（1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草抗PVY的EMS突變體pvyr1篩選與抗性遺傳初步分析

劉勇1，黃昌軍1，宋中邦1，李文正1，于海芹1，劉貫山2

（1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家煙草基因工程研究中心，昆明 650021；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

為了從煙草EMS突變體庫中篩選抗馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）突變體，采用苗期人工接種初篩M2抗病單株，對M3、M4和M5株系連續(xù)接種鑒定PVY抗性。采用eIF4E1基因特異分子標(biāo)記檢測和cDNA全長測序，分析突變體PVY抗性是否與eIF4E1突變有關(guān)。配制F1群體初步分析抗性遺傳特性。苗期人工接種從1800份M2種子中篩選到1份抗PVY的烤煙突變體。冬季無加溫措施塑料大棚內(nèi)苗期人工接種PVY壞死株系MN分離物，接種后35 d未誘變對照品種發(fā)病率為100%，E9119-1Z/M3株系的發(fā)病率為56.3%，無癥狀單株ELISA檢測PVY均為陰性，表明E9119-1Z/M3株系對PVY中抗。E9119-1Z的M4株系和M5株系在光照培養(yǎng)室內(nèi)苗期人工接種對PVY壞死株系MN分離物和ZT-5分離物表現(xiàn)為中抗。E9119-1Z-R14-2/M5株系為抗性穩(wěn)定的突變體，命名為pvyr1。pvyr1采用eIF4E1基因特異分子標(biāo)記檢測為陽性，cDNA測序表明eIF4E1基因無突變。pvyr1與未誘變對照品種（感PVY）、va位點(diǎn)抗PVY品種NC55的雜交F1代抗性鑒定結(jié)果初步表明，pvyr1突變體對PVY的抗性符合孟德爾隱性遺傳，且與NC55的va位點(diǎn)不等位。表明pvyr1為一個與eIF4E1基因突變不同的抗PVY新資源。

煙草；馬鈴薯Y病毒；EMS突變體

馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是重要的植物病毒之一，廣泛分布于在世界各地，主要為害茄科（Solanaceae）作物，包括馬鈴薯、煙草、辣椒和番茄等。是世界煙草的重要病害之一，在中國北方煙區(qū)和黃淮煙區(qū)為害嚴(yán)重，曾造成大面積減產(chǎn)，目前在云南、貴州等煙區(qū)為害呈上升趨勢[1]。

甲基磺酸乙酯（Ethyl methyl sulfonate, EMS）是廣泛使用的誘變劑，具有誘變頻率高的優(yōu)點(diǎn)，主要為G/C堿基點(diǎn)突變?yōu)锳/T，EMS還可以使遺傳物質(zhì)發(fā)生糖-磷酸骨架斷裂，產(chǎn)生染色體缺失等[2]。利用 EMS誘變構(gòu)建了擬南芥和水稻等多種作物的突變體庫[3-4]。從煙草EMS突變體中篩選到低去甲基煙堿的突變體[5]。我國利用EMS創(chuàng)制了煙草突變體庫，并開展了大規(guī)模的抗病蟲害、耐低鉀等突變體篩選[6-8]。煙草抗PVY基因位點(diǎn)va，來源于Virgin A Mutant（VAM，種質(zhì)編號TI1406），VAM為 X-射線處理獲得的煙草突變體[9]。國內(nèi)外已鑒定出多個抗PVY的種質(zhì)，如VAM（TI1406）、V.SCR等，大部分PVY抗源的抗性表現(xiàn)為隱性基因位點(diǎn)（va）控制，利用va位點(diǎn)育成烤煙品種NC55和NC102等，VAM的隱性基因位點(diǎn)（va）與eIF4E1基因缺失有關(guān)[10]。煙草種質(zhì)資源中存在隱性抗PVY資源，辣椒和番茄等茄科作物中篩選到抗 PVY或同屬病毒的 EMS突變體[11-12]。因此，從我國創(chuàng)制的煙草EMS突變體庫中，有望篩選到抗PVY的突變體。篩選和鑒定新的抗PVY突變體，對豐富抗PVY資源具有重要意義。本文采用苗期人工接種抗性鑒定方法，對煙草EMS突變體庫進(jìn)行了抗PVY突變體篩選。并對獲得的一個抗性穩(wěn)定的突變體進(jìn)行了抗性遺傳特性的初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙品種中煙100，EMS處理M2種子共1800份，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供?？筆VY對照烤煙品種NC55、NC102由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院保存。

