王金昌，曾小琴，靳亮，占智高

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌330096；2.撫州洋洲中心小學(xué)，江西撫州344000）

GrNPV病毒的擴(kuò)增及與生物農(nóng)藥的復(fù)配

王金昌1，曾小琴2，靳亮1，占智高1

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌330096；2.撫州洋洲中心小學(xué)，江西撫州344000）

本試驗(yàn)擴(kuò)增了草原毛蟲核型多角體病毒GrNPV。初步的生測試驗(yàn)表明，1×108、5×107、1×107、5×106PIB/mL和1×106PIB/mL的GrNPV對(duì)草原毛蟲的致死中時(shí)間KT50都為4d左右。生物農(nóng)藥篩選試驗(yàn)表明，噻蟲啉和阿維菌素對(duì)草原毛蟲的致死率較高，死亡率分別為97.60%和88.60%。GrNPV可減少阿維菌素乳油和噻蟲啉的用量，同時(shí)提高草原毛蟲的死亡率。GrNPV與阿維菌素乳油或噻蟲啉復(fù)配具有很好的殺蟲效果。

草原毛蟲；草原毛蟲核型多角體病毒；生物防治

草原毛蟲為我國高原牧區(qū)的重要害蟲，別名紅頭黑毛蟲、草原毒蛾，屬于鱗翅目、毒蛾科[1]。草原毛蟲主要為害莎草科、禾本科、豆科、蓼科、薔薇科等各類牧草，草原毛蟲爆發(fā)時(shí)危害嚴(yán)重，將牧草的大部分莖葉吃光，只剩下枯枝殘葉，影響牧草生長，造成草原缺草，從而嚴(yán)重地影響畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。草原毛蟲不僅危害牧草，而且對(duì)人畜也有一定的影響，其體毛和繭毛有劇毒，牛羊采食了帶蟲或繭的牧草，會(huì)引起口腔黏膜紅腫，發(fā)生小泡，齒根或舌頭糜爛等[3，4]。

草原毛蟲核型多角體病毒GrNPV（Gynaephora ruoregensis Nuclear Polyhedrosis Virus）對(duì)滅草原毛蟲有較強(qiáng)的毒力，GrNPV對(duì)人體和脊稚動(dòng)物無感染性、致病性和其他毒性[5]，而且能夠通過水平擴(kuò)散和垂直傳遞在害蟲種群內(nèi)形成病毒。劉世貴等[6]于1982-1983年在川西北草原發(fā)現(xiàn)和采集的自然死亡的草原毛蟲尸體，首次分離和篩選而獲得GrNPV，初步生測試驗(yàn)表明GrNPV對(duì)草原毛蟲具有較強(qiáng)的感染致死能力。刁治民[7]于1987年從青海省海北州草地上罹病死亡青海草原毛蟲幼蟲分離獲得GrNPV，試驗(yàn)結(jié)果顯示GrNPV對(duì)草原毛蟲有較強(qiáng)的毒力，其殺蟲效果達(dá)85%，并有后效作用。國外也有草原毛蟲感染核型多角體病毒的報(bào)道[8]，但無用核型多角體病毒進(jìn)行防治的報(bào)道。

近年來，尕海一則岔自然保護(hù)區(qū)及周邊地區(qū)發(fā)生了嚴(yán)重的草原毛蟲災(zāi)害，尕海草原毛蟲屬于金黃草原毛蟲。草原毛蟲與牲畜爭食，極大地降低了草地的載畜能力，加劇了畜草矛盾，給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著保護(hù)區(qū)草地生態(tài)環(huán)境的安全。目前，防治草原毛蟲大多用水溶性化學(xué)農(nóng)藥。但是，草原牧場長期施用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致草原毛蟲抗藥性增強(qiáng)，天敵數(shù)目減少，而且造成了草原污染環(huán)境，破壞了生態(tài)平衡以及產(chǎn)生農(nóng)藥殘留增等問題。同化學(xué)防治相比，以生物農(nóng)藥和病毒為代表的生物防治技術(shù)具有對(duì)目標(biāo)害蟲特異性好、對(duì)環(huán)境無毒無害、害蟲不容易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。楊志榮等[9]把GrNPV與蘇云金桿菌B13混合再添加入一些輔助成分制成一種復(fù)合的V·B草原毛蟲生物防治劑，用量50mL/667 m2，溫度20℃左右時(shí)對(duì)3齡草原毛蟲的防治效果達(dá)80%以上，能有效地防治草原毛蟲。為此，本文開展GrNPV擴(kuò)增、生測和與生物農(nóng)藥復(fù)配試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 生物材料

