信號δH5.77 (H-2′)，羥基茜草素的H-3信號δH6.67與茜草提取物中其他信號具有較好的分離度，可用于大葉茜草素、羥基茜草素的1H NMR定量。大葉茜草素、羥基茜草素標準品及茜草提取物的1H NMR譜見圖2。

1 大葉茜草素；2 羥基茜草素；IS 順丁烯二酸。圖2 對照品及茜草樣品 1H NMR譜圖Fig.2 The 1H NMR spectra of reference compounds and Rubiae Radix et Rhizoma extract

2.6 縱向弛豫時間T1的測定

稱取大葉茜草素0.380 mg、羥基茜草素0.260 mg、順丁烯二酸0.654 mg, 分別置于核磁管中，加入0.5 mL DMSO-d6溶解，用于1H NMR測試?？v向弛豫時間T1采用質子反轉-恢復T1實驗方法進行測定，并用Bruker的T1計算程序計算。設定脈沖弛豫延遲時間范圍為1 ～30 s。經(jīng)測定，用于大葉茜草素、羥基茜草素定量的信號的T1值分別為1.5 s，2.0 s，順丁烯二酸烯烴信號的T1值為2.5 s。

2.7d1值的優(yōu)化

首先我們測定了大葉茜草素、羥基茜草素、順丁烯二酸定量峰的縱向弛豫時間T1值。采用90°脈沖測定樣品時，為滿足d1≥5T1max的要求，d1值最小為12.5 s，這種情況下樣品測試時間較長。在確保準確性的前提下，本文采用30°脈沖，考察不同d1值(1～15 s，1 s間隔)對大葉茜草素、順丁烯二酸定量信號積分面積的影響。結果表明，與90°脈沖，d1值為15 s時測定的積分值(積分面積完全反映該信號的質子數(shù))相比較，采用30°脈沖，d1值為6 s時可以達到99.1%的“回收率”，大大縮短了樣品的測定時間。因此，經(jīng)優(yōu)化后采用的儀器測定參數(shù)為30°脈沖，d1值6 s，128次掃描，采樣時間為4.1 s。

2.8 準確性考察

精密稱取大葉茜草素4.978 mg，羥基茜草素3.575 mg，以1 000 μL DMSO-d6溶解后，分別精密量取400 、200 、100 、50 、25 、12.5 、6.3 μL置于核磁管中，各加入20 μL順丁烯二酸內標溶液，分別加入80 、280 、380 、430 、455 、467.5 、473.7 μL DMSO-d6后進行1H NMR測定。以理論濃度為橫坐標，以實測濃度為縱坐標，進行回歸分析。信噪比3和10時分別為最低檢測限和最低定量限。如圖3所示，大葉茜草素公式為y=0.967x+0.025，羥基茜草素公式為y=0.967x+0.009，實測值與理論值基本一致，相關系數(shù)分別為0.999 9, 1.000 0,結果表明該方法具有較好的準確性。大葉茜草素最低檢測限和最低定量限分別為7.59 μg/mL、22.76 μg/mL；羥基茜草素最低檢測限和最低定量限分別為10.52 μg/mL、31.56 μg/mL。

圖3 大葉茜草素、羥基茜草素標準溶液理論濃度與測定濃度回歸分析圖Fig.3 Relationships between mollugin and purpurin concentrations determined by quantitative 1H NMR and the theoretical concentrations

2.9 精密度試驗

取含大葉茜草素3.982 mg/mL、羥基茜草素2.846 mg/mL、順丁烯二酸207.16 μg/mL的標準溶液連續(xù)測試6次，連續(xù)測試3 d，分別考察儀器日內和日間精密度，結果顯示以積分面積的相對標準偏差計大葉茜草素、羥基茜草素的日內精密度分別為0.8%，0.7%,日間精密度分別為0.8%，1.2%,說明儀器精密度良好。

2.10 重復性試驗

取同一樣品6份(RC-18)，按照2.3.2項方法平行制備供試品溶液，按2.1.1項設置NMR儀器參數(shù)。大葉茜草素、羥基茜草素積分面積的相對標準偏差分別為3.5%，1.7%，表明重復性良好。

