陳 麗,黃學勇,張婷婷,羅麗萍

(南昌大學生命科學學院,江西南昌 330031)

綠豆種子萌發(fā)過程中酚類化合物的動態(tài)變化

陳 麗,黃學勇,張婷婷,羅麗萍*

(南昌大學生命科學學院,江西南昌 330031)

建立了同時測定綠豆醇提液中19種酚類化合物的高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)方法,并結合標準品對綠豆種子萌發(fā)過程中19種酚類化合物進行了定性定量分析。結果表明,在綠豆種子萌發(fā)過程中,酚類化合物種類和總量均有所增加,其中沒食子酸和咖啡酸含量隨萌發(fā)時間的顯著延長而增加;蘆丁、黃豆苷元、山奈酚、p-香豆酸、阿魏酸和染料木素含量在第7 d有最大值,分別為1574.5、114.3、80.3、43.3、207.9和45.3 μg/g;槲皮素含量在第4 d有最大值28.0 μg/g;原兒茶酸、橙皮苷、肉桂酸和柚皮素含量在第5 d有最大值,分別為89.1、297.4、84.6和30.6 μg/g;白藜蘆醇、對硝基苯甲酸和鷹嘴豆芽素A含量在第2 d有最大值,分別為89.6、70.8和237.0 μg/g;楊梅酮、兒茶素和橙皮素含量在第6 d有最大值,分別為40.7、712.1和58.2 μg/g。而19種酚類化合物總含量在第7 d有最大值,達到3508.8 μg/g。在綠豆種子萌發(fā)過程中,由于酶種類增多、活性增強,導致次級代謝產(chǎn)物大量合成,酚類化合物含量增多。

綠豆,種子萌發(fā),高效液相色譜(HPLC),酚類化合物

綠豆(Mung bean)是豆科(Leguminosae)豇豆屬(Vigna)植物綠豆(VignaradiataL.)的成熟種子,在我國種植廣泛,主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)[1],是廣受歡迎的藥食兩用食物[2]。綠豆不僅富含蛋白質,而且含有豐富的類胡蘿卜素、抗壞血酸、皂苷、類黃酮等抗氧化性成分[3-4],可預防心血管疾病、降低慢性疾病風險等,是良好的抗氧化性食品[5]。綠豆芽(Mung bean sprout),別名豆芽菜,是綠豆種子在適宜條件下萌發(fā)生長出的嫩芽,主要食用部分為下胚軸,是一種傳統(tǒng)的芽類蔬菜[6]。據(jù)報道,綠豆的營養(yǎng)品質可以通過發(fā)芽得到提高[7],例如,綠豆種子在萌發(fā)過程中,由于酶的種類增加、酶活性增強,導致呼吸作用加強[8-9],脂肪、還原糖等被大量水解,使蛋白質、維生素、自由氨基酸、異黃酮、總酚酸等含量增加[10-11]。

酚類化合物是一類重要的生物活性物質,常常作為抗氧化劑應用于食品當中[12-13],具有降血壓、降血脂、軟化血管等功效[14]。綠豆種子富含酚類化合物[15-16],在萌發(fā)過程中,由于酶活性提高,植物體水解反應加快,導致次級代謝產(chǎn)物大量合成[17-18],從而使酚類含量增加。Tang等人[10]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚、蘆丁、染料木素、咖啡酸等是萌發(fā)代謝過程中主要的多酚類物質,在萌發(fā)過程中,這些酚類化合物的含量發(fā)生了明顯的變化。Huang等人[8]研究發(fā)現(xiàn),種子萌發(fā)過程中異黃酮水平明顯提高,染料木素含量相較于對照組高出3倍。López等[19]人研究發(fā)現(xiàn),種子萌發(fā)過程中,酚類化合物被大量合成,使抗氧化能力增強。但是,對于綠豆種子萌發(fā)過程中酚類化合物的動態(tài)變化的研究報道不多。

表1 梯度洗脫流動相比例Table 1 Ratio of mobile phases for gradient elution

為了更加詳細地了解綠豆種子在萌發(fā)過程中酚類化合物的動態(tài)變化,本文擬采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC),定性定量分析綠豆種子在萌發(fā)過程中19種酚類化合物的代謝變化,找出酚類化合物在萌發(fā)過程中的變化規(guī)律,為合理食用綠豆芽及食品研發(fā)方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆(VignaradiataL. Wilczek)種子 東北明綠豆,2015年產(chǎn)自中國吉林省白城市通榆縣;阿魏酸(Ferulic acid,Fe),肉桂酸(Cinnamic scid,Ci),柚皮素(Naringenin,N),槲皮素(Quercetin,Q),山奈酚(Keampferol,K),染料木素(Genistein,Ge)和p-香豆酸(p-Coumaric,p-c) 購自中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心;沒食子酸(Gallic acid,Ga),兒茶素(Catechin,Cat),咖啡酸(Caffeic acid,Ca)和蘆丁(Rutin,R) 中國食品藥品檢定研究院;楊梅酮(Myricetin,My),對硝基苯甲酸(4-nitrobenzoic acid,Ni) 購自Sigma-Aldrich;白藜蘆醇(Resvaratrol,Re),黃豆苷元(Daidzein,Da),橙皮素(Hesperetin,H),鷹嘴豆芽素A(Biochanin A,Bi) 購自阿拉丁試劑;橙皮苷(Hesperetin,He),原兒茶酸(Protocatechuic acid,Pr) 購自百靈威試劑;蘆丁和楊梅酮 純度≥95%,其余標準品純度≥98%;甲醇和乙腈 色譜級(德國默克);乙醇 分析純;甲酸 優(yōu)級純;實驗用水 超純水。

