*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；3.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

酶調(diào)節(jié)劑對煙草氮代謝及其化學(xué)成分的影響

李亞飛1，常棟2，孫軍偉3，楊惠娟1，王景1，史宏志1*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467002；3.云南省煙草公司大理州公司，云南 大理 671000）

為調(diào)控旺長期煙株氮代謝活動，解決大理地區(qū)煙葉成熟度差的問題，分別在旺長期和成熟期研究了不同酶調(diào)節(jié)劑對煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性及煙葉化學(xué)成分的影響。結(jié)果顯示，在旺長期噴施鉬酸銨7 d后，中部葉和上部葉NR活性分別提高了6.56%和17.57%，GS活性分別提高了22.17%和15.24%，蛋白質(zhì)含量升高了6.00%和5.02%，氮代謝明顯增強(qiáng)；在成熟期對生長過旺煙株噴施鎢酸鈉和草丁膦4 d后，煙葉氮代謝活動減弱，上部葉NR活性分別下降了8.55%和18.55%，GS活性分別下降了5.33%和11.58%%，煙葉總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量均下降，糖堿比增大，對解決煙葉成熟度差和提高煙葉可用性有利。就調(diào)控?zé)熑~氮代謝效果和烤后煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性而言，以旺長期噴施鉬酸銨和成熟期噴施草丁膦最佳。

煙草；酶調(diào)節(jié)劑；氮代謝；化學(xué)成分

硝酸還原酶（NR）是氮素還原利用限速酶，谷氨酰胺合成酶是氮素同化利用關(guān)鍵酶，它們活性大小對煙草氮代謝均有重要影響[1]。鉬是硝酸還原酶的重要組成成分，對煙株氮代謝具有重要作用[2-3]。張繼利等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，噴施鉬肥有利于提高中上等煙比例和增加煙葉產(chǎn)質(zhì)量。鎢與鉬屬于同族元素，存在競爭關(guān)系，對NR活性具有抑制作用[5]。楊榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol/L鎢酸鈉抑制油菜根系NR活性效果最佳，會引起氮素吸收速率下降。草丁膦（PPT），又名草銨膦，在生產(chǎn)中可作為一種非選擇性觸殺除草劑[6]，作用原理是其能夠使谷氨酰胺合成酶（GS）空間構(gòu)型發(fā)生變化[7]，抑制其活性而降低氮代謝活動[8-10]。許東亞[11]通過研究不同草丁膦濃度對煙草成熟期氮代謝和煙葉質(zhì)量的影響，得出以10 mg/L效果最佳，但未涉及其作用過程。

云南大理是煙葉生產(chǎn)的重要產(chǎn)區(qū)，普遍存在土壤黏性相對較重[12]，氮素供應(yīng)滯后，且大田中后期氣溫偏低，易出現(xiàn)成熟度差，煙葉總氮、煙堿含量高和刺激性過強(qiáng)等問題[13-16]。煙農(nóng)片面追求產(chǎn)量，在煙田大量施用化肥，導(dǎo)致此類現(xiàn)象加劇。本試驗(yàn)通過在旺長期對正常生長煙株和在成熟期對生長過旺煙株分別噴施酶調(diào)節(jié)劑，研究對煙株氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響過程以及對煙葉主要化學(xué)成分的影響，旨在解釋不同酶調(diào)節(jié)劑對煙葉氮代謝活動和煙葉成熟落黃的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2014年5—9月在云南省大理州彌渡縣紅花大金元基地進(jìn)行。供試品種：紅花大金元。

旺長期試驗(yàn)在團(tuán)棵后10 d（移栽后40 d）進(jìn)行，對正常生長煙株噴施不同化學(xué)試劑，按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)置4個處理，分別為①0.5%鉬酸銨，質(zhì)量分?jǐn)?shù)；②0.4%鎢酸鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)；③有效成分：10 mg/L草丁膦，體積分?jǐn)?shù)；④對照CK，噴施清水。酶調(diào)節(jié)劑使用以均勻噴灑整株葉片和無滴水為準(zhǔn)，75 L/666.7 m2。每個處理200株，3次重復(fù)，每小區(qū)兩側(cè)各 1行為保護(hù)行。試驗(yàn)田土壤類型為水稻土，無前作，試驗(yàn)前2年內(nèi)無施用鉬肥和草丁膦，土壤養(yǎng)分堿解氮211.31 mg/kg，速效磷33.81 mg/kg，速效鉀125.39 mg/kg，有機(jī)質(zhì)39.56 g/kg，pH 6.34。氮代謝酶活性測定時間：在噴施當(dāng)天、噴后2、7和14 d分別取各處理上部葉（倒4葉位，有效葉數(shù)18片/株）和中部葉（倒9葉位，有效葉數(shù)18片/株）新鮮樣品，用于煙葉NR活性、GS活性和蛋白質(zhì)含量測定。

