崔海英,柏 梅,戴錦銘,陶貴澤,林 琳

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

冷等離子體技術(shù)對(duì)黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用研究

崔海英,柏 梅,戴錦銘,陶貴澤,林 琳*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

利用冷源氮?dú)獾入x子體殺菌技術(shù)清除新鮮黃瓜表面的大腸桿菌O157∶H7生物膜。試管實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜有較好的清除作用,在作用功率為500 W,連續(xù)作用4 min后對(duì)生物膜清除率達(dá)到99.99%。當(dāng)?shù)入x子體應(yīng)用于黃瓜表面時(shí),作用4 min時(shí),殺菌率達(dá)到99.21%。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:等離子體作用后,菌落數(shù)量和細(xì)菌生物膜厚度明顯小于對(duì)照組。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,等離子組4 min處理后細(xì)菌群落附著數(shù)量顯著變少。總之,等離子體技術(shù)在基本維持食品感官的前提下提高了新鮮黃瓜的微生物安全性。

冷等離子體,大腸桿菌O157∶H7,生物膜,黃瓜,殺菌作用

細(xì)菌生物膜是指附著于惰性或者活性實(shí)體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體[1]。極具危害的是,細(xì)菌可在食品表面形成生物膜,包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌等。在食源性致病菌中,大腸桿菌O157∶H7是最危險(xiǎn)的一種,它的感染劑量非常低,極易引起胃腸疾病的爆發(fā),而其24 h便可形成成熟的生物膜。大腸桿菌O157∶H7能夠污染各種食品,其中新鮮蔬菜污染的頻率非常高[2]。2011年德國(guó)出現(xiàn)了受出血性大腸桿菌污染的“毒黃瓜”事件,致多人死亡。隨后,“毒黃瓜”在歐洲蔓延,并造成多國(guó)千人以上的大型食源性感染事故。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶H7經(jīng)常會(huì)聚集在植物葉子的氣孔、被損傷處形成生物膜[3]。生物膜一旦形成即具有較強(qiáng)的黏附力,很難清除。

目前冷等離子體技術(shù)作為一種新興的廣譜滅菌技術(shù),因其高效無(wú)害,操作簡(jiǎn)單,成本低廉而被廣泛關(guān)注[4]。此外,等離子體技術(shù)作為一種物理殺菌方法可有效地避免化學(xué)消毒劑在食品中的殘留,消除其不利影響,在有效殺滅細(xì)菌的同時(shí)維持產(chǎn)品的鮮味、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分。我國(guó)已有研究利用等離子體技術(shù)來(lái)殺滅食源性致病菌[5-6],而關(guān)于等離子體對(duì)細(xì)菌生物膜的清除作用的相關(guān)研究甚少。一般的蔬菜清洗劑很難穿透生物膜的胞外脂多糖基質(zhì)層,因此探索安全無(wú)毒的殺菌技術(shù)來(lái)清除生物膜是目前食品安全領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)。本文以研究清除黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜為目的,探明等離子體是否能應(yīng)用在新鮮蔬菜表面,維持微生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliEHEC O157∶H7 CICC 21530,E. coli O157∶H7) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Trypticase soy broth medium,TSB) 杭州微生物試劑有限公司;普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar,NA) 蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL;3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)試劑盒、4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)熒光染料 碧云天生物技術(shù)研究所。

APLM-SP-YB-D1KW-3232328-2-5冷源氮?dú)獾入x子體裝置 南京愛(ài)特維電子科技有限公司;Infinite 200 PRO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 奧地利Tecan Austria GmbH Untersbergstr公司;TCS SPS Ⅱ激光共聚焦顯微鏡 德國(guó) Leica 公司;JSM-7001F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;Color Quest XE分光測(cè)色儀 美國(guó)HunterLab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT染色法確定等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用 將400 μL無(wú)菌TSB加到48孔板中,接入大腸桿菌O157∶H7(105～106CFU/mL)。將其置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),培養(yǎng)1 d后輕輕吸除孔中上部的培養(yǎng)基及懸浮細(xì)菌,用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS,0.03 mol/L,pH7.2)輕輕清洗三次,更換新的TSB。此步驟每天重復(fù)一次,培養(yǎng)5 d,使得孔板底部和周圍形成較多的生物膜。成熟的生物膜獲得后,用PBS沖洗掉未完全附著的細(xì)菌。將48孔板置于冷等離子體載物臺(tái)上,打開(kāi)電源調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁繛?00 sccm,產(chǎn)生輝光處理樣品。首先控制時(shí)間為最大限度的4 min,通過(guò)改變頻率或電流來(lái)調(diào)節(jié)等離子體的強(qiáng)度,不同功率(0、300、400、500、600 W)處理樣品確定合適的作用功率。確定合適功率后,不同時(shí)間(0、0.5、1、2、4 min)處理樣品,確定合適作用時(shí)間。處理后在孔板中加入400 μL MTT(0.5 mg/mL),37 ℃靜置培養(yǎng)4 h后,加入100 μL細(xì)胞裂解液,繼續(xù)靜置培養(yǎng)至紫色結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在570 nm處的吸光值。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次[7]。