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀 包括在線脫氣裝置,四元泵,柱溫箱,光電二極管陣列檢測器(DAD),手動進樣裝置,及G2170BALC化學工作站;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;GXZ-380B人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司;KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5-A低速離心機 上海安亭科學儀器廠;Master超純水系統(tǒng)Master-S plus UF 上海和泰儀器有限公司;DFT150直立式多功能粉碎機 溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司;AR1140電子分析天平(精度0.0001 g) 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司。

1.2 樣品制備

1.2.1 種子前處理及萌發(fā) 精選一定量色澤新鮮、籽粒飽滿的優(yōu)質綠豆,用蒸餾水漂洗3～4次,然后用2%次氯酸鈉消毒10 min后用無菌水沖洗3～4遍。在9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)墊2層濾紙作發(fā)芽床,每皿放25粒綠豆,以5個培養(yǎng)皿為1個處理,每個處理重復3次,培養(yǎng)皿置于25 ℃、100% RH人工氣候箱中暗培養(yǎng),保持濾紙濕潤。

1.2.2 綠豆醇提液制備 隨機取出一定量各組發(fā)芽的綠豆,對照組(CK)為未發(fā)芽綠豆種子,放入40 ℃的鼓風干燥箱內(nèi)干燥至恒重,粉碎、過40目篩,粉末密封,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別稱取2.0 g各組綠豆粉末,用70%(V:V)乙醇,料液比為1∶20[20],50 ℃于150 W下超聲提取40 min,3500 r/min離心5 min,濾渣重復提取1次,合并上清液,旋轉蒸發(fā)后將濃縮液轉入10 mL容量瓶中,用70%甲醇定容,獲得綠豆醇提液(Ethanol extract of mung bean,EEM)。將EEM放入-20 ℃冰箱中保存,備用。

1.2.3 標準品溶液的配制 分別稱取19種干燥至恒重的標準品5.0 mg,用甲醇溶解,配制成1 mg/mL標準品溶液,于-18 ℃避光保存,作為儲備液,其他濃度標準品溶液用儲備液在70%甲醇稀釋下得到。

1.3 HPLC條件

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm×5 μm);流動相:乙腈(流動相A)和0.2%甲酸-水溶液(流動相B);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:256 nm、280 nm;進樣量20 μL。采用梯度洗脫,條件見表1。

1.4 標準曲線的繪制

將表2所示，混合標準品溶液用70%甲醇稀釋成6組不同的濃度梯度,按低到高濃度依次進行HPLC分析,平行測定3次,以平均峰面積y對標準品進樣質量x(μg)進行線性回歸,得出各標準品的回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)。以信噪比(S/N=3)確定各物質的最低檢測限(LOD)。

表2 混合標準品溶液中各標準品濃度Table 2 Concentration of each standard in mixed standards solution

1.5 樣品分析

將EEM和標準品溶液分別用0.45 μm有機濾頭過濾,濾液進HPLC分析。EEM和標準品溶液的分析結果利用G2170BALC化學工作站中的光譜數(shù)據(jù)和回歸時間進行一一比對,再結合各標準品的標準曲線,從而對EEM中19種酚類化合物進行定性定量分析。

1.6 加標回收率的計算

回收率(%)=(測得量-原有量)∕加入量×100

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件(IBM SPSS Statistics)進行數(shù)據(jù)處理,利用中藥指紋圖譜軟件進行圖譜相似度分析。

2 結果與分析

2.1 HPLC條件的優(yōu)化

分別在220、256、280、320和360 nm 5個波長下檢測混合標準品,發(fā)現(xiàn)在256 nm和280 nm檢測波長下出峰數(shù)及分離效果較好。在綜合考慮峰形、信號響應強弱、負峰等情況后,最終確定將標準品分為兩組(見表2),分別在256 nm和280 nm下檢測,分組后混合標準品的分離效果較好(圖1)。