成熟期試驗(yàn)在打頂后10 d進(jìn)行。試驗(yàn)田選擇在煙株長勢整齊，中上部葉葉色濃綠，整株葉片未表現(xiàn)出成熟落黃跡象，且已在中心花開放時進(jìn)行打頂?shù)牡貕K進(jìn)行。試驗(yàn)處理和酶調(diào)節(jié)劑使用方法同上，每個處理200株，3次重復(fù)。氮代謝酶活性測定時間：在噴施當(dāng)天，噴后4 d和10 d取各處理倒4葉位（有效葉數(shù)18片/株）新鮮樣品，用于煙葉NR活性、GS活性和蛋白質(zhì)含量測定。

鉬酸銨和鎢酸鈉均為化學(xué)分析純藥品；草丁膦，濃度200 mg/L，由德國拜爾作物科技公司生產(chǎn)，噴施時與0.5‰ SilWet-77表面活性劑配施。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 煙葉氮代謝NR、GS活性 煙葉NR活性采用活體法測定[17]。煙葉GS活性采用D O′ Neal[18]等方法測定。

1.2.2 煙葉蛋白質(zhì)含量 煙葉蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[17]測定。

1.2.3 煙葉化學(xué)成分測定 每個處理按照國標(biāo)（GB2635—92）選取烤后煙葉C3F和B2F 1 kg，在烘箱45 ℃下烘干，磨碎后過60目篩子備用?？偟⒖偺?、還原糖、煙堿按照YC/T159～162—2002煙草及煙草制品化學(xué)成分連續(xù)流動法測定。所用儀器為德國BRAN+LUEBBE公司制造的AA3型流動分析儀。標(biāo)準(zhǔn)煙樣由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel和Origin 9.0軟件制作圖表，SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對煙葉NR活性的影響

噴施鉬酸銨后，煙葉硝酸還原酶活性持續(xù)升高，而噴施鎢酸鈉和草丁膦，煙葉硝酸還原酶活性均下降（圖1、2）。在旺長期，噴施當(dāng)天上部葉和中部葉硝酸還原酶活性分別為101.22和120.68 μg/(g·h)，噴施鉬酸銨 2、7和 14 d后，上部葉分別升高了3.20%、17.57%和19.30%，中部葉分別升高了8.25%、6.56%和4.95%；噴施鎢酸鈉和草丁膦2、7和14 d后，上部葉分別下降了18.11%、12.15%，39.29%、30.01%和 33.58%、31.79%，中部葉分別下降了12.83%、9.98%，30.28%、19.01%和31.18%、23.33%。在成熟期噴施鉬酸銨4和10 d后，上部葉硝酸還原酶活性分別升高了8.79%和23.07%，而噴施鎢酸鈉和草丁膦4和10 d后，上部葉硝酸還原酶活性分別下降了8.55%、18.53%和15.56%、18.03%。

圖1 不同處理對煙葉NR活性的影響（a上部葉，b中部葉，旺長期噴施）Fig. 1 Effects of different treatments on nitrogen reductase activities in tobacco(a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

圖2 不同處理對煙葉NR活性的影響（上部葉，成熟期噴施）Fig. 2 Effects of different treatments on nitrogen reductase activities of upper leaves(spraying in mature period)

2.2 不同處理對煙葉GS活性的影響

噴施鉬酸銨后，葉片谷氨酰胺合成酶活性升高，而噴施鎢酸鈉和草丁膦后則出現(xiàn)下降變化，與硝酸還原酶活性變化規(guī)律一致（圖3、4）。在旺長期噴施當(dāng)天，上部葉和中部葉谷氨酰胺合成酶活性分別為0.173和0.170 μmol/(mg·h)；噴施鉬酸銨2、7和14 d后，上部葉和中部葉分別升高了6.26%、15.24%、12.51%和14.10%、22.17%、20.48 %；而噴施鎢酸鈉和草丁膦 2、7和 14 d后，上部葉分別下降了6.39 %、22.90%，17.68 %、32.31%和20.24%、37.67%，中部葉分別下降了6.58%、13.76%，17.49%、27.88%和25.67%、33.59%。在成熟期噴施當(dāng)天，上部葉谷氨酰胺合成酶活性為0.106 μmol/(mg·h)；噴施鉬酸銨4和10 d后，葉片谷氨酰胺合成酶活性分別升高了19.28%和32.79%；噴施鎢酸鈉和草丁膦4和10 d后，葉片谷氨酰胺合成酶活性分別下降了5.33%、18.29%和18.79%、27.51%，以草丁膦處理抑制作用最佳。

