方遠航，李嘉妮

賈第蟲和隱孢子蟲檢測及滅活方法研究現(xiàn)狀

方遠航，李嘉妮

（沈陽建筑大學 市政與環(huán)境工程學院，遼寧 沈陽 110168）

賈第蟲和隱孢子蟲 (簡稱“兩蟲”)是兩種嚴重危害水質(zhì)安全的病原性原生動物。目前，針對水中“兩蟲”的檢測與滅活方法的研究還處于起步階段，仍需大量的實驗研究。本文綜述了“兩蟲”的特性及危害，重點闡述了以EPA 1623法、免疫學技術(shù)、體外細胞感染和反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）為代表的檢測方法，以氯氣、二氧化氯、紫外、超聲和紫外發(fā)光二極管為代表的滅活方法，同時對未來“兩蟲”的檢測及滅活方法發(fā)展進行了展望。

賈第蟲； 隱孢子蟲； 滅活； EPA 1623法；紫外發(fā)光二極管

水資源是人類賴以生存必不可少的組成部分，對經(jīng)濟社會發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。致病性微生物或原生動物是危及飲用水安全的主要因素，其中水源性隱孢子蟲病和賈第蟲疾?。[孢子蟲和賈第鞭毛蟲以下簡稱“兩蟲”）的爆發(fā)尤為突出。自20世紀以來，在全球范圍內(nèi)均有“兩蟲”疾病爆發(fā)的報道出現(xiàn)，涵蓋了六大洲70多個國家，美國疾病控制預(yù)防中心基于大數(shù)據(jù)對“兩蟲”疾病爆發(fā)進行了估計，推斷全球年感染“兩蟲”疾病患者約200萬例。本文就水中賈第蟲和隱孢子蟲的特性、檢測及滅活方法進行詳細闡述，以期加深對“兩蟲” 的了解，揭示“兩蟲”的檢測滅活機理，為發(fā)展“兩蟲”滅活新方法提供理論依據(jù)。

1 “兩蟲”特性及危害

隱孢子蟲（Cryptosporidium）和賈第鞭毛蟲（Giardia）(“兩蟲”)是寄生于人和動物體內(nèi)的腸道原蟲。人類和牲畜飲用了含有這些原蟲卵囊或孢囊的水可引起嚴重的消化道感染，甚至死亡。水、食物是“兩蟲”疾病爆發(fā)傳播最重要的兩種途徑，“兩蟲”通過水和食物進入人體可引發(fā)腹瀉、痙攣、嘔吐等癥狀，甚至危及人體生命安全。“兩蟲”疾病是世界上傳播范圍最廣的腹瀉病之一，是世界衛(wèi)生組織認定的新型傳染病。此病對免疫力低下患者的危害更大，可引發(fā)多種并發(fā)癥，嚴重時可危及生命。艾滋病患者若接觸“兩蟲”將引發(fā)多種并發(fā)癥，死亡率幾乎達100%[1]。從2004 到2010 年，全球約有120萬例隱孢子蟲病被發(fā)現(xiàn)檢出。

1987年我國在南京首次報道發(fā)現(xiàn)了“兩蟲”疾病感染案例，隨后全國多地均有此病爆發(fā)現(xiàn)象發(fā)生。我國14個?。ㄊ小^(qū)）的腹瀉兒童，“兩蟲”疾病平均感染率為2.41%，各地感染率為0.9%至9.7%[2]。美國早在1996年和2002年就將隱孢子蟲感染和賈第鞭毛蟲感染列入國家必須申報的傳染病名單中。新版《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB5749-2006）中已將賈第蟲和隱孢子蟲列入微生物學檢測內(nèi)容中，并規(guī)定10 L水中不得檢出兩蟲。“兩蟲”疾病呈全球爆發(fā)的趨勢，對人類健康有著極大的威脅。因此，如何控制“兩蟲”爆發(fā)及研發(fā)可靠的“兩蟲”的檢測與滅活方法刻不容緩。

2 “兩蟲”檢測方法

目前國內(nèi)外常用的“兩蟲”檢測評價方法包括EPA 1623 法、IFA（免疫熒光檢測法）、體外細胞感染、原位雜交技術(shù)、RT-PCR 技術(shù)等。

