（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

普通煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員鑒定及表達(dá)模式分析

任昂彥1,2，孔英珍1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

乙烯結(jié)合響應(yīng)因子（Ethylene-responsive element binding factors, ERF）家族廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境調(diào)節(jié)及激素信號(hào)應(yīng)答等過程。利用生物信息方法，鑒定普通煙草基因組ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員，并對(duì)該亞家族成員的染色體定位、理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)生、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位和組織表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，目前在普通煙草中得到 121個(gè)ERF基因，在煙草24條染色體分布位置具有不均勻性。通過構(gòu)建進(jìn)化樹，根據(jù)擬南芥ERF亞家族的分類方式將煙草ERF亞家族分為6組，同一分組成員的理化性質(zhì)及保守域呈現(xiàn)高度一致性。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，絕大部分成員定位在細(xì)胞核，少數(shù)定位在線粒體和葉綠體上。組織表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，煙草ERF基因在幼根、成熟根、離體葉和莖中表達(dá)量較高，不同分組成員之間表達(dá)存在差異。

普通煙草；ERF基因家族；生物信息；表達(dá)模式；基因家族

乙烯結(jié)合響應(yīng)因子（Ethylene-responsive element binding factors, ERF)也可稱為 EREBP（Ethylene-responsive element binding protein）是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族中最大的轉(zhuǎn)錄因子亞家族分支，是植物所特有的參與乙烯響應(yīng)途徑調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子家族，主要參與植物的逆境調(diào)節(jié)，比如干旱、低溫、蟲害等。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族因含AP2保守結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域由58～60個(gè)保守的氨基酸序列組成。2002年Sakuma等[1]根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及結(jié)構(gòu)，將擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為5個(gè)亞家族：AP2、RAV、ERF、DREB和其他。其中AP2亞家族成員蛋白序列中含有2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域；RAV亞家族含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域；ERF和DREB亞家族均只含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)域的序列結(jié)構(gòu)有所區(qū)別；除此之外有1個(gè)單獨(dú)基因獨(dú)立分為1個(gè)亞家族。擬南芥ERF亞家族的AP2保守結(jié)構(gòu)域可與GCCbox(AGCCGCC)特異性結(jié)合，并且AP2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的第14和 19位分別為丙氨酸（Ala）和天冬氨酸(Asp)[1]，而DREB亞家族相應(yīng)位置分別為纈氨酸（Val）和谷氨酸（Glu）。近年來，陸續(xù)在不同的物種鑒定出了ERF亞家族的轉(zhuǎn)錄因子，例如擬南芥[2]、水稻[3]、煙草[4]、柳樹[5]、大豆[6]、棉花[7]、馬鈴薯[8]、小麥[9]等，這些ERF轉(zhuǎn)錄因子主要參與低溫、干旱、高滲等非生物脅迫和防御病原感染等生物脅迫調(diào)節(jié)[10]。另外，ERF類轉(zhuǎn)錄因子參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也已被廣泛報(bào)道，例如大豆GmERF3可被脫落酸、水楊酸、茉莉酸和乙烯利所誘導(dǎo)[6]。

隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展和基因組測(cè)序工作的完成[11]，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超級(jí)家族已成為研究的熱點(diǎn)。在茄科植物研究中，2010年Sharma等[12]利用EST（expressed sequence tag，表達(dá)序列標(biāo)簽）數(shù)據(jù)庫鑒定出番茄有85個(gè)ERF基因，水稻有139個(gè)AP2/ERF成員[13]，在辣椒中發(fā)現(xiàn)123個(gè)成員[14]，在馬鈴薯中鑒定出155個(gè)AP2/ERF成員[8]等。目前對(duì)煙草的DREB亞家族有所報(bào)導(dǎo)[15-16]，但對(duì)ERF亞家族基因鮮有鑒定分析。

煙草作為重要的經(jīng)濟(jì)作物及模式植物，研究其ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族基因分布、保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)、染色體定位、亞細(xì)胞定位及表達(dá)模式分析等，對(duì)研究煙草的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。因此，本研究利用生物信息方法對(duì)煙草的 ERF亞家族基因進(jìn)行鑒定及基因表達(dá)分析，為研究ERF基因在煙草中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 普通煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白序列的鑒定