圖3 不同處理對煙葉GS活性的影響（a上部葉，b中部葉，旺長期噴施）Fig. 3 Effects of different treatments on glutamine synthetase activities in tobacco(a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

圖4 不同處理對煙葉GS活性的影響（上部葉，成熟期噴施）Fig. 4 Effects of different treatments on glutamine synthetase activities of upper leaves (spraying in mature period)

2.3 不同處理對煙葉蛋白質(zhì)含量的影響

在旺長期噴施當(dāng)天，上部葉和中部葉蛋白質(zhì)含量分別為209.31和188.53 mg/g；噴施鉬酸銨后，葉片蛋白質(zhì)含量升高（圖5），而噴施鎢酸鈉和草丁膦2、7和14 d后，上部葉蛋白質(zhì)含量分別下降了2.43%、5.03%，7.25%、10.50%和9.39%、11.44%，中部葉分別下降了8.04%、8.98%，13.20%、16.34%和15.82%、17.61%。在成熟期噴施當(dāng)天，上部葉蛋白質(zhì)含量為145.07 mg/g；噴施鉬酸銨后，葉片蛋白質(zhì)含量有升高趨勢（圖6）；噴施抑制劑鎢酸鈉和草丁膦4和10 d時，葉片蛋白質(zhì)含量分別下降了5.51%、9.99%和10.74%、23.22%，以草丁膦處理抑制效果最佳。

2.4 不同處理煙葉物理特性比較

在成熟期，噴施鉬酸銨、鎢酸鈉和草丁膦后，煙葉長度增加，長寬比增大，單葉重、葉質(zhì)重和含梗率下降，但處理間差異多未達(dá)到顯著或極顯著水平（表1）。其中，不同處理間中部葉單葉重以鎢酸鈉和草丁膦處理最低，鉬酸銨處理次之，對照最高，差異達(dá)到顯著性水平；不同處理間上部葉葉質(zhì)重以草丁膦處理最低，達(dá)到顯著性差異，鉬酸銨和鎢酸鈉處理次之，對照處理最高。

圖5 不同處理對煙葉蛋白質(zhì)含量的影響（a:上部葉，b:中部葉，旺長期噴施）Fig. 5 Effects of different treatments on protein content in tobacco (a: upper leaves, b: middle leaves, spraying in fast growing period)

圖6 不同處理對煙葉蛋白質(zhì)含量的影響（上部葉，成熟期噴施）Fig. 6 Effects of different treatments on protein content of upper leaves ( spraying in mature period)

表1 不同處理煙葉物理特性比較（成熟期噴施）Table 1 Comparison of physical properties of tobacco leaves of different treatments（spraying in mature period）

2.5 不同處理煙葉主要化學(xué)成分比較

由表2可知，不同處理煙葉含氮化合物含量存在不同，部分指標(biāo)達(dá)到顯著或極顯著性差異。噴施鉬酸銨后，煙葉總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量有升高趨勢，上部葉煙堿和蛋白質(zhì)含量超出優(yōu)質(zhì)煙葉要求（煙堿1.5%～3.5%，蛋白質(zhì)8%～10%）[19]；噴施鎢酸鈉和草丁膦后，煙葉總氮、煙堿和蛋白質(zhì)均下降，含氮化合物含量以草丁膦處理最為適宜。

表2 不同處理煙葉含氮化合物含量比較Table 2 Comparison of different treatments on the nitriccompounds

由表3可知，不同處理煙葉碳水化合物含量存在不同，部分處理間差異達(dá)到顯著或極顯著水平。噴施鉬酸銨后，上部葉煙葉總糖和還原糖含量增加，兩糖比和糖堿比增大，但中部葉總糖和還原糖含量減少，糖堿比減?。粐娛╂u酸鈉后，煙葉總糖和還原糖含量均下降，但兩糖比增大；噴施草丁膦后，煙葉總糖和還原糖含量升高，糖堿比增大，化學(xué)成分協(xié)調(diào)性增強(qiáng)。

表3 不同處理煙葉碳水化合物含量比較Table 3 Comparison of different treatments on carbohydrate content in tobacco

3 討 論

在旺長期，煙株干物質(zhì)積累量占總量的 64%左右[19]，氮代謝旺盛有助于為優(yōu)質(zhì)煙葉形成提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。在旺長期噴施鉬酸銨，煙葉NR和GS活性提高，煙葉蛋白質(zhì)含量增加，推測是由于噴施鉬肥提高了NR活性，硝酸鹽還原產(chǎn)物增多，能夠?yàn)?GS/GOGAT循環(huán)反應(yīng)提供豐富的反應(yīng)底物，進(jìn)而促進(jìn)GS酶活性，蛋白質(zhì)含量升高，氮代謝增強(qiáng)，這對促進(jìn)煙葉生長發(fā)育和干物質(zhì)積累有利。