2.1 EPA 1623法

“EPA 1623法”由美國國家環(huán)保局（EPA）研發(fā)，是當前全球公認的測定水中隱孢子蟲和賈第蟲的標準方法。概括地說，該方法總體可分成三部分。第一，過濾水樣以收集“兩蟲”卵囊和孢囊；第二，采用免疫磁分離法，對樣品進行過濾以達到純化的目的；第三，通過免疫熒光顯微鏡法，檢測上述步驟所得樣品中的“兩蟲”數(shù)量個數(shù)。目前國內(nèi)較大的水務(wù)企業(yè)進行“兩蟲”檢測時均采用該方法。

2.2 IFA（免疫學技術(shù)）

Christy等[3]運用改良的酶聯(lián)免疫學方法檢測了人腸道中的隱孢子蟲和賈第蟲，并于其他三種方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)免疫學方法在檢測“兩蟲”的靈敏度和特異性方面均有進一步提升的可能性。

2.3 體外細胞感染技術(shù)

人結(jié)腸癌細胞是經(jīng)由子孢子入侵人工培養(yǎng)的動物細胞，通過無性繁殖產(chǎn)生裂殖子，從而形成新的卵囊細胞。Rochelle等[4]采用HCT-8感染和CD-1感染，檢測經(jīng)過紫外和氯消毒后“兩蟲”卵囊感染性，結(jié)果顯示兩者具有良好的相關(guān)度。

2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)建立在分子水平，由于細胞脫氧核糖核酸（DNA）具有良好的活性，在細胞凋亡后依然可以存活一定時間，因而給常規(guī)PCR技術(shù)檢測卵囊活性帶來了挑戰(zhàn)。Jex等[5]利用包被抗原的磁珠對隱孢子蟲卵囊進行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)，在待測水樣中篩選出具有活性的隱孢子蟲卵囊。

近些年，我國科研工作者也借鑒國外經(jīng)驗開發(fā)出一些新的檢測方法。張彤等[6]借鑒美國國家環(huán)?？偩郑‥PA）的1623檢測方法，并對其進行了優(yōu)化，取得了較好的檢測效果。張冬青等[7]以免疫熒光染色法對飲用水中的“兩蟲”進行定量和定性分析，其卵囊和孢囊初始回收率分別為56%和35%，遠高于EPA1623方法的要求。

3 “兩蟲”滅活方法

3.1 氯 氣

氯氣可以有效的殺滅水中的細菌病毒等致病物質(zhì)，但只有在密度值高達7 200 mg·min/L 上時，方才對“兩蟲”具有一定的滅活效果。與此同時，不可避免的產(chǎn)生了諸多的消毒副產(chǎn)物，對飲用水水質(zhì)產(chǎn)生不良影響。此外，氯消毒也存在一定的安全風險，如水中微量有機物易與氯反應(yīng)，可能產(chǎn)生三氯甲烷、鹵乙酸、四氯化碳等強致癌物質(zhì)。

3.2 二氧化氯

二氧化氯（ClO2）是國際上公認的高效消毒滅菌劑，它可以殺滅一切微生物，包括細菌繁殖體、細菌芽孢、分枝桿菌和病毒等，并且這些細菌不會產(chǎn)生抗藥性。因此，越來越多國家和地區(qū)在飲用水處理工藝中選擇二氧化氯作為給水廠消毒劑。

3.3 紫 外

紫外線（UV）對于水中病原微生物的消毒十分有效。紫外消毒技術(shù)是在近代防疫學、醫(yī)學和光動力學的基礎(chǔ)上，利用特殊設(shè)計的高效率、高強度和長壽命的紫外波段直接照射水體，將水中各種細菌、病毒、寄生蟲、水藻以及其他病原體直接殺死。紫外滅活“兩蟲”主要是針對DNA進行的，紫外消毒可抑制或阻礙核酸復(fù)制和蛋白表達，從而導致細胞凋亡。

3.4 超 聲

目前國內(nèi)外針對“兩蟲”的超聲滅活研究并不多，超聲滅活“兩蟲”的研究剛剛起步。 M.Olvera等[8]采用1 MHz高頻超聲對隱孢子蟲卵囊進行了滅活研究。結(jié)果顯示：60 mL的樣品被注射到蒸餾水中并定容到確定的體積，其中含90%的隱孢子蟲卵囊，每個樣品中的卵囊溶度為3.3×102個/mL，超聲處理在室溫（24~25 ℃）下進行，在超聲的過程中每間隔1 min記錄一次溫度及pH的變化，溫度隨時間的增加而升高，而pH則先降后升，2 min、1 MHz的超聲處理卵囊的存活率下降了87.82%，4 min后失去活性的卵囊數(shù)量上升至94.02%，最終10 min后滅活率依然為94.02%；同時對超聲滅活隱孢子蟲卵囊的能量和經(jīng)濟消耗進行了核算，在100 mL樣品中滅活數(shù)與能量消耗的關(guān)系大約是7個卵囊/W，少于0.1個卵囊/J。