1.2.2 菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用 不銹鋼片(2 cm×2 cm)浸泡在無(wú)水乙醇中超聲清洗4 h,用蒸餾水清洗干凈后,121 ℃滅菌15 min。將無(wú)菌不銹鋼片加入接有大腸桿菌O157∶H7(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃靜置培養(yǎng)5 d,期間每天更換一次新鮮TSB。5 d后將不銹鋼片取出,用無(wú)菌0.03 mol/L PBS清洗三次,放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中。隨后用等離子體按照上述步驟處理樣品以確定合適作用功率和時(shí)間，未經(jīng)等離子體處理樣品作為空白。處理后將不銹鋼片放入含有10 mL PBS的離心管中,低功率下超聲10 min,使生物膜分離形成單個(gè)浮游細(xì)菌的形式。將以上得到的菌懸液十倍梯度稀釋,涂布于NA瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定殘存活菌數(shù)。每個(gè)測(cè)定重復(fù)三次取平均值[8]。

殺菌率或清除率(%)=(空白組菌數(shù)-實(shí)驗(yàn)組殘存菌數(shù))/空白組菌數(shù)×100

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜 將蓋玻片用無(wú)水乙醇浸泡,超聲清洗4 h,用蒸餾水清洗干凈后,121 ℃滅菌15 min。將無(wú)菌蓋玻片加入無(wú)菌TSB中并接入大腸桿菌O157∶H7(105～106CFU/mL),25 ℃靜置培養(yǎng)5 d,去除游離細(xì)菌后,用等離子體處理。將蓋玻片放入DAPI溶劑中避光染色15 min,隨后用激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜。不加處理的蓋玻片作為空白對(duì)照[8]。

1.2.4 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜 參照上述步驟,將大腸桿菌O157∶H7生物膜培養(yǎng)在無(wú)菌尼龍片(1 cm×1 cm)上。將尼龍片用無(wú)菌PBS清洗三次后在超凈工作臺(tái)內(nèi)稍晾干,隨后用冷等離子體處理,借助場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察生物膜變化情況[3]。

1.2.5 等離子體對(duì)黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用 將黃瓜皮切片,約為1 cm×1 cm,浸泡在100 ppm次氯酸鈉溶液中,超聲清洗1 h,隨后置于紫外燈下輻射處理以除去黃瓜表面原始微生物。將黃瓜片置于含有105～106CFU/mL大腸桿菌O157∶H7的TSB中,25 ℃靜置培養(yǎng)3 d。取出黃瓜片經(jīng)無(wú)菌PBS多次充分漂洗去掉浮游菌,隨后控制等離子體功率為500 W,以不同時(shí)間(0、1、2、3、4 min)處理黃瓜樣品。隨后取相同處理的黃瓜片10片,置于100 mL PBS中用均質(zhì)器均質(zhì),混勻菌液后,按照平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[9]。