本試驗(yàn)中，鎢酸鈉對煙葉NR活性具有抑制作用，這與在水稻[20]、小白菜[21]、油菜[5]和枳[22]等作物研究結(jié)果一致。在成熟期噴施鎢酸鈉，煙葉煙堿、蛋白質(zhì)、總糖和還原糖均呈現(xiàn)下降，且糖堿比增大，對提高煙葉可用性有利。推測一方面是由于對成熟期生長過旺煙株噴施鎢酸鈉后，煙葉氮代謝減弱；另一方面鎢酸鈉又有抑制脫落酸形成的作用[23]，可能引起煙葉物質(zhì)消耗和降解轉(zhuǎn)化階段延長所致，這有待進(jìn)一步研究確定。

在生產(chǎn)中，草丁膦常作為除草劑使用，具有高效，殘留少，對環(huán)境影響小的特點(diǎn)[24]。本試驗(yàn)草丁膦使用量10 mg/L（0.01 kg/hm2）遠(yuǎn)低于生產(chǎn)上作為除草劑的用量（防除一年生雜草除草劑用量 0.40 kg/hm2，防除多年生雜草用量1.00～2.00 kg/hm2[12]），但對煙葉安全性評價有待研究。在噴施草丁膦后，煙葉NR和GS活性下降，推測是由于GS活性受到抑制后，引起NH4+積累[9]，再通過反饋調(diào)節(jié)降低NR活性；噴施草丁膦后，煙葉總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量有所降低，總糖和還原糖含量升高，糖堿比增大，煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性增強(qiáng)，對提高煙葉品質(zhì)有利。

4 結(jié) 論

旺長期噴施鉬酸銨能夠明顯提高煙葉 NR和GS活性，增強(qiáng)煙葉氮代謝，有利于優(yōu)質(zhì)煙葉形成；成熟期噴施草丁膦能夠抑制NR和GS活性，煙葉總氮、煙堿和蛋白質(zhì)含量下降，含碳化合物升高，對促進(jìn)煙葉及時成熟落黃和改善其可用性有利。因此，在旺長期噴施鉬酸銨和成熟期噴施草丁膦有利于解決成熟期煙葉成熟度差問題。

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Effect of Enzyme Modulators on Nitrogen Metabolism and Chemical Components in Tobacco

LI Yafei1, CHANG Dong2, SUN Junwei3, YANG Huijuan1, WANG Jing1, SHI Hongzhi1*
(1. National Tobacco Cultivation and Physiology and Biochemistry Research Center/Key Laboratory for Tobacco Cultivation of Tobacco Industry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Pingdingshan Branch of Henan Province Tobacco Company, Pingdingshan, Henan 467002, China; 3. Dali Branch of Yunnan Provincial Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

The field experiments of spraying different enzyme modulators were carried out to enhance nitrogen metabolism during the fast growth stage with the purpose of solving the tobacco maturity problem in Dali area. To this end, activities of the key enzymes in nitrogen metabolism and chemical components of flue-cured tobacco were measured. The results showed that spraying ammonium molybdate could increase nitrogen metabolism and the basic materials in the formation of high quality tobacco. Seven days after spraying ammonium molybdate at the rapid growth stage, nitrate reductase (NR) activity, glutamine synthetase(GS) activity and protein content increased by 6.56%, 22.17%, 6.00% and 17.57%, 15.24%, 5.02% in middle and upper leaves, respectively. After spraying sodium tungstate and glufosinate at the maturity stage, nitrogen metabolism had been weakened with nitrate reductase (NR) activity and glutamine synthetase (GS) activity decreased by 8.55%, 18.55% and 5.33%, 11.58% in middle and upper leaves, respectively. Total nitrogen content, nicotine content, protein content decreased, while reducing sugar/nicotine ratio increased. The methods of spraying ammonium molybdate during the fast growth stage and spraying glufosinate during the mature period were effective in regulating nitrogen metabolism and chemical components of tobacco.

tobacco; enzyme modulators; nitrogen metabolism; chemical components

S572.01

1007-5119（2017）01-0029-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.005

云南省煙草公司科技項(xiàng)目“提升紅大煙葉品質(zhì)的深化技術(shù)研究及應(yīng)用”（2013YN28）；煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目“煙草氮素高效吸收利用及氮代謝動態(tài)調(diào)控技術(shù)研究”（YCZP201601）

李亞飛（1985-），在讀博士研究生，主要從事煙草栽培生理生化研究。E-mail：scitech14@163.com。*通信作者，E-mail：shihongzhi88@163.com

2016-06-27

2017-01-17