（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

以關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙草抗赤星病基因分子標(biāo)記

朱承廣，任民，蔣彩虹，張雨生，孫明銘，劉旦，程立銳，楊愛國(guó)，王元英*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

篩選與抗赤星病位點(diǎn)緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為煙草分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。利用404對(duì)SSR引物對(duì)96份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行基因組掃描，分析其群體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行煙草赤星病抗性關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在兩種不同環(huán)境條件下共檢測(cè)到38個(gè)與煙草赤星病抗性顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記（P≤0.01），其中標(biāo)記PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大或在不同環(huán)境條件下被重復(fù)關(guān)聯(lián)到，分別位于6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、19號(hào)、3號(hào)和23號(hào)煙草連鎖群上。關(guān)聯(lián)到的分子標(biāo)記可以用于煙草抗赤星病育種的輔助選擇。

煙草；赤星病；SSR；關(guān)聯(lián)分析

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草赤星病是由鏈格孢菌[Alter aria alternata(Fries)Keissler]引起的煙葉成熟期病害，赤星病的發(fā)生可影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，造成經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。培育抗赤星病煙草品種是防治赤星病的重要有效方法。

Dobhal等[4]研究發(fā)現(xiàn)煙草對(duì)赤星病抗性為部分顯性，受多基因控制。郭永峰等[5]研究表明煙草赤星病抗病基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)同時(shí)存在，以加性效應(yīng)為主。蔣彩虹等[6]研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與抗赤星病基因連鎖的SSR標(biāo)記連鎖群，位于M號(hào)連鎖群上，該連鎖群包括12個(gè)SSR標(biāo)記，全長(zhǎng)181.5 cM，平均間距15.1 cM。Tong等[7]配制凈葉黃和長(zhǎng)脖黃雜交組合，利用SSR標(biāo)記對(duì)F2群體進(jìn)行抗性QTL分析，定位到3個(gè)連鎖群，分別位于2號(hào)、3號(hào)和5號(hào)連鎖群上。目前煙草抗赤星病QTL研究不多[8]，與赤星病抗性相關(guān)的標(biāo)記數(shù)目較少且定位到的抗性連鎖群不一致。Bindler等[9]發(fā)表一張煙草高密度遺傳連鎖圖譜，其SSR引物覆蓋煙草全基因組24個(gè)連鎖群，可以充分發(fā)掘與赤星病抗性相關(guān)的標(biāo)記。

目前有關(guān)煙草重要性狀關(guān)聯(lián)分析的報(bào)道主要集中在株高、葉數(shù)等基本農(nóng)藝性狀上[10]。煙草赤星病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析尚未見報(bào)道。本研究利用生產(chǎn)上常用的 96份烤煙種質(zhì)組成的自然群體和SSR分子標(biāo)記，對(duì)煙草赤星病抗性進(jìn)行標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析，篩選與抗性顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點(diǎn)，為開展煙草赤星病抗性分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

中國(guó)煙草種質(zhì)資源庫(kù)提供供試群體材料，供試群體由表型變異豐富、遺傳多樣性較高的 96份烤煙種質(zhì)組成，包括35份國(guó)外引進(jìn)種質(zhì)和61份國(guó)內(nèi)種質(zhì)（表1）。

2015年2月，供試材料分別種植于諸城試驗(yàn)基地的自然病圃（T1環(huán)境）和即墨試驗(yàn)基地的自然病圃（T2環(huán)境）。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，株距0.5 m，行距1.2 m，每個(gè)材料種植1行，每行10棵，重復(fù)2次。

1.2 赤星病病情調(diào)查

煙苗移栽大田后60 d左右，調(diào)查供試材料的赤星病發(fā)病情況。根據(jù)葉片赤星病病斑的有無(wú)和大小，劃分0級(jí)、1級(jí)、3級(jí)、5級(jí)、7級(jí)和9級(jí)。依據(jù)病級(jí)計(jì)算病情指數(shù)（the disease index，DI），DI =100×Σ(病級(jí)×該病級(jí)株數(shù))/(總株數(shù)×最高病級(jí))。

1.3 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

在煙草旺長(zhǎng)期，從同一品種株系中選取5株典型植株，混合取嫩葉，提取DNA。依據(jù)Bindler 2011年公布的煙草全基因組高密度遺傳連鎖圖譜篩選出404對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物，404對(duì)引物覆蓋煙草全基因組24個(gè)連鎖群，對(duì)供試群體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72℃ 10 min。利用 8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。參照任民等改進(jìn)的銀染方法進(jìn)行顯影[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用 Microsoft Excel 97—2003 統(tǒng)計(jì)供試群體赤星病病情指數(shù)（DI）；采用軟件Structure 2.3.4[12]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析：K值設(shè)為1～7，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）開始時(shí)不作數(shù)迭代（length of bum-in Period）設(shè)為100000，Number of MCMC Peps after burn-in設(shè)為100000，△K取最大值時(shí)，確定類群數(shù)目；應(yīng)用軟件Tassel 2.1的混合線性模型（MLM，Mixed Linear Model)[13]，代入群體結(jié)構(gòu)的Q值、表型數(shù)據(jù)和SSR標(biāo)記分型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

