*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.河南省長垣縣農(nóng)林畜牧局，河南 長垣 453400）

煙草茄尼醇積累與萜類關(guān)鍵酶基因表達的相關(guān)性

蓋小雷1，劉艷華1，姚志敏2，杜詠梅1，閆寧1，張洪博1，戴培剛1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.河南省長垣縣農(nóng)林畜牧局，河南 長垣 453400）

為闡明萜類關(guān)鍵酶基因?qū)煵萸涯岽己铣傻挠绊?，利用超高效液相色譜和實時定量熒光PCR，測定了茄尼醇含量差異顯著的煙草品種紅花大金元（含量高）和中煙90（含量低）6個發(fā)育時期根、莖、葉中茄尼醇含量以及萜類代謝關(guān)鍵酶基因的表達，并分析了其相關(guān)性。結(jié)果表明，紅花大金元和中煙90 6個時期的茄尼醇含量均為葉＞莖＞根。在兩品種中，萜類關(guān)鍵酶基因FPS、DXR、IPI、SPS、GGPPS從苗期至開花期表達量逐漸上升，在根中現(xiàn)蕾期表達量最高，在莖、葉中開花期最高，隨后迅速下降。相關(guān)性分析表明，DXS、GGPPS與茄尼醇含量呈負相關(guān)，而FPS、DXR、SPS以及IPI基因的表達量與茄尼醇含量呈顯著和極顯著正相關(guān)，其在紅花大金元中的高水平表達可能是造成兩品種茄尼醇含量差異的主要原因。另外，根、莖中IPI基因與DXS、FPS、SPS基因的表達呈顯著和極顯著正相關(guān)；葉片中SPS與FPS、IPI基因的表達呈顯著正相關(guān)，而與DXS基因的表達呈顯著負相關(guān)，HMGR與IPI基因表達呈極顯著正相關(guān)。這些基因可能通過協(xié)同作用共同調(diào)控茄尼醇的合成與積累。

煙草；茄尼醇含量；萜類合成酶基因；相關(guān)分析

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，其主要收獲器官為葉片，煙葉中富含萜類、多酚類、生物堿類等次生代謝產(chǎn)物，其中萜類物質(zhì)在煙草品質(zhì)和抗性方面扮演著重要角色[1]。茄尼醇是一種四倍半萜烯醇，具有抗菌、消炎、治療心血管疾病及抗?jié)兊茸饔?，可用于合成輔酶Q10和維生素K2等泛醌類藥物，具有重要的醫(yī)藥價值[2-4]。自Rowland[5]首次從煙草中分離出茄尼醇以來，茄尼醇在番茄、馬鈴薯等茄科作物中均有報道[6-7]，而煙葉中含量最高[8]。煙草茄尼醇含量雖然受環(huán)境因素影響，但主要由遺傳因素決定[9]，因此從基因水平上研究茄尼醇的積累對提高煙草茄尼醇含量具有重要意義。

Fukusaki[10]提出，煙草中茄尼醇是由質(zhì)體中的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的，主要分為3個階段，第1階段是中間體的形成，在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR），1-脫氧-5-磷酸木酮糖合成酶（DXS），1-脫氧-5-磷酸木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）和異戊稀焦磷酸異構(gòu)酶（IPI）作用下合成異戊烯基焦磷酸（IPP）和其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；第2階段是前體物的合成，在牻牛兒基焦磷酸合酶（GPPS），法呢基焦磷酸合酶（FPS）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）作用下，產(chǎn)生牻牛兒基焦磷酸（GPP）、法呢基焦磷酸（FPP）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）；第3階段是萜烯生成階段，在不同的萜烯合酶、萜類環(huán)化酶以及修飾酶的作用下形成各種萜烯類物質(zhì)，其中催化合成茄尼醇的為茄尼基焦磷酸合酶基因。