1.2 病毒株系、接種方法與ELISA檢測

PVY壞死株系ZT-5分離物、PVY-MN分離物由云南省煙草農(nóng)業(yè)研究院保存。ZT-5分離物為云南省煙草流行株系。在接種前30 d左右在白肋煙或枯斑三生煙（N.tobacumvar Samsun NN）上繁殖備用。待接種時用免疫檢測試紙條檢測驗(yàn)證毒源繁殖成功且未被TMV、CMV等其他病毒污染。摩擦接種方法：采集經(jīng)免疫檢測試紙檢測為 PVY的新鮮病葉，用PVY接種緩沖液（0.01 mol/L pH 7.0 磷酸鹽緩沖液＋0.4% 亞硫酸鈉）研磨，雙層40目尼龍網(wǎng)過濾。接種濃度為1:40或1:100（重量體積比）。接種前在病毒汁液中加入1% 200目化學(xué)純二氧化硅，高壓噴槍噴射壓力為98 kPa。噴口距接種物20 cm，每株噴射接種時間約為0.5 s。接種后立即用噴壺噴少量自來水，提高接種效率。PVY的ELISA檢測采用Agdia公司試劑盒[13]。

1.3 M2無癥狀單株篩選

2012年 4月至6月在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)院研和實(shí)驗(yàn)基地塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。采用32孔盤，按常規(guī)方法漂浮育苗。煙苗5～6片葉時，剪葉1次使煙苗大小較為整齊。在育苗池內(nèi)接種 PVY壞死株系MN分離物，接種后每7 d左右調(diào)查發(fā)病情況，第 3次調(diào)查時拔除發(fā)病株，挑選無癥狀單株移栽。在現(xiàn)蕾、開花和收種時，分別淘汰表現(xiàn)癥狀株，最后無癥狀單株收種，獲得M3種子。

1.4 M3抗病株系篩選與組合配制

2013年冬季在研和實(shí)驗(yàn)基地塑料大棚內(nèi)進(jìn)行。記錄試驗(yàn)期間當(dāng)?shù)靥鞖忸A(yù)報的每天最低氣溫和最高氣溫，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)期間的日平均最低氣溫和日平均最高氣溫。中選M3株系，按常規(guī)方法漂浮育苗，5～6片葉時，每個株系盆栽64株。成活后接種PVY壞死株系MN分離物，接種后7、14和21 d調(diào)查發(fā)病情況，對無癥狀的株系，挑選單株移栽，并一直持續(xù)觀察至開花。挑選長勢較好且杈枝幼葉ELISA檢測為PVY陰性的單株，自交留種。挑選M3單株，取花粉分別與感PVY的中煙100、抗PVY的NC55配制F1組合。

1.5 抗病突變材料的抗性分析

2014年6—9月和2015年4—7月在光照培養(yǎng)室分別鑒定中選的M4株系、M5株系的PVY抗性。2015年12月至2016年3月在研和基地塑料大棚鑒定F1雜交組合抗性。5～6片葉時每個株系盆栽，分別接種PVY壞死株系ZT-5分離物、PVY-MN分離物。接種后定期調(diào)查發(fā)病率。為了驗(yàn)證發(fā)病情況，挑選部分無癥狀的單株的幼嫩葉片，采用ELISA檢測PVY?？剐詣澐謽?biāo)準(zhǔn)為：發(fā)病率0～20%為高抗；發(fā)病率20.1%～40%為抗病，發(fā)病率40.1%～60%為中抗，發(fā)病率60.1%～80%為感病，發(fā)病率80.1%～100%為高感。根據(jù)發(fā)病率數(shù)據(jù)劃分的抗性數(shù)據(jù)，分析抗性遺傳特性[14-15]。