2.11 穩(wěn)定性試驗

取含大葉茜草素、羥基茜草素、順丁烯二酸分別為3.982 、2.846 、207.16 mg/mL的標準溶液，每2 h進行一次1H NMR測試，連續(xù)測定24 h。經(jīng)測定，大葉茜草素、羥基茜草素積分面積的相對標準偏差分別為1.4%，1.6%,表明供試樣品24 h內穩(wěn)定性良好。

2.12 加樣回收率試驗

精密稱取9份已知大葉茜草素含量的RC-18樣品200 mg，分為3組，每組分別精密加入相當于原質量分數(shù)50%、100%、150%的大葉茜草素標準品。按照2.3.2項的方法制備供試樣品，計算加樣回收率。結果表明，大葉茜草素平均回收率為94.7%～103.2%，相對標準偏差均小于3.9%。

2.13 樣品分析

利用建立的1H NMR定量方法，分析了18批各地藥店市售茜草藥材中大葉茜草素、羥基茜草素的含量，并將本方法的結果與HPLC-UV測定數(shù)據(jù)進行了比較，如表2所示，兩種方法所得結果基本一致。

表2 茜草藥材中大葉茜草素、羥基茜草素含量(mg/g)

注：a為相對標準偏差 (n= 3)。

3 討論

結果表明，各地藥店市售茜草藥材中大葉茜草素(0.62 ～10.08 mg/g)的含量較高，而羥基茜草素的含量較低(0.50 ～2.97 mg/g)，各樣品間兩化合物的含量相差較大，藥材質量參差不齊。

本方法能同時分析中藥茜草中大葉茜草素、羥基茜草素的含量，分析時間較短，具有較好的準確性和精密度，定量過程中通過選擇順丁烯二酸作為內標，避免使用相應的標準品，可用于中藥茜草的質量評價，對建立其他中藥材的氫核磁共振定量方法具有一定的指導意義。

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Quantitative determination of mollugin and purpurin from traditional Chinese medicine Rubiae Radix et Rhizoma by1H NMR

WANG Zhi-Wei, YAN Hui-Jiao, WANG Xiao, CHEN Yue, LIN Yun-Liang*

(Shandong Provincial Key Laboratory for TCM Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Sciences, Jinan, 250014)

∶ The1H chemical-shift values of mollugin and purpurin in extract from Rubiae Radix et Rhizoma were assigned on the basis of 1D and 2D NMR, and a specific, simple, sensitive1H NMR method has been developed and validated for the simultaneous quantitative determination of mollugin in extract from Rubiae Radix et Rhizoma When the solvent effects on the resolution of target signals and the solubility of the crude extracts were taken into account, dimethyl sulfoxide-d6was selected as an optimal1H NMR solvent. Quantitative determination was carried out by using the signal of the olefinic proton of mollugin (δH5.77, H-2′) and H-3 of purpurin (δH6.67), which were not interfere with other signals. Maleic acid was selected as internal standard because of its stable physical and chemical properties and having simple resonance signal. The improved method possessed good stability, repeatability, precision and accuracy for the quantification of mollugin and purpurin and the determination results agreed with the data obtained by HPLC-UV method. Due to its simple operation, short test time and without any reference compound, the proposed quantitative1H NMR method can alternatively be used for the quality control of Rubiae Radix et Rhizoma.

∶Rubiae Radix et Rhizoma; mollugin; purpurin; quantitative1H NMR; quality control

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.01.001

2016-05-09

山東省科學院青年科學基金(2014QN005)；山東省自然科學基金三院聯(lián)合基金(ZR2015YL012)

王志偉(1983—)，男，博士，研究方向為中藥效物質基礎及質量控制，E-mail：wzwcpu@163.com

*通信作者，林云良。 Tel：0531-82605343；E-mail：wodekafei@126.com

R284.1

A

1002-4026(2017)02-0001-07