對于MEP途徑關(guān)鍵酶基因的研究主要集中在基因的克隆和功能驗證方面[11-14]，但有關(guān)不同生育時期萜類關(guān)鍵酶基因的表達與茄尼醇含量的相關(guān)性研究未見報道。本研究利用超高效液相色譜(Ultra-performance Liquid Chromatography，UPLC)和實時熒光定量PCR（real-time PCR）檢測煙葉生長發(fā)育過程中茄尼醇積累和關(guān)鍵酶基因的表達動態(tài)，分析不同關(guān)鍵酶基因與茄尼醇含量的相關(guān)性，探討不同關(guān)鍵酶基因?qū)η涯岽己铣傻恼{(diào)控，發(fā)掘茄尼醇合成調(diào)控的關(guān)鍵位點，為茄尼醇的生物調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在前期對2年4點225份烤煙成熟期中部葉進行茄尼醇含量測定的基礎(chǔ)上，篩選出茄尼醇含量差異顯著的煙草品種紅花大金元（2.78%）和中煙90（1.42%），分別代表高、低茄尼醇含量的種質(zhì)。兩份種子均來源于國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草子平臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣 2015年9月溫室播種，4片真葉時假植，8片真葉時移栽，移栽后10 d第1次取樣、標記葉片，以后每隔10 d取樣1次，共取6次（相當(dāng)于煙草的苗期、團棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、開花期和成熟期），取樣時選擇生長狀態(tài)一致的植株，在相同部位取2葉片，去主脈。取全部的莖和根。每3株混合為 1個樣本，用錫箔紙包裹后放入液氮，3次重復(fù)，分別用于RNA提取和冷凍干燥。

1.2.2 總 RNA的提取及 qRT-PCR檢測 利用Roche公司的TriPure Isolation Reagent 提取煙葉總RNA，利用OSE-260分光光度計檢測總RNA濃度和質(zhì)量。采用大連寶生物公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time，RakaRa），將總RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，稀釋4倍后利用SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus，TakaRa）在熒光定量PCR儀ABI 7500上進行qRT-PCR分析，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火34 s，循環(huán)40次；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s。每個樣品3次重復(fù)。所用的基因特異引物見表1，以Actin作為內(nèi)參基因。

1.2.3 煙草茄尼醇的提取和檢測 利用德國CHRIST冷凍干燥機ALPHA 1-4 LDplus對樣品進行冷凍干燥，研磨，過40目篩，超高效液相色譜（UPLC）法檢測茄尼醇含量。檢測方法參照文獻[15]，條件為色譜柱：BEH C18 1.7 μm，2.1 mm*50 mm，流動相：甲醇-乙腈，體積比為50:50，流速：0.5 L/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：208 nm。

通過對歷史工程項目造價成本進行綜合分選，選取了以下具體參數(shù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的參考指標：建筑面積、層數(shù)、基礎(chǔ)類型、層高、門窗、裝飾材料、屋面工程、造價指數(shù)、室內(nèi)水暖氣電、設(shè)備及安裝費、弱電系統(tǒng)費用。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)選擇為11-3-1的單隱層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，其構(gòu)成的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)模型如圖2所示。

表1 定量RT-PCR中所用的煙草茄尼醇合成關(guān)鍵基因的引物序列Table 1 Primer sequences of solanesol terpenoid synthetic enzyme genes used in RT-PCR tests

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△Ct方法分析各基因的相對表達量，使用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Sigma Plot 10.0制作基因表達關(guān)系的趨勢圖。并利用SPSS 22.0軟件，分析茄尼醇含量與各基因相對表達量之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 煙草不同生育期根、莖、葉中茄尼醇含量

苗期、團棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、開花期和成熟期中煙90和紅花大金元的根、莖、葉樣品中茄尼醇含量如圖1。結(jié)果表明，團棵期前紅花大金元、中煙90品種的根、莖、葉中茄尼醇含量較低，旺長至現(xiàn)蕾期茄尼醇在各器官的積累較慢，開花至煙葉成熟期茄尼醇含量增加最快，煙葉成熟期各器官中茄尼醇含量最高。紅花大金元根、莖、葉中的茄尼醇含量均高于中煙90，葉片茄尼醇含量最高，其次是莖，葉片茄尼醇含量是莖的8～15倍，莖茄尼醇含量是根的5～10倍。

2.2 煙草不同生育期萜類合成關(guān)鍵酶基因的表達模式

2.2.1 萜類合成關(guān)鍵酶基因在根中的表達 由圖2可以看出，供試兩品種根中各關(guān)鍵酶基因的表達一致，其中DXS、DXR、GGPPS以及SPS基因表達量較低，F(xiàn)PS、IPI、HMGR基因的表達量較高，其中FPS基因在根中的表達量最高，其次是IPI基因，自苗期至開花期逐漸升高，旺長期至現(xiàn)蕾期表達量增加得最快，至開花期表達量最高，隨后降低。HMGR基因表達量的第一個峰值紅花大金元出現(xiàn)在團棵期，中煙90則出現(xiàn)在旺長期，隨后降低；開花期至成熟期HMGR表達量逐漸升高。