表1 96份種質(zhì)材料Table 1 96 tobacco germplsms

2 結(jié) 果

2.1 供試群體病情指數(shù)分析

兩種環(huán)境下供試群體的病情指數(shù)見圖1。T1環(huán)境中，供試材料的病情指數(shù)相對(duì)集中，主要分布在50～75；T2環(huán)境中，供試材料的病情指數(shù)主要分布在 50～62.5。兩種環(huán)境下群體病情指數(shù)的相關(guān)性r=0.60，說(shuō)明兩個(gè)群體的病情指數(shù)存在中度相關(guān)。對(duì)供試群體的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，T1環(huán)境下偏度系數(shù)Skewness=0.144，峰度系數(shù)Kurtosis=-0.327，兩個(gè)系數(shù)均小于 1，可認(rèn)為其頻率符合正態(tài)分布；T2環(huán)境下，偏度系數(shù)Skewness=-0.544，峰度系數(shù)Kurtosis=-0.161，兩個(gè)系數(shù)均小于1，其頻率同樣符合正態(tài)分布。

圖1 T1和T2環(huán)境下供試群體病情指數(shù)的分布Fig. 1 The distribution of disease index of 96 tobacco germplsms in T1 and T2

分析供試群體的病情指數(shù)可以發(fā)現(xiàn) NC82、C151、革新5號(hào)等14份種質(zhì)材料在兩個(gè)環(huán)境下都表現(xiàn)為高度感?。籘1環(huán)境下，單育二號(hào)表現(xiàn)為高度抗病，凈葉黃、潘圓黃等21份種質(zhì)表現(xiàn)為抗??；T2環(huán)境下，單育二號(hào)、凈葉黃、潘圓黃等13份種質(zhì)表現(xiàn)為高度抗病，RG17、9201等11份種質(zhì)表現(xiàn)為抗??；兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)對(duì)赤星病免疫的種質(zhì)材料。

2.2 供試群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

供試群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖2，當(dāng)K=3時(shí)，△K取得最大值，即表明供試群體可分為3個(gè)亞群，與供試群體的系譜來(lái)源基本一致。

圖2 △K的變化Fig. 2 Magnitude of ΔKas a function of K

2.3 SSR標(biāo)記-表型性狀關(guān)聯(lián)分析

404對(duì)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記和群體病情指數(shù)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。在顯著水平（P≤0.01）下，T1環(huán)境中共關(guān)聯(lián)到29個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，分布在13個(gè)連鎖群上；T2環(huán)境中關(guān)聯(lián)到13個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，分布在9個(gè)連鎖群上。其中PT60236、PT50668、PT50176、PT53770在T1和T2環(huán)境下均被關(guān)聯(lián)到。

在極顯著水平（P≤0.001）下，T1環(huán)境中關(guān)聯(lián)到10個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，分布在3號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、16號(hào)、17號(hào)、19號(hào)、23號(hào)、24號(hào)連鎖群上；T2環(huán)境中關(guān)聯(lián)到3個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，分布在9號(hào)、17號(hào)、19號(hào)連鎖群上。其中PT53770位點(diǎn)在兩個(gè)環(huán)境下都被關(guān)聯(lián)到，位于19號(hào)連鎖群上。

綜合兩種環(huán)境下的關(guān)聯(lián)結(jié)果：PT60236、PT50668、PT50176、PT53770被重復(fù)關(guān)聯(lián)到，分別位于6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和19號(hào)連鎖群（圖3）上；PT60080和PT50727只在T1環(huán)境下被關(guān)聯(lián)到，兩個(gè)標(biāo)記的P值分別為1.6923×10-5和1.6945×10-5，關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大，分別位于3號(hào)和23號(hào)連鎖群（圖3）。這些被重復(fù)關(guān)聯(lián)到或關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大的位點(diǎn)，可用于煙草赤星病抗性標(biāo)記輔助選擇育種。

表2 T1和T2環(huán)境下性狀-標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析Table 2 The results of association analysis between disease indexes and SSR markers in T1 and T2

3 討 論

煙草赤星病是煙葉生產(chǎn)的主要真菌性病害，對(duì)煙葉生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，培育抗性品種是最有效的措施之一。在本研究比較了 96份生產(chǎn)上常用的烤煙品種（系）在不同環(huán)境條件下的赤星病抗性表現(xiàn)，得到以下幾個(gè)結(jié)論：第一，不同烤煙品種間赤星病抗性存在很大的遺傳變異，病情指數(shù)從1.23到100，平均 61.47，兩個(gè)環(huán)境下的病情指數(shù)均符合正態(tài)分布，表明煙草對(duì)赤星病抗性屬于數(shù)量性狀，受多基因控制，易受環(huán)境影響。第二，在連續(xù)兩個(gè)環(huán)境條件下，凈葉黃、單育二號(hào)、潘園黃等材料的赤星病抗性都鑒定為抗病，而這幾個(gè)材料都具有明顯的系譜關(guān)系，這說(shuō)明在煙草種質(zhì)中存在控制赤星病抗性的主效QTL。定位赤星病抗性基因所在染色體位置，發(fā)掘與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)開展煙草赤星病抗性改良工作具有可行性和重要性。