1.6eIF4E1基因特異分子標(biāo)記檢測與cDNA序列測定

pvyr1突變體葉片采用QIAGENE試劑盒提取DNA和RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)檢測eIF4E1[16]。擴(kuò)增eIF4E1基因DNA 部分序列的特異引物對為 CF2：5′-TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT-3′，GR11：5′-GAAGGCAAGATATTCAGGAGCT-3′；擴(kuò)增片段大小為446 bp，退火溫度51 ℃。擴(kuò)增eIF4E1基因cDNA全長序列的引物對為CF3：5′-TAAAATCTA TAACTAAGTACATA-3′，CR3：5′- CCATTGTAG CAAGAAAACTAT-3′，擴(kuò)增片段大小為715 bp，退火溫度48 ℃。

PCR反應(yīng)體系總體積均為20 μL，其中30～50 ng/μL DNA 樣品 2.5 μL、10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs 1.2 μL，引物各1.5 μL，rTaq DNA酶0.3 μL，ddH2O 12.6 μL。所用試劑購自寶生物公司。PCR反應(yīng)在Ependorff梯度擴(kuò)增儀上（Master Cycler）上進(jìn)行。擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30，退火溫度30，72 ℃延伸1 min，共28個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。cDNA采用PCR產(chǎn)物直接測序，采用MEGA6比對序列。

2 結(jié) 果

2.1 無癥狀M2單株獲得

2012年4月至6月在防蟲塑料大棚內(nèi)，共鑒定1800份M2株系，每份M2挑選16株假植在32孔苗盤中。4～5片葉時高壓噴槍接種 PVY壞死株系MN分離物病葉汁液40倍稀釋液。接種后14 d和接種后28 d分別拔除發(fā)病株。挑選300株無癥狀單株塑料大棚內(nèi)移栽。移栽后繼續(xù)淘汰發(fā)病株，最終挑選無癥狀且 ELISA檢測陰性的單株套袋，獲得216份M3種子。其中M2株系E9119苗期葉片形狀存在分離，將苗期葉片畸形單株收獲的M3種子編號為E9119-1Z、將苗期葉片正常單株收獲的M3種子的編號為E9119-1。

2.2 M3抗病株系篩選

對M3株系的苗期接種抗性鑒定表明，E9119-1Z冬季低溫下對PVY壞死株系MN分離物表現(xiàn)出較好抗性，接種后35 d的發(fā)病率為56.3%。接種后28 d無癥狀單株ELISA檢測均為PVY陰性。感病的E1020株系和對照中煙100接種后14 d發(fā)病率達(dá)到100%（表1，圖1）。挑選接種后35 d無癥狀的單株移栽，對收種時無癥狀的單株自交留種獲得M4株系。

表1 M3株系冬季塑料大棚內(nèi)對PVY分離物MN的抗病性Table 1 The M3 lines resistant to PVY isolate MN in plastic tunnel in winter

圖1 M3株系的PVY抗性鑒定Fig. 1 The PVY resistance evaluation of M3 lines

2.3 抗病M4突變材料的抗性驗(yàn)證

光照培養(yǎng)室苗期接種后14和23 d癥狀調(diào)查結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果表明（表2），E9119-1Z-R14和E9119-1Z-R5 M4株系對PVY壞死株系MN分離物或ZT-5分離物中抗。E9119-1Z-R5 M4株系接種后23 d的無癥狀單株，ELISA檢測驗(yàn)證部分單株為PVY陰性?？筂N的單株移栽后，現(xiàn)蕾時無癥狀單株自交留種，獲得E9119-1Z-R14-1，E9119-1ZR14-2等M5株系。