基于TAIR數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）報(bào)導(dǎo)的擬南芥ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族65個(gè)成員蛋白全長(zhǎng)序列，在茄科數(shù)據(jù)庫SNG（https://solgenomics. net/）和NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blastp檢索（e值：≤1e-15），獲得煙草的相似序列，去除重復(fù)，作為煙草ERF亞家族的候選序列。結(jié)合 Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.sanger.ac.uk/）[17]中AP2結(jié)構(gòu)域序列號(hào)PF00847和SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）[18]在線分析候選序列的結(jié)構(gòu)域，確保含有AP2結(jié)構(gòu)域，依據(jù)擬南芥ERF亞家族AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和結(jié)構(gòu)特征，確定煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員。

1.2 ERF轉(zhuǎn)錄因子蛋白全長(zhǎng)理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam/）對(duì)所得煙草ERF蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析[19]。利用WolF PSORT（http://www.genscript. com/wolf-psort.html）和TargetP（http://www.cbs.dtu. dk/services/TargetP/）在線工具對(duì)煙草ERF亞家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[20]。

1.3 普通煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)化分析

利用 Muscle[19]程序?qū)M南芥和普通煙草 ERF亞族的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果利用MEGA6.0[21]軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建擬南芥和普通煙草ERF亞族進(jìn)化樹，檢驗(yàn)參數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1000。

1.4 ERF亞家族蛋白全長(zhǎng)基序及多序列比對(duì)分析

利 用 MEME4.11.2（ Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation, http://meme. nbcr. net/meme/cgibin/meme.cgi)[22]在線平臺(tái)分析普通煙草ERF亞家族成員蛋白全長(zhǎng)的保守基序（Motif），最大motif檢索值定為10。

利用 ClustalW（http://www.genome.jp/tools/ clustalw/）[10]進(jìn)行多序列比對(duì)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，并利用BoxShade程序?qū)⒈葘?duì)結(jié)果可視化。

1.5 不同組織表達(dá)模式分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用R語言Bioconductor程序?qū)D(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并提取ERF亞家族轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行均一化，利用MeV本地軟件繪制熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 普通煙草ERF亞家族成員鑒定及染色體定位

利用已知擬南芥 ERF亞族蛋白全長(zhǎng)序列和保守的結(jié)構(gòu)域序列在 NCBI和 SGN數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp檢索煙草序列，結(jié)合Pfam和SMART數(shù)據(jù)庫和ERF家族序列特征，篩選出121個(gè)煙草ERF亞家族成員。

根據(jù)煙草基因組注釋信息，將獲得的煙草ERF亞家族基因定位在煙草21條染色體上（chromosome，Chr）（表1），依據(jù)染色體定位結(jié)果，對(duì)基因進(jìn)行重新編號(hào)?；蚨ㄎ唤Y(jié)果顯示，121個(gè)基因在21條染色體上呈不均勻分布，在Chr 4和Chr 6上ERF基因數(shù)目最多，Chr 8、Chr 21、Chr 23均沒有ERF亞家族的基因存在。

2.2 蛋白序列進(jìn)化樹分析及理化性質(zhì)分析

對(duì)獲得的121個(gè)煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子成員與擬南芥ERF亞家族的65個(gè)成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，根據(jù)擬南芥ERF亞家族的分類方式將煙草的ERF亞家族分為 6組（Group）（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ），每組分別包括16、9、41、20、7和28個(gè)ERF成員，根據(jù)圖1顯示，將煙草ERF亞家族的GroupⅥ分為Ⅵa和Ⅵb亞組（Subgroup），煙草ERF亞家族中每組至少含有4個(gè)擬南芥ERF同源基因。