3.5 紫外發(fā)光二極管

紫外發(fā)光二極管技術(shù)指能發(fā)出近紫外光的一種發(fā)光二極管，它的發(fā)光原理同普通發(fā)光二極管一樣。它的基本結(jié)構(gòu)是一塊電致發(fā)光的半導體材料，置于一個有引線的架子上，然后四周用環(huán)氧樹脂密封，起到保護內(nèi)部芯線的作用。21世紀以來，國內(nèi)外對紫外發(fā)光二極管在微生物滅活方面的效果進行了大量研究。Bowker等[9]采用紫外發(fā)光二極管技術(shù)研究了三種非病原微生物（MS-2噬菌體、T7噬菌體和大腸桿菌）與UV能力密度的關(guān)系。結(jié)果表明：雖然UV-LED技術(shù)在進行消毒處理時能量輸出較低，且需要較長的暴露時間，但卻是可以作為常規(guī)汞燈UV消毒的替代方法。

4 結(jié) 論

研究水中賈第蟲和隱孢子蟲的檢測及滅活方法，對提高用戶終端用水質(zhì)量，降低居民健康風險，確保飲用水水質(zhì)安全具有重要意義。目前我國關(guān)于“兩蟲”的研究檢測剛剛起步，仍需要大量的實驗研究去完善。構(gòu)建科學合理的賈第蟲和隱孢子蟲檢測及滅活方法，為飲用水安全、二次消毒防控提供基礎(chǔ)，揭示“兩蟲”的檢測滅活機理，為發(fā)展“兩蟲”滅活新方法提供理論依據(jù)，必將成為一個新的研究方向。

［1］Oconnor R M, Shaffie R, Kang G, et al.Cryptosporidiosis in patients with HIV/AIDS[J]. Aids, 2011, 25(5):549-60.

［2］蔡炯. 介水藍氏賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲感染的流行現(xiàn)狀及控制[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 15(11):1401-1402.

［3］Christy N C V, Hencke J D, Cadiz E D, et al. Multisite performance evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Giardia, Cryptosporidium, and Entamoeba histolytica antigens in human stool[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50(5):1762-3.

［4］Rochelle P A, Upton S J, Montelone B A, et al. The response of Cryptosporidium parvum, to UV light[J]. Trends in Parasitology, 2005, 21(2):81-7.

［5］Jex A R, Smith HVMonis P T, Campbell B E, et al. Cryptosporidium--biotechnological advances in the detection, diagnosis and analysis of genetic variation.[J]. Biotechnology Advances, 2008, 26(4):304-17.

［6］張彤, 胡洪營, 宗祖勝. 免疫磁性分離法檢測水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲的影響因素[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2007, 24(1):56-58.

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［8］Olvera.M, Eguia. A, Rodriguez. O, et al. Inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts in water using ultrasonic treatment[J].BioresourceTechnology, 2008, 99: 2046-2049.

［9］Bowker. C, Amanda S, Max S, et al. Microbial UV fluence-response assessment using a novel UV-LED collimated beam system[J]. Water Research, 2011, 45: 2011-2019．

Research Status of Detection and Inactivation Methods of Giardia and Cryptosporidiosis

,

（Shenyang Jianzhu University, Liaoning Shenyang 110168, China）

Giardia and cryptosporidiosis are two specie pathogenic protozoan, which endanger the safety of the water quality seriously. At present, study on the methods for detection and inactivation of giardia and cryptosporidiosis are still in its infancy. In this paper, characteristics and hazards of giardia and cryptosporidium were introduced; detection methods such as EPA 1623, immunological technique, infection cell and RT-PCR were discussed as well as inactivation methods such as Cl2, ClO2, ultraviolet, ultrasonic and UV-LED. At the same time, the development trend of detection and inactivation methods of giardia and cryptosporidiosis was prospected.

giardia; cryptosporidiosis; inactivation; EPA 1623; UV-LED

X 703

A

1004-0935（2017）04-0399-03

2017-03-10

方遠航（1994-），男，碩士研究生，江西省上饒市人，研究方向：污水處理及其資源化。