供試草原毛蟲幼蟲，尕海高寒草地采集的2齡草原毛蟲幼蟲；養(yǎng)蟲器皿，21L茶花帶蓋塑料水桶。

人工飼料，采于尕海高寒草地新鮮的帶根垂穗披堿草和草地早熟禾，飼喂前用無菌水洗滌3次，晾干，用紫外線照15min；GrNPV病毒，中國科學(xué)院武漢病毒所饋贈(zèng)。

1.1.2 藥劑與器材

2.8 %阿維菌素乳油，黑龍江省綏化農(nóng)墾晨環(huán)生物制劑有限責(zé)任公司；60g/L乙基多殺菌素懸浮劑，美國陶氏益農(nóng)公司；32 000IU/mg蘇云金芽孢桿菌，武漢科諾生物科技股份有限公司；40%毒死蜱乳油，江蘇輝豐農(nóng)化廣豐有限公司；3%噻蟲啉，南通功成精細(xì)化工有限公司；150億個(gè)孢子/g球孢白僵菌，江西天人生態(tài)股份有限公司。普蘭迪背負(fù)式12AH電動(dòng)噴霧器3WDB-16L，石家莊市普蘭迪機(jī)電設(shè)備有限公司；鑷子、1m2樣方框（自制）和標(biāo)志旗等。

1.1.3 試驗(yàn)地

甘肅尕海，地理坐標(biāo)為北緯33°58′12″～34°32′16″，東經(jīng)102°05′00″～102°47′39″。

1.2 GrNPV病毒試驗(yàn)

1.2.1 GrNPV病毒室內(nèi)增殖試驗(yàn)

在尕海高寒草地采集的2齡草原毛蟲幼蟲，用垂穗披堿草和草地早熟禾喂養(yǎng)至3齡期。增殖時(shí)選用100頭健壯、發(fā)育整齊一致的3齡草原毛蟲幼蟲。把GrNPV病毒原液用無菌水稀釋至3×106PIB/mL，用塑料噴壺噴灑到垂穗披堿草和草地早熟禾上，陰干后放入21L茶花帶蓋塑料水桶內(nèi)，接入3齡草原毛蟲幼蟲。25℃，光照周9∶15飼養(yǎng)至草原毛蟲全部死亡。期間每天注意觀察，飼毒48h后換上新鮮的草料，及時(shí)取出伸直死亡的病死毛蟲置4℃冰箱保存。

1.2.2 GrNPV病毒的提取

取病死蟲尸中腸，加少量無菌水，在無菌研缽中研磨，差速離心研磨液2次（4 000rpm離心25min后500rpm離心30s），在光學(xué)顯微鏡（10×100）下，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，病毒液置4℃冰箱保存。

1.2.3 GrNPV的室內(nèi)生測試驗(yàn)

將滅菌后的粗提多角體加適量無菌水搖勻計(jì)數(shù)后配成所需要的濃度如下：1×108、5×107、1×107、5×106、1×106、5×105、1×105、5×104PIB/mL和1×104PIB/mL 9個(gè)濃度。每頭以20μL用移液器吸取滴于1cm2的葉面上，涂勻晾干，進(jìn)行喂飼試驗(yàn)。每濃度一組，每組24頭幼蟲，分別放在消毒的容器內(nèi)，瓶口用濕紗布扎緊，涂無菌水作對(duì)照，重復(fù)3次。感染24h檢查各組葉片全部吃光時(shí)，然后加入新鮮清潔葉片繼續(xù)飼養(yǎng)。按試驗(yàn)要求進(jìn)行觀察記載[10]。計(jì)算死亡率，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，應(yīng)用SPSS軟件的Probit進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算各不同病毒濃度的致死中時(shí)間（KT50）[11]。