分析煙草ERF蛋白全長(zhǎng)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，最長(zhǎng)的蛋白序列（NtERF119）由894個(gè)氨基酸組成，最短的蛋白序列（NtERF89）包含86個(gè)氨基酸，除這兩個(gè)蛋白序列外，其余蛋白序列氨基酸數(shù)目均在127～447，變化范圍較小。除NtERF119（100.23 kDa）和NtERF89（9.89 kDa）外，其余蛋白分子量變化范圍在14.56～48.34 KDa。煙草ERF亞家族121個(gè)成員的等電點(diǎn)范圍在 4.44～10.05，變化幅度較大。不同分組之間的蛋白序列長(zhǎng)度以及等電點(diǎn)呈無規(guī)律變化，其中GroupⅡ的蛋白序列氨基酸大小變化范圍較小在233～395，等電點(diǎn)NtERF51為7.75，其余成員的等電點(diǎn)在4.56～5.76，說明該組成員的蛋白含有較多的酸性氨基酸。GroupⅤ的氨基酸長(zhǎng)度變化范圍較小在297～380，等電點(diǎn)在4.44～5.22，含有較多的酸性氨基酸。

2.3 蛋白序列基序及序列特征分析

由圖2可知，煙草ERF蛋白全長(zhǎng)的保守基序（Motif）特征為：同組成員的基序組成相似。并且所有成員均含有 Motif1、Motif2和 Motif3或者M(jìn)otif1、Motif3和Motif10共同組成AP2保守結(jié)構(gòu)域。GroupⅠ和GroupⅡ成員均只含有Motif1、Motif2和Motif3組成的AP2保守結(jié)構(gòu)域；GroupⅢ是成員最多，也是保守域構(gòu)成最為復(fù)雜的一組，特有的3個(gè)Motif為：Motif5、Motif8、Motif9；GroupⅣ所特有的包括Motif4和Motif7；GroupⅤ中各成員的保守域結(jié)構(gòu)一致性較高，除了AP2保守結(jié)構(gòu)域以外還含有Motif6；SubgroupⅥa和SubgroupⅥb存在差異，SubgroupⅥb中所有成員的 N端都有一個(gè)Motif56；SubgroupⅥa中有6個(gè)成員的AP2結(jié)構(gòu)域由Motif1、Motif3和Motif10共同組成（圖2）。此外，同一分組成員的基序組成具有一致性，不同組之間基序的組成不同，這一點(diǎn)也證實(shí)了分組的可靠性。

從GroupⅠ～Ⅴ和SubgroupⅥa中隨機(jī)選取成員蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析AP2結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域均含保守較強(qiáng)的WLG元件，位于Motif1中（圖3）。且AP2結(jié)構(gòu)域由60個(gè)左右的氨基酸序列組成，其中Arg-8、Gly-11、Ile-17、Arg-18、Arg-26、Ala-39、Asp-43和Asn-57都是非常保守的氨基酸位點(diǎn)。對(duì)各成員蛋白全稱進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)6個(gè)功能未知的保守序列，其中Motif4和Motif8分別包含41和30個(gè)保守的氨基酸序列，保守性相對(duì)較高；Motif5、Motif6、Motif7和Motif9只有少數(shù)位置上氨基酸保守性較高（圖3）。

表1 普通煙草ERF家族蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Characteristic analysis of ERF proteins inNicotiana tabacum

圖1 普通煙草和擬南芥ERF家族進(jìn)化樹分析Fig. 1 A phylogenetic tree of ERF family proteins inN.tabacumandArabidopsis Thaliana

圖2 普通煙草ERF家族蛋白分組及保守基序分布分析Fig. 2 Classification and conserved motif analysis of the ERF gene family inN. tabacum