圖3 PT60080、PT60236、PT50668、PT50176、PT53770和PT50727在連鎖群上的分布Fig. 3 The distribution of PT60080, PT60236, PT50668, PT50176, PT53770 and PT50727 in linkage groups

目前數(shù)量性狀定位研究主要采用的方法為連鎖分析方法和關(guān)聯(lián)分析方法。連鎖分析以親本雜交后代的分離群體為研究對(duì)象，所以研究局限于兩個(gè)親本的遺傳背景，且配制分離群體的過程中需要多次的自交和雜交，研究周期較長(zhǎng)。而關(guān)聯(lián)分析方法可利用自然群體，具有節(jié)約群體構(gòu)建所需時(shí)間和檢測(cè)相同位點(diǎn)上的多個(gè)不同等位基因變異等優(yōu)勢(shì)，已在各種主要作物上廣泛應(yīng)用[14-16]。由于普通煙草屬于異源四倍體，基因組約4.5 Gb，可用的分子標(biāo)記較少。煙草重要性狀定位研究主要集中在連鎖分析上，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究在煙草上剛剛起步，煙草赤星病抗性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析還未見報(bào)道。本研究利用關(guān)聯(lián)分析的方法，在不同環(huán)境條件下發(fā)掘與赤星病抗性相關(guān)的位點(diǎn)。在兩個(gè)環(huán)境下對(duì)病情進(jìn)行鑒定，共關(guān)聯(lián)到38個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，分布于14個(gè)連鎖群；得到6個(gè)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大或被重復(fù)關(guān)聯(lián)到的SSR標(biāo)記PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727，分別位于6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、19號(hào)、3號(hào)和23號(hào)連鎖群。與前人研究相比，本研究篩選到的標(biāo)記數(shù)目更多，且定位的連鎖群與已報(bào)道的研究結(jié)果存在部分重合。蔣彩虹等[17]利用連鎖分析的方法篩選到一個(gè)與抗赤星病基因連鎖的SSR標(biāo)記J9，位于M號(hào)（即23號(hào)）連鎖群。本研究利用關(guān)聯(lián)分析的方法在23號(hào)連鎖群J9附近定位到一個(gè)與抗性位點(diǎn)極顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記（PT50727），說(shuō)明在煙草23號(hào)連鎖群80cM附近存在一個(gè)控制赤星病抗性的穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL。

發(fā)掘控制赤星病抗性的主效位點(diǎn)，是進(jìn)一步開展功能基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇的前提條件。本研究關(guān)聯(lián)到了位于23號(hào)連鎖群上的主效QTL，該優(yōu)異等位基因存在于凈葉黃和與凈葉黃有明確系譜關(guān)系的單育二號(hào)、潘園黃等材料中，表明該主效 QTL在煙草赤星病抗性中起到了重要作用。在本研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展該主效 QTL的精細(xì)定位、克隆及分子標(biāo)記位點(diǎn)開發(fā)，對(duì)于闡明煙草與赤星病菌間的互作機(jī)制和赤星病抗性分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。

4 結(jié) 論

利用404對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物對(duì)96份自然群體種質(zhì)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析和標(biāo)記-表型性狀的關(guān)聯(lián)分析，標(biāo)記位點(diǎn) PT60236、PT50668、PT50176、PT53770、PT60080和PT50727關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大或被重復(fù)關(guān)聯(lián)到，這些標(biāo)記分別位于 6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、19號(hào)、3號(hào)和23號(hào)連鎖群。

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Identification of Molecular Markers for Tobacco Brown Spot Resistant Genes through Association Analysis

ZHU Chengguang, REN Min, JIANG Caihong, ZHANG Yusheng, SUN Mingming, LIU Dan, CHENG Lirui, YANG Aiguo, WANG Yuanying*
(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China)

In order to screen for SSR markers associated with tobacco brown spot resistant genes and to provide useful information for breeders, 404 SSR markers were used to scan polymorphism among a population containing 96 tobacco germplasms in this study. Population structure was analyzed and association analysis between disease index and SSR markers were performed using TASSEL 2.1. 38 SSR markers were identified as being associated with resistant genes at the level of P≤0.01. The results also indicated that PT60236, PT50668, PT50176, PT53770, PT60080 and PT50727 were tightly associated with resistant genes. These SSR markers were located in the 6th, 8th, 9th, 19th, 3th, 23th tobacco linkage group respectively. The markers identified in this study are useful in molecular marker assisted selection in tobacco breeding programs for brown spot resistance.

tobacco; tobacco brown spot; SSR; association analysis

S435.72

1007-5119（2017）01-0068-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.012

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC01）；中國(guó)煙草總公司煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng)“煙草重要性狀基因發(fā)掘及功能標(biāo)記開發(fā)”（110201301008）、“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標(biāo)記開發(fā)及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009）

朱承廣（1990-），男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)闊煵菘共∮N。E-mail：zhuchengguang@yeah.net *通信作者，E-mail：wangyuanying@caas.cn

2016-10-27

2016-11-14