圖1 兩品種不同生育期根、莖、葉中茄尼醇含量的動態(tài)變化Fig. 1 The dynamic change of solanesol contents in root, stem and leaf at different development stages between two tobacco cultivar

圖2 萜類合成關(guān)鍵酶基因在根中的表達Fig. 2 The expression of terpenoid synthetic enzyme genes in tobacco root

在6個取樣時期IPI基因在根中的表達量均為紅花大金元高于中煙90，差異顯著。SPS基因在中煙 90根中的表達量高于紅花大金元，但差異不顯著；DXS、DXR、GGPPS3個關(guān)鍵酶基因在苗期、旺長、現(xiàn)蕾、開花4個取樣時期紅花大金元中的表達量高于中煙90，其中DXR在兩品種中的表達量差異顯著，而DXS、GGPPS的表達量差異不顯著；FPS和HMGR基因在前5個取樣時期紅花大金元的表達量高于中煙90，在煙葉成熟期，兩基因在中煙90中的表達量高于紅花大金元，其中FPS基因的表達量差異顯著，HMGR差異不顯著。

2.2.3 萜類合成關(guān)鍵酶基因在葉中的表達 由圖 4可以看出，各關(guān)鍵酶在兩品種的表達趨勢一致，其中FPS以及SPS基因在兩品種中的表達量較高，SPS在葉中的表達大于FPS，自苗期至開花期逐漸升高，現(xiàn)蕾期至開花期表達量增長最快，至開花期表達量最高，隨后快速降低，在紅花大金元中的下降速度較快。FPS、SPS、DXR、IPI基因在紅花大金元各生育期的相對表達量顯著高于中煙 90；而DXS在紅花大金元中各生育期的表達量均低于中煙90。GGPPS基因在紅花大金元苗期、團棵期、開花期、成熟期的相對表達量高于中煙90，在旺長期、現(xiàn)蕾期的表達量低于中煙90，但差異不顯著。HMGR基因在紅花大金元苗期、團棵期、旺長期的表達量顯著低于中煙90，現(xiàn)蕾期、開花期、成熟期的表達量高于中煙90，差異顯著。

圖3 萜類合成關(guān)鍵酶基因在莖中的表達Fig. 3 The expression of solanesol terpenoid synthetic enzyme genes in tobacco stem

圖4 萜類合成關(guān)鍵酶基因在葉中的表達Fig. 4 The expression of terpenoid synthetic enzyme genes in tobacco leaf

2.3 萜類合成關(guān)鍵酶基因與茄尼醇含量的相關(guān)性

為明確各茄尼醇合成相關(guān)基因的表達水平與茄尼醇積累含量之間的關(guān)系，對兩品種根、莖、葉發(fā)育過程中各基因的表達量與茄尼醇積累的相關(guān)關(guān)系進行了分析。由表2可以看出，各關(guān)鍵酶基因在兩品種根中的表達量與茄尼醇的積累沒有明顯的相關(guān)性，在兩品種莖中的表達量與茄尼醇的積累均呈正相關(guān)關(guān)系，其中GGPPS基因在紅花大金元中的表達與茄尼醇的含量呈極顯著正相關(guān)，DXS和IPI基因在中煙90莖中的表達與茄尼醇含量分別呈極顯著和顯著正相關(guān)。

在兩品種葉中，DXS和GGPPS基因的表達與茄尼醇的含量呈負相關(guān)；FPS、HMGR、SPS、DXR、IPI基因的表達與茄尼醇含量呈正相關(guān)，其中DXR、IPI、SPS基因的表達與葉中茄尼醇含量呈顯著和極顯著正相關(guān)；紅花大金元莖、葉中FPS、IPI、SPS、DXR基因的相對表達量在各生育期都要高于中煙90。因此，這些基因的高水平表達可能對茄尼醇積累起重要作用。

表2 關(guān)鍵酶基因與茄尼醇含量的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficients between the expression levels of key enzyme genes and the solanesol contents