圖3 普通煙草基序序列特征分析Fig. 3 Alignment analysis of motifs inN. tabacum

2.4 組織表達(dá)模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析121個(gè)煙草ERF亞家族成員在9類候選組織表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)35個(gè)成員在9類組織中均未表達(dá)，其余 86個(gè)成員分別在不同時(shí)期不同組織中有表達(dá)（圖 4），約占整個(gè)亞家族的71%，表明多數(shù)ERF轉(zhuǎn)錄因子參與生長(zhǎng)發(fā)育的各階段。煙草ERF亞家族在候選9類組織中的表達(dá)基因數(shù)目如下：萌發(fā)的種子（播種后3 d）中表達(dá)的基因有42個(gè)，離體1 d的葉片中33個(gè)，愈傷組織中39個(gè)，幼根中42個(gè)，幼葉中40個(gè)，成熟根中49個(gè)，成熟葉中38個(gè)，花中46個(gè)，莖中46個(gè)。各成員在不同組織的表達(dá)明顯不同，具有組織特異性，表達(dá)量較高的基因主要存在于幼根、成熟根、離體葉及莖中。有15個(gè)基因在9類候選組織均有表達(dá)，分別為NtERF4、NtERF11、NtERF13、NtERF14、NtERF17、NtERF19、NtERF20、NtERF24、NtERF33、NtERF36、NtERF75、NtERF81、NtERF119、NtERF120及NtERF121，推斷這些基因可能參與各組織的發(fā)育過程。各組成員在不同組織的表達(dá)有一定的規(guī)律性，GroupⅠ的16個(gè)基因中有12個(gè)在9類組織中未見表達(dá)，約占整組的75%，NtERF38、NtERF74和NtERF115在9類候選組織中表達(dá)量較低，NtERF66在離體葉、幼根和愈傷組織中表達(dá)較高；GroupⅡ中除了NtERF51在幼葉中和NtERF65在成熟葉中無表達(dá)，其余所有基因在9類組織中都有較高的表達(dá)，說明該組基因廣泛參與煙草的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程；GroupⅥ中NtERF15、NtERF36和NtERF106在愈傷組織中表達(dá)較高。分析不同組織的基因表達(dá)情況可知，在幼根表達(dá)量高的基因大多在成熟根中表達(dá)也較高，在幼葉和成熟葉中也有相似規(guī)律，比較其相對(duì)表達(dá)量，在幼根和幼葉的表達(dá)量比在成熟根和成熟葉中稍高；離體1 d的葉片中NtERF14、NtERF24和NtERF81表達(dá)量較高，初步推斷這3個(gè)基因可能參與非生物脅迫。

圖4 ERF轉(zhuǎn)錄因子家族組織表達(dá)模式分析Fig. 4 Expression patterns of ERF family genes in different tissues

3 討 論

ERF轉(zhuǎn)錄因子也稱為 ERF反式作用因子，是一類可與其靶基因上游核苷酸序列（GCCbox）特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，并調(diào)控該基因的表達(dá)[23]。轉(zhuǎn)錄因子在植物基中占的比例較大，擬南芥中約5.9%的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及整個(gè)生命過程具有重要調(diào)控意義，因此對(duì)轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定分析一直是研究的熱點(diǎn)[24]。目前對(duì)于煙草ERF亞家族的研究，主要體現(xiàn)在對(duì)個(gè)別基因的功能上，比如，在煙草中過表達(dá)番茄JERF1可提高抗鹽和耐低溫性[25]；煙草NtERF5（本文NtERF39）參與煙草花葉病毒的抗病性[4]；NtCEF1（本文NtERF4）參與乙烯誘導(dǎo)調(diào)節(jié)植物生物及非生物脅迫[26]等。對(duì)于普通煙草中 ERF亞家族的鑒定和分析尚未有報(bào)道。