1.3 GrNPV病毒與其他生物農(nóng)藥復(fù)配篩選試驗(yàn)

1.3.1 生物農(nóng)藥篩選試驗(yàn)

選擇草原毛蟲密度適中且分布相對(duì)均勻的危害區(qū)為試驗(yàn)區(qū)，施藥時(shí)絕大多數(shù)草原毛蟲個(gè)體處在3蛉期[12，13]。

設(shè)立6個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)，各區(qū)使用的藥品和用量如下：1區(qū)藥品為2.8%阿維菌素乳油，噴藥劑量為1 000mL/hm2；2區(qū)藥品為60g/L乙基多殺菌素懸浮劑，噴藥劑量為300mL/hm2；3區(qū)藥品為蘇云金芽孢桿菌可濕粉劑，噴藥劑量為500g/hm2；4區(qū)藥品為40%毒死蜱乳油，噴藥劑量為1 000mL/hm2；5區(qū)藥品為3%噻蟲啉，噴藥劑量為1 600mL/hm2；6區(qū)藥品為150億個(gè)孢子/g球孢白僵菌，噴藥劑量為3 000g/hm2。同時(shí)，設(shè)立空白對(duì)照區(qū)。計(jì)算施藥前及施藥5d后各區(qū)草原毛蟲數(shù)量，得出校正死亡率。

1.3.2 GrNPV病毒與其他生物農(nóng)藥復(fù)配篩選試驗(yàn)

在GrNPV的室內(nèi)生測試驗(yàn)和生物農(nóng)藥篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇適宜的生物農(nóng)藥與適宜濃度的GrNPV病毒進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 草原毛蟲核型多角體病毒GrNPV病毒擴(kuò)增結(jié)果

草原毛蟲幼蟲感染GrNPV病毒16d后全部死亡，取病死蟲尸中腸研磨后差速離心提取GrNPV，GrNPV鏡檢結(jié)果見圖1。

圖1 GrNPV鏡檢圖

2.2 GrNPV病毒生測結(jié)果

GrNPV病毒生測結(jié)果如表1所示。將表1用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。F=1 692.923＞F0.01（8，32）=3.23，說明不同濃度GrNPV對(duì)草原毛蟲的致死作用效果差異顯著。

應(yīng)用SPSS軟件的Probit逐一對(duì)表1中不同濃度GrNPV對(duì)草原毛蟲的致死時(shí)間進(jìn)行線性回歸分析，擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，根據(jù)回歸方程計(jì)算出不同濃度GrNPV的致死中時(shí)間KT50，結(jié)果見表3。

表1 GrNPV對(duì)草原毛蟲幼蟲感染致死的校正死亡率

表2 GrNPV不同濃度不同時(shí)間對(duì)草原毛蟲幼蟲死亡率方差分析

表3 不同濃度GrNPV對(duì)草原毛蟲的致死時(shí)間的Probit分析結(jié)果

從表3可知，1×108、5×107、1×107、5×106、1×106PIB/mL的GrNPV對(duì)草原毛蟲的致死中時(shí)間KT50相差不大，都為4d左右，故選用1×106PIB/mL的GrNPV作為與其他生物農(nóng)藥復(fù)配試驗(yàn)的工作濃度。

2.3 生物農(nóng)藥篩選試驗(yàn)結(jié)果

生物農(nóng)藥篩選試驗(yàn)結(jié)果見圖2所示。

圖2 不同農(nóng)藥對(duì)草原毛蟲的校正致死率圖

從圖2可見，噻蟲啉和阿維菌素阿維菌素對(duì)草原毛蟲的致死率較高，校正死亡率為分別為97.60%和88.60%。故選擇噻蟲啉和阿維菌素與GrNPV病毒進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