2.4 萜類合成關(guān)鍵酶基因的相關(guān)性

為明確各關(guān)鍵酶基因之間的相關(guān)性，對兩品種根、莖、葉發(fā)育過程中各基因的相對表達量進行了統(tǒng)計分析。各關(guān)鍵酶基因在根、莖中的相關(guān)性比較一致，如表3，4所示。DXS、IPI、SPS以及GGPPS與其他基因均呈正相關(guān)關(guān)系，其中DXS與FPS和IPI呈顯著、極顯著正相關(guān)；FPS與SPS、IPI基因呈極顯著正相關(guān)；SPS與DXR基因呈顯著正相關(guān)。GGPPS在莖中與HMGR、SPS、DXR以及IPI基因呈顯著和極顯著正相關(guān)，其在根中的表達與其他基因的相關(guān)性不顯著。而各關(guān)鍵酶基因在葉片中的表達與根、莖中的相關(guān)性不同，如表5所示，DXS除與GGPPS表達呈正相關(guān)外，與其他各關(guān)鍵酶基因的表達均呈負相關(guān)關(guān)系；另外，SPS與FPS和IPI基因表達呈顯著正相關(guān)，IPI與HMGR基因的表達呈極顯著正相關(guān)。

表3 各關(guān)鍵酶基因在根部表達的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficients among the expression levels of key enzyme genes in tobacco root

表4 各關(guān)鍵酶基因在莖部表達的相關(guān)性Table 4 Correlation coefficients among the expression levels of key enzyme genes in tobacco stem

表5 各關(guān)鍵酶基因在葉部表達的相關(guān)性Table 5 Correlation coefficients among the expression levels of key enzyme genes in tobacco leaf

3 討 論

3.1 茄尼醇在不同品種根、莖、葉發(fā)育過程中積累量的變化

本研究測定了紅花大金元（高茄尼醇含量）和中煙90（低茄尼醇含量）兩個品種苗期、團棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、開花期、成熟期根、莖、葉中茄尼醇含量的變化趨勢，結(jié)果表明，茄尼醇在煙草根、莖、葉中均有分布，其中葉片茄尼醇含量最高，其次是莖，根中茄尼醇含量最低，這與胡江涌等[16]的研究結(jié)果一致。侯雨佳等[17]研究表明，馬鈴薯葉片中茄尼醇含量在現(xiàn)蕾期至盛花期略有下降，隨后上升，至收獲期茄尼醇含量最高，與本研究結(jié)果不盡一致，這可能與不同作物生育時期不同有關(guān)。另外，在整個生育期紅花大金元根、莖、葉中茄尼醇含量均大于中煙90，因此，不同品種茄尼醇含量的比較，可以取任何時期的樣品進行測定分析，但煙株在團棵期以前，茄尼醇的積累較少，尤其是低茄尼醇含量煙草品種的根，至現(xiàn)蕾期茄尼醇含量增長最快。

3.2 調(diào)節(jié)茄尼醇合成相關(guān)酶基因的表達可能增加煙葉中茄尼醇的含量

在高茄尼醇含量的品種中，基因表達量快速增長時期（旺長期）早于低含量品種（現(xiàn)蕾期），表明代謝途徑中相關(guān)酶基因的啟動時期對茄尼醇的積累有重要的影響，因此，煙草團棵或旺長期可能是調(diào)控茄尼醇積累的關(guān)鍵時期。向德虎等[18]研究表明，煙葉中茄尼醇的含量受主基因和多基因的共同調(diào)控，以主基因遺傳為主，主基因與多基因?qū)η涯岽己康倪z傳效應(yīng)也不盡相同。本研究結(jié)果也表明，煙葉SPS、FPS、DXR以及IPI在兩品種中的表達與茄尼醇含量呈顯著正相關(guān)，且SPS、FPS、IPI表達量較高，Tomohisa H等[19]研究也表明，將DXR基因轉(zhuǎn)入煙草中，茄尼醇含量增加15%左右，因此上調(diào)這些基因的表達可提高煙葉茄尼醇的含量，這與閆寧等[20]的研究結(jié)果相一致。