2.4 M5的抗性驗(yàn)證與抗性遺傳特性初步分析

光照培養(yǎng)室苗期接種后 21 d癥狀調(diào)查結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果表明，E9119-1Z-R14-2 M5株系中抗 PVY ZT-5分離物、抗性低于 NC102（表3）。E9119-1Z-R14的M3姊妹單株R8與攜帶va位點(diǎn)抗PVY的種質(zhì)NC55的雜交1代（F1）表現(xiàn)為高感，表明E9119-1Z-R8的抗性基因與va位點(diǎn)不等位（表3）。E9119-1Z-R14的M3姊妹單株R2與高感PVY的品種云煙87的雜交1代（F1）表現(xiàn)為高感，表明E9119-1Z-R2的抗性為隱性遺傳。

為了驗(yàn)證E9119-1Z-R14-2/M5株系對應(yīng)的M3單株 E9119-1Z-R14的抗性，重新配制該單株與抗感品種的F1組合，并鑒定PVY抗性。2015年12月冬季低溫下（試驗(yàn)期間天氣預(yù)報日平均最低氣溫5.4 ℃，日平均最高氣溫16.7 ℃）苗期接種后14、21、28 d癥狀調(diào)查結(jié)果表明，E9119-1Z/M3單株R14與感PVY的品種中煙100的雜交1代（F1）表現(xiàn)為高感，表明其抗性為隱性遺傳（表 4）。E9119-1Z/M3單株R14與攜帶va位點(diǎn)抗PVY的種質(zhì)NC55的雜交 1代（F1）表現(xiàn)為中抗，在低溫下 E9119-1Z/M3單株R14與NC55的雜交1代（F1）的抗性明顯低于NC55，表明其抗性基因與va位點(diǎn)不等位。將E9119-1Z-R14-2/M5突變體命名為pvyr1。

表2 M4株系對PVY分離物MN和ZT-5的抗病性Table 2 The M4 lines resistant to PVY isolate ZT-5

表3 M5株系對PVY分離物ZT-5的抗病性Table 3 The M5 lines resistant to PVY isolate ZT-5

表4 冬季低溫下pvyr1與出發(fā)材料和va抗病品種的F1組合抗性表現(xiàn)Table 4 The hybrid F1 of pvyr1 with WT control andvaresistant cultivar

2.5eIF4E1基因特異分子標(biāo)記檢測與cDNA序列測定

采用eIF4E1基因的特異分子標(biāo)記CF2GR11檢測pvyr1是否缺失eIF4E1基因。cDNA擴(kuò)增測序分析pvyr1的eIF4E1編碼序列是否存在突變。結(jié)果表明，pvyr1和誘變出發(fā)材料中煙 100都能擴(kuò)增出CF2GR11的特異條帶（圖2）。pvyr1和誘變出發(fā)材料中煙100的cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列一致率為100%（未列出數(shù)據(jù)）。表明pvyr1的PVY抗性與eIF4E1基因缺失或者編碼區(qū)域的突變無關(guān)。

圖2 eIF4E1基因的特異分子標(biāo)記CF2GR11檢測Fig. 2 The test ofeIF4E1gene specific marker CF2GR11

3 討 論

3.1 抗PVY突變體篩選與鑒定

在中煙100的M2突變體庫中篩選抗PVY單株，M2苗期接種PVY后7 d開始發(fā)病，一直到收種時，不斷有單株表現(xiàn)PVY癥狀。本文從約1800份M2中挑選出接種后28 d無PVY癥狀單株移栽，收種時再挑選杈枝葉片無PVY癥狀的單株收種。最終獲得216份M3種子。對216份M3的苗期接種后28 d調(diào)查，有17個M3株系的PVY無癥狀株數(shù)為4株以上（接種18株），多數(shù)M3株系PVY無癥狀株數(shù)為0（未列出數(shù)據(jù)）。表明M2中有較多的不能遺傳的抗PVY單株。