本研究鑒定出121個(gè)普通煙草基因組中的ERF轉(zhuǎn)錄因子成員，所有成員的蛋白序列均含有AP2保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域有保守的WLG元件，并且第14和19位氨基酸為較保守的丙氨酸及天冬氨酸，此結(jié)構(gòu)特征與擬南芥ERF亞家族的AP2結(jié)構(gòu)相似[1]。通過提取數(shù)據(jù)庫中煙草 ERF亞家族基因定位信息發(fā)現(xiàn)，121個(gè)ERF基因定位在21條染色體上，并且在各染色體上呈現(xiàn)不均勻分布，其中Chr4和Chr6上ERF基因最多。根據(jù)擬南芥65個(gè)與煙草121個(gè)ERF成員進(jìn)化樹結(jié)果，將煙草121個(gè)ERF家族成員分為6組，每組成員個(gè)數(shù)與擬南芥各組成員個(gè)數(shù)在數(shù)量上有一定對(duì)應(yīng)關(guān)系，并且每組中至少有4個(gè)擬南芥成員，說明植物界ERF亞家族的進(jìn)化過程可能早于擬南芥和煙草的進(jìn)化。通過對(duì)煙草ERF亞家族所有成員蛋白序列全長(zhǎng)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，除個(gè)別成員（NtERF119和NtERF89）外，其余成員蛋白序列分子量及蛋白序列的氨基酸數(shù)目變化范圍較小，等電點(diǎn)變化范圍較大。對(duì)煙草ERF家族的121個(gè)成員的保守域分析結(jié)果表明，每個(gè)成員均含有AP2結(jié)構(gòu)域，且不同分組的基序組成存在較大差異，同一分組的成員基序組成具有一致性，說明不同分組的成員可能具有不同的生物學(xué)功能。通過對(duì)煙草ERF亞家族成員在9類組織中的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，ERF家族成員在幼根、成熟根、離體葉和莖中表達(dá)量較高，具有一定的組織特異性。在幼根、成熟根及莖中表達(dá)較高，說明ERF基因可能參與煙草根和莖的生長(zhǎng)發(fā)育；在離體葉中表達(dá)較高，推測(cè)該家族基因可能參與脅迫調(diào)節(jié)。并且GroupⅡ的成員在 9類候選組織中的表達(dá)量均較高，說明該組成員可能參與煙草各階段的生長(zhǎng)發(fā)育，但具體生物學(xué)功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

研究表明，目前可鑒定出普通煙草基因組含有121個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員，該亞家族成員的序列特征與擬南芥相似，均含有保守的AP2結(jié)構(gòu)域。煙草的24條染色體上只有21條存在煙草ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因，說明ERF基因在各染色體上呈不均勻分布。利用數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)不同煙草 ERF轉(zhuǎn)錄因子在不同組織不同時(shí)期中的表達(dá)情況不同，其中在根、莖和離體葉中表達(dá)量較高。

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Genome-wide Identification and Expression Pattern Analysis of the ERF Gene Subfamily in Nicotiana tabacum

REN Angyan1,2, KONG Yingzhen1*
(1. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Ethylene-responsive element binding factors (ERF transcription factors) family is widely involved in plant development, stress resistance and hormone response. Using bioinformatics methods, we have identified 121 ERF transcription factors that are located on 24 chromosomes irregularly inNicotiana tabacum. This was followed by analyzing their chromosomal location, protein properties, phylogenetic relation, conserved domain structure, subcellular localization as well as tissue expression profile. Based on phylogenetic analysis these 121 members of the ERF family were classified into six groups, according to the classification ofArabidopsis thaliana. Genes from the same group have similar properties and the conserved domains show a high degree of conservation. The results of subcellular localization analysis indicate that most of the genes are located in the nucleus, while a small number of them are localized on the mitochondria and chloroplasts. Some genes of ERF transcript factors have high level expression in young roots, mature roots, leaves and stems. Also, genes from different groups have different expression profiles.

nicotiana tabacum; ERF transcript factors; bioinformatics; expression pattern; gene family

S572.03

1007-5119（2017）01-0015-08

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.003

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“擬南芥MUR3基因通過影響木葡聚糖結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞伸長(zhǎng)的分子機(jī)制研究”（31470291）、“擬南芥MYB52轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控果膠質(zhì)去甲酯化過程的分子機(jī)制”（31670302）；國(guó)家科技部支撐計(jì)劃項(xiàng)目“高生物量能源植物和新型生物質(zhì)資源培育與綜合利用示范”（2015BAD15B03）

任昂彥（1989-），女，在讀碩士，研究方向?yàn)榉肿佑N。E-mail：ray0918@163.com。*通信作者，E-mail：kongyingzhen@163.com

2016-08-16

2016-11-08