1.2.6 質(zhì)量與感官評(píng)價(jià)分析 將新鮮黃瓜切塊,取相同部位由等離子體500 W處理4 min后用分光測(cè)色儀分析表面顏色變化,獲得L*(lightness,亮度指數(shù),與顏色濃淡相關(guān),L*值越大顏色越淡),a*(redness,正值越大紅光越強(qiáng),負(fù)值越大綠光越強(qiáng))和b*(yellowness正值越大黃光越強(qiáng),負(fù)值越大藍(lán)光越強(qiáng))值。最后在江蘇大學(xué)食品學(xué)院選擇20名同學(xué)對(duì)黃瓜的感官性能以打分的形式做出評(píng)價(jià),由1～9分代表著“非常不喜歡”至“非常喜歡”[10]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)一式三份,取其平均值。使用SPSS軟件(Windows 22.0版本)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析空白組與各實(shí)驗(yàn)組之間的顯著性差異,p<0.05表明有顯著性差異。誤差線對(duì)應(yīng)于三組重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同功率等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用分析

實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定生物膜的代謝活性以及殘存活菌的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)等離子體的清除生物膜性能。如圖1所示,隨著處理功率的增加,實(shí)驗(yàn)組的吸光值明顯降低,當(dāng)處理功率為500 W和600 W時(shí),吸光度值差別不大,所以選擇以500 W的處理功率做不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。而殘存菌數(shù)法與MTT法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的相關(guān)性。未被等離子體作用的不銹鋼片上生物膜活菌數(shù)為107～108CFU/cm2,經(jīng)過(guò)等離子體作用后細(xì)菌數(shù)量不斷減少。

圖1 等離子體不同處理功率對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜活性的影響Fig.1 Effect of different treatment power of plasma on the viability of E. coli O157∶H7 biofilms注:*表示與空白組有顯著性差異;圖2同。

2.2 不同時(shí)間等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用分析

如圖2所示,經(jīng)過(guò)等離子體作用后,吸光度值顯著降低,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),其對(duì)大腸桿菌O157∶H7代謝活力的抑制作用逐漸增強(qiáng)。這可能是由于等離子體的活性成分作用于細(xì)菌,使其細(xì)胞膜通透性增加,大量離子、核酸及蛋白等物質(zhì)發(fā)生泄漏,細(xì)胞代謝紊亂,從而使其代謝活力受到了抑制。根據(jù)殘存菌數(shù)圖可以得出，等離子體在作用功率為500 W時(shí),連續(xù)作用4 min時(shí)對(duì)不銹鋼片上的生物膜清除率達(dá)到99.99%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明等離子體能有效清除48孔板及不銹鋼片上的大腸桿菌O157∶H7生物膜。

圖2 等離子體不同處理時(shí)間對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜活性的影響Fig.2 Effect of different treatment time of plasma on the viability of E. coli O157∶H7 biofilms

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜

采用激光共聚焦顯微鏡,直觀地觀察了大腸桿菌O157∶H7生物膜在等離子體處理前后的形態(tài)變化。如圖3所示,由未經(jīng)等離子體處理(空白組)至處理時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度明顯地逐漸減弱?？瞻讓?duì)照組中大量的大腸桿菌O157∶H7相互聚集粘連,層層堆集,形成一層致密的膜結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)等離子體作用后,可清晰地看到大部分生物膜結(jié)構(gòu)被破壞;作用時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)菌生物膜的結(jié)構(gòu)遭到的破壞越大;作用1 min時(shí),生物膜厚薄不均,結(jié)構(gòu)稀疏,但仍有大量的細(xì)菌連成片呈云霧狀;作用長(zhǎng)達(dá)4 min時(shí),僅剩余少量細(xì)菌粘附于蓋玻片表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜有良好的清除效果。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下各實(shí)驗(yàn)組的生物膜形態(tài)(2000×)Fig.3 Confocal laser scanning microscope images of E. coli O157∶H7 biofilm after different treatment(2000×)注:a. 空白組;b. 等離子體處理1 min;c. 等離子體處理2 min;d. 等離子體處理4 min。

2.4 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜

圖4 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下生物膜形態(tài)Fig.4 SEM images of E. coli O157∶H7biofilm after different treatment注:a. 空白組;b. 等離子體處理4 min。

場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡更加細(xì)微地觀察了等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜的失活作用。如圖4所示,空白組中大腸桿菌O157∶H7聚集粘附在尼龍片表面,形成一層厚厚的緊密的生物膜結(jié)構(gòu),且能觀察到細(xì)菌分泌的絲狀多糖存在。經(jīng)等離子體處理后,完整的生物膜結(jié)構(gòu)被破壞,細(xì)菌分散,剩余的少量浮游細(xì)菌聚集成較小的團(tuán)狀,且細(xì)菌表面形態(tài)坍塌、不光滑,內(nèi)容物滲出后菌體干癟、失活。