2.4 GrNPV病毒與其他生物農(nóng)藥復(fù)配篩選試驗(yàn)結(jié)果

GrNPV病毒與其他生物農(nóng)藥復(fù)配篩選試驗(yàn)設(shè)立4個(gè)試驗(yàn)區(qū)，1區(qū)噴施2.8%阿維菌素乳油，噴藥劑量為1 000mL/hm2；2區(qū)噴施3%噻蟲啉，噴藥劑量為1 600mL/hm2；3區(qū)為1×106PIB/mL GrNPV+3%噻蟲啉，GrNPV噴藥劑量為500mL/hm2，噻蟲啉噴藥劑量為800mL/hm2；4區(qū)為1×106PIB/mL GrNPV+2.8%阿維菌素乳油，GrNPV噴藥劑量為500mL/hm2，阿維菌素乳油噴藥劑量為500mL/hm2。計(jì)算施藥前及施藥5d后各區(qū)草原毛蟲數(shù)量，得出校正死亡率。GrNPV病毒與噻蟲啉和阿維菌素復(fù)配篩選試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 不同農(nóng)藥對(duì)草原毛蟲的校正致死率圖

從圖3可見，GrNPV可減少阿維菌素乳油和噻蟲啉的用量，同時(shí)提高草原毛蟲的死亡率：3區(qū)阿維菌素乳油的用量是1區(qū)阿維菌素乳油用量的1/2，草原毛蟲的校正死亡率從88.60%提高到95%；4區(qū)噻蟲啉用量是2區(qū)噻蟲啉用量的1/2，草原毛蟲的校正死亡率都維持在90%以上。

3 結(jié)論

阿維菌素和噻蟲啉均是一種高效、低毒和無公害的生物殺蟲劑，對(duì)主要牧草嵩草科、禾本科等均無藥害現(xiàn)象，說明該藥劑對(duì)牧草安全，具有大規(guī)模推廣應(yīng)用的必要性[14]。本試驗(yàn)把GrNPV與阿維菌素乳油或噻蟲啉復(fù)配、擴(kuò)增GrNPV，把GrNPV與阿維菌素乳油或噻蟲啉復(fù)配，減少了阿維菌素乳油和噻蟲啉的用量，同時(shí)提高草原毛蟲的死亡率，能有效殺滅草原毛蟲，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，而且能夠在草原毛蟲種群內(nèi)進(jìn)行水平擴(kuò)散和垂直感染，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Amplification of GrNPV and Its Combination with Biological Pesticide

Wang Jin-chang1, Zeng Xiao-qin2, Jin Liang1, Zhan Zhi-gao1
(1.Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Science, Jiangxi Nanchang 330096; 2.Fuzhou Yangzhou Central Primary School, Jiangxi Fuzhou 344000)

In this study, we amplified the GrNPV (GynaephoraruoregensisNuclearPolyhedrosis Virus). Preliminary bioassay tests showed that the median lethal time of Gynaephora aureate Ghou et Ying was about four days, under the treatment of 1×108, 5×107, 1×107, 5×106, 1×106PIB/mLGrNPV to Gynaephora aureate Ghou et Ying. Biological pesticide screening test showed that thiacloprid and abamectin on grassland caterpillar has high mortality, the mortality rates were 97.60% and 88.60% respectively. GrNPV can reduce the abamectin and thiacloprid dosage, and make the high mortality rate of Gynaephora aureate Ghou et Ying. GrNPV and avermectin or thiazoline compound has good insecticidal effect.

Gynaephora aureate Ghou et Ying; GrNPV; Biological control

Q93

A

2096-0387（2017）01-0021-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260031）；江西省科技重大專項(xiàng)基金項(xiàng)目（2014ACF60002）；江西省科學(xué)院產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目（2016-YCXY-09）。

王金昌（1975-），男，副研究員，研究方向：生物技術(shù)。