3.3 茄尼醇合成途徑中關(guān)鍵酶之間存在著復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

植物萜類代謝是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，不僅受自身遺傳背景的影響，同時也受發(fā)育時期、關(guān)鍵酶互作等因素的影響。在萜類代謝途徑中HMGR是第1個限速酶，在煙草葉片中與IPI表達呈極顯著正相關(guān)，表明該基因在萜類代謝中與IPI存在協(xié)同正向調(diào)控作用。Campbell等[21]研究表明，將馬鈴薯MEP代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因IPI轉(zhuǎn)入本氏煙，煙葉茄尼醇含量比野生型提高 1.5倍，共表達IPI、SPS可使煙葉茄尼醇含量提高5.9倍，而共表達SPS和GGPPS煙葉茄尼醇含量沒有明顯的提高，因此茄尼醇含量合成受復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，與本試驗結(jié)果相一致。SPS與DXS存在顯著負相關(guān)可能與茄尼醇合成存在相互競爭和關(guān)聯(lián)的分支途徑有關(guān)，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過測定兩個品種不同時期茄尼醇含量的變化，發(fā)現(xiàn)從苗期至成熟期，茄尼醇在煙草根、莖、葉中均有分布，但在團棵期之前，茄尼醇的積累量較少，尤其是在低含量煙草品種的根部積累更少。相關(guān)性分析表明，煙草茄尼醇的積累與萜類代謝途徑中單萜、倍半萜合成相關(guān)的IPI、FPS以及SPS基因關(guān)系密切，呈顯著正相關(guān)，而與雙萜形成的關(guān)鍵酶基因GGPPS相關(guān)性不顯著。且各關(guān)鍵酶基因之間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響著茄尼醇的合成與積累，研究結(jié)果對茄尼醇的生物調(diào)控研究具有現(xiàn)實意義。

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Study on the Correlation between Solanesol Accumulation and Expression of Gene Encoding Terpenoid Synthetic Enzymes in Tobacco

GE Xiaolei1, LIU Yanhua1, YAO Zhimin2, DU Yongmei1, YAN Ning1, ZHANG Hongbo1, DAI Peigang1*
(1. Tobacco Research Institute of Chinese Agricultural Science, Qingdao 266101, China; 2. Agriculture, Forestry and Animal Husbandry Bureau, Changyuan, Henan 453400, China)

To reveal the impact of the genes encoding key enzymes in solanesol synthesis in tobacco, the UPLC (Ultra-performance Liquid Chromatography) was used to determine the solanesol contents of root, stem, and leaf, and real-time PCR assay was carried out to analyze the expression levels of genes encoding terpenoid synthetic enzymes at different development stages in tobacco cultivars Honghuadajinyuan and Zhongyan 90, whose solanesol contents are significantly different from each other. The correlations between the solanesol contents and the expression levels of these genes were also analyzed. The results showed that the trends of solanesol accumulation were consistent at different development stages in different organs of these cultivars i.e., the solanesol content of leaf was the highest while that of root was the lowest. The expression patterns of different terpenoid synthetic enzyme genes were not completely identical in these two cultivars. The expression levels ofFPS,DXR,IPI,SPS,GGPPSincreased gradually from the seeding stage to the flowering stage. The expression levels were the highest at the budding period in root, at the flowering period in stem and leaf, and then declined rapidly. The correlation analysis showed that the expression levels ofDXSandGGPPSwere negatively correlated with solanesol contents, butFPS,DXR,SPSandIPIexhibited extremely significant positive correlation with solanesol contents. The higher solanesol contents in Honghuadajinyuan may be caused by the higher expression levels of the genes. In addition, the expression level ofIPIshowed extremely significant positive correlation with that ofDXS,FPSandSPSin tobacco root. The expression level ofSPShas significantly positive correlation withFPSandIPI, but has significantly negative correlation withDXSin leaf. The expression level ofIPIshowed extremely significant positive correlation withHMGRin leaf. Which suggested these genes co-regulated the biosynthesis and accumulation of solanesol.

tobacco; solanesol content; terpenoid synthetic enzymes; correlation analysis

S572.03

1007-5119（2017）01-0008-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.01.002

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項“煙草增香減害關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201203091）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC05）；中國煙草總公司重點項目“烤煙生產(chǎn)結(jié)構(gòu)優(yōu)化效應(yīng)及關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用”（110201402007）

蓋小雷（1991-），男，碩士研究生，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：642171836@qq.com。*通信作者，E-mail：daipeigang@caas.cn

2016-10-26

2016-12-17