2.5 等離子體對(duì)黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜的清除作用

結(jié)果顯示,等離子體可有效地清除黃瓜表面的大腸桿菌 O157∶H7生物膜。與對(duì)照組相比,500 W處理4 min后,等離子體殺菌率達(dá)到了99.21%。當(dāng)?shù)入x子體殺菌技術(shù)應(yīng)用于黃瓜表面時(shí),仍可以達(dá)到較好的殺菌效果,但與試管實(shí)驗(yàn)相比較差,這是由于處理對(duì)象表面粗糙度的差異使得殺菌效果不同[11],黃瓜表面粗糙的特點(diǎn)降低了等離子體的殺菌作用。

圖5 等離子體(500 W)不同處理時(shí)間對(duì)黃瓜表面大腸桿菌O157∶H7生物膜活性的影響Fig.5 Effect of different treatment time(power:500 W)of plasma on the viability of E. coli O157∶H7biofilms formed on cucumber surface注:*表示與空白組有顯著性差異。

2.6 質(zhì)量與感官評(píng)價(jià)分析

等離子體(500 W)處理黃瓜4 min后,表面色差實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)以及感官指標(biāo)的變化情況見(jiàn)表1,在等離子體處理后,亮度L*值降低,a*值變大,b*值變大,表明等離子體處理使得黃瓜表面色澤不如新鮮黃瓜。感官得分可知,外觀、顏色、味道及總體接受性分?jǐn)?shù)相比對(duì)照組都略有下降。綜合上述結(jié)果,等離子體對(duì)黃瓜的品質(zhì)略有影響,但總體上可被大家接受。

表1 冷等離子體對(duì)黃瓜感官質(zhì)量的影響Table 1 Effect of cold plasma on sensory quality of cucumber immediately after treatment

3 結(jié)論

等離子體對(duì)大腸桿菌O157∶H7生物膜有較好的清除作用,在作用功率為500 W,連續(xù)作用4 min后對(duì)生物膜清除率達(dá)到99.99%。當(dāng)其應(yīng)用于黃瓜表面時(shí),作用4 min 后,殺菌率達(dá)到99.21%。結(jié)果表明等離子體對(duì)生物膜有較好的殺滅效果。本實(shí)驗(yàn)還借助于激光共聚焦顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡直接觀察了等離子體對(duì)生物膜的清除情況。以上實(shí)驗(yàn)更直觀地表示了等離子體具有較好的抗生物膜性能。隨后的感官評(píng)價(jià)表明等離子體在殺滅細(xì)菌生物膜時(shí)對(duì)新鮮黃瓜的顏色、質(zhì)地、及口感影響甚小。

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Antimicrobial activity of cold nitrogen plasma againstEscherichiacoliO157∶H7 biofilms on cucumber

CUI Hai-ying,BAI Mei,DAI Jin-ming,TAO Gui-ze,LIN Lin*

(School of Food & Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

This study focuses on the bactericidal effect of cold nitrogen plasma onEscherichiacoliO157∶H7(E.coliO157∶H7)biofilms formed on fresh cucumber. The results of the vitro experiment demonstrated that plasma has a satisfactory eradicating effect onE.coliO157∶H7. After exposure to plasma at 500 W for 4 min,almost 99.99% and 99.21% reductions inE.coliO157∶H7 populations were achievedinvitroand on cucumber,respectively. Confocal laser scanning microscopy(CLSM)was adopted to detect the bacterium community quantity unit area and thickness of bacterium biofilms. Scanning electron microscope(SEM)was used to observe surface structure of biofilms. In conclusion,plasma was an effective method on eradicating biofilms and simultaneously had mild effect on sensory quality of fresh cucumber.

cold nitrogen plasma;EscherichiacoliO157∶H7;biofilms;cucumber;antibacterial effect

2016-07-18

崔海英(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:cuihaiying@ujs.edu.cn。

*通訊作者:林琳(1978-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail:linl@ujs.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301573)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20130493);江蘇大學(xué)第十五批大學(xué)生科研立項(xiàng)(15A168);江蘇省第十三批“六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目(NY-013)。

TS255

A

1002-0306(2017)02-0162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.022