PVY存在普通株系（PVYO）、壞死株系（PVYN）和重組株系（PVYN:O），我國煙草上的主要株系為壞死株系。其中攜帶va位點(diǎn)的煙草抗源如NC55，對PVY壞死株系ZT-5分離物的抗性高[16]。本文先接種PVY壞死株系MN分離物篩選無癥狀的M2單株，再接種ZT-5分離物驗(yàn)證M3的抗性，分別接種MN分離物和ZT-5分離物再次驗(yàn)證的M4和M5的抗病性。最終獲得中抗PVY壞死株系的EMS突變體，命名為pvyr1。名稱中的“r”取抗病英文resistance首字母。

3.2 pvyr1的抗性遺傳特性

pvyr1與抗感PVY的煙草雜交F1代的抗性鑒定結(jié)果初步表明，pvyr1突變體對PVY的抗性為隱性遺傳，且與NC55的va位點(diǎn)不等位。采用eIF4E1基因的分子標(biāo)記檢測與序列測定表明，pvyr1突變體與eIF4E1的編碼序列突變或缺失無關(guān)。表明pvyr1為一個不同于eIF4E1基因缺失或突變的新抗PVY抗源，在煙草抗病育種和抗PVY機(jī)理研究上具有較大價值。pvyr1的抗性位點(diǎn)與育種利用價值，有待深入研究。

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Identification and Genetic Analysis of Tobacco PVY-resistant EMS Mutant pvyr1

LIU Yong1, HUANG Changjun1, SONG Zhongbang1, LI Wengzheng1, YU Haiqin1, LIU Guanshan2
(1. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding, National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China; 2. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China)

In order to screen forPotato virus Y(PVY) resistant mutant of tobacco among EMS mutant library, seedling inoculation was used to screen for M2 PVY-resistant plants, and continuous inoculation was conducted to identify M3, and M4 and M5 lines with resistance to PVY. TheeIF4E1molecular marker test and full length cDNA sequencing were applied to analyze whether the PVY-resistant mutations were associated with theeIF4E1mutation or not. F1 populations were used for preliminary analysis of the genetic characteristics of the resistance. After artificial inoculation of 1800 M2 lines at the seedling stage, a flue-cured tobacco mutant resistant to PVY necrotic strains was obtained. Seedlings were inoculated with PVY MN isolates and PVY ZT-5 isolates. After 35 days post inoculated (dpi), the disease incidence of E9119-1Z M3 line was 56.3% while that of the WT control was 100%. The symptomless M3 plantlets were PVY negative when tested by ELISA. These primary results indicated that the E9119-1Z /M3 line had medium resistance to PVY. In the green house inoculation test the M4 and M5 lines descendent of E9119-1Z showed stable medium resistance to PVY necrotic strains MN isolate and ZT-5 isolate. The E9119-1Z-R14/M5 was named pvyr1. Analysis of pvyr1 hybrid F1 with WT control and with thevalocus PVY-resistant NC55 line showed that the PVY resistance ofpvyr1was in accord with Mendelian model of recessive gene and is not allelic to the NC55valocus. TheeIF4E1gene specific molecular markers tests and cDNA sequencing results indicated that the pvyr1 mutation is not related to theeIF4E1mutation. Mutant pvyr1 can be used as a new PVY-resistant tobacco germplasm.

tobacco; Potato virus Y; EMS mutant

S435.72

1007-5119（2017）01-0059-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.010

中國煙草總公司科技項(xiàng)目“煙草高香氣、抗青枯病、抗TMV突變體鑒定及中煙100、翠碧一號品種定向改良”（110201301005）；中國煙草總公司云南省公司科技項(xiàng)目“煙草PVY抗性基因的研究與應(yīng)用”（2012YN02）

劉 勇（1970-），男，博士，副研究員，主要從事煙草抗病基因資源挖掘與抗病育種研究。E-mail：yliu@yntsti.com

2016-04-12

2016-08-10