圖1 256 nm(a)和280 nm(b)波長下兩組混合標準品的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 19 mixed standardsafter grouping detected under 256 nm(a)and 280 nm(b)注:1:沒食子酸;2:原兒茶酸;3:兒茶素;4:咖啡酸;5:p-香豆酸;6:阿魏酸;7:蘆丁;8:橙皮苷;9:楊梅酮;10:白藜蘆醇;11:黃豆苷元;12:肉桂酸;13:槲皮素;14:柚皮素;15:染料木素;16:山奈酚;17:橙皮素;18:對硝基苯甲酸;19:鷹嘴豆芽素A。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 線性關系與檢出限 將不同濃度梯度的混合標準品進行HPLC分析,得各標準品的線性范圍、回歸方程、檢出限等見表3。各標準品的相關系數(shù)均在0.9897～0.9999之間,表明在一定濃度范圍內(nèi)各標準品質量與峰面積相關性良好。各標準品的LOD最小的為0.4 μg/L(染料木素),最高的為58.1 μg/L(對硝基苯甲酸),表明高效液相色譜靈敏度較好,符合HPLC的定量要求。

2.2.2 精密度實驗 分別將兩組混合標準品溶液按表1所示條件進HPLC分析,每6 h測定一次,共測6次,考查保留時間及峰面積的重現(xiàn)性。結果如表4所示,發(fā)現(xiàn)各色譜峰峰面積的相對標準偏差(RSD)在1.19%～5.50%之間,保留時間的RSD在0.45%～5.37%之間,說明兩組混合標準品在測定時間內(nèi)性質穩(wěn)定。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗 將配制好的混合標準品溶液,放在4 ℃冰箱下保存,每隔2 h測定一次,后每隔1 d測定一次,連測4 d,考查混合樣品中各標準品的穩(wěn)定性,結果如表4所示。發(fā)現(xiàn)各色譜峰峰面積的RSD在0.93%～5.66%之間,保留時間的RSD在0.26%～4.59%之間,說明兩組混合標準品在測定時間內(nèi)性質穩(wěn)定。

表3 混合標準品保留時間、線性范圍、校正曲線及最低檢測限結果Table 3 Results of retention time,linear range,calibration curves and LOD of mixed standards

注:*表示檢測波長為256 nm;**表示檢測波長為280 nm。

表5 樣品的重復性Table 5 Repeatability of sample

表4 混合標準品的精密度、穩(wěn)定性和加標回收率Table 4 Precision and stability and recovery of mixed standards

圖2 在256 nm和280 nm波長下萌發(fā)1～7 d各綠豆醇提液的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC typical chromatograms of each samples ethanol extract during mung bean Seeds germination 1～7 d under 256 nm and 280 nm

2.2.4 重復性實驗 以20 mg/mL EEM為檢測對象,經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后進樣,每6 h測定一次,共測6次,考查保留時間及峰面積的重現(xiàn)性,結果見表5。發(fā)現(xiàn)色譜峰的個數(shù)和特征一致,主要色譜峰峰面積的RSD在1.21%～6.17%之間,保留時間的RSD在0.64%～3.50%之間,表明重復性良好,符合定量分析要求。

2.2.5 加標回收率 準確稱取2 g綠豆樣品,分別加入已知量的混合標準品溶液,充分混勻,按1.2.2中所述方法提取,在如表1的色譜條件下分別以20 μL進樣5次。結果如表4所示,發(fā)現(xiàn)標準品回收率在89.39%～106.82%之間,說明各標準樣品在提取過程中損失不大,提取方法和成分的穩(wěn)定性符合定量分析要求

2.3 EEM的HPLC圖譜相似度分析

分別對萌發(fā)1～7 d EEM進行了HPLC分析,并建立了256 nm和280 nm波長下EEM酚類化合物指紋圖譜,見圖2。從圖2中可明顯看出,綠豆種子在萌發(fā)過程中,酚類化合物種類和含量均有明顯變化。對EEM圖譜進行了相似度分析(見表6),發(fā)現(xiàn)256 nm下各個譜圖的相似度在0.322～0.919之間,280 nm下在0.347～0.624之間,其中第2 d和第7 d的譜圖與其它譜圖差異大,說明在第2 d和第7 d,EEM中物質變化較大。

表6 EEM 指紋圖譜相似度分析Table 6 Similarity analysis for typical HPLC chromatograms ethanol extract of mung bean

圖3 綠豆種子在萌發(fā)1～7 d過程中19種酚類化合物的含量變化Fig.3 Content changes of 19 kinds of phenolic compounds in mung bean seeds during germination 1～7 day注:不同小寫字母表示不同萌發(fā)時間之間差異顯著(p≤0.05)。

2.4 EEM中酚類化合物的定性定量分析

結合標準品對綠豆萌發(fā)過程中19種酚類化合物進行了定性定量分析。結果表明,綠豆在萌發(fā)1～7 d過程中,19種酚類化合物在第5 d全部檢出,其中沒食子酸和咖啡酸含量隨萌發(fā)時間的延長而增加,見圖3(A);蘆丁、黃豆苷元、山奈酚、p-香豆酸、阿魏酸和染料木素含量在第7 d達到最大值,分別為1574.5、114.3、80.3、43.3、207.9和45.3 μg/g,見圖3(B);槲皮素含量在第4 d達到最大值,原兒茶酸、橙皮苷、肉桂酸和柚皮素含量在第5 d達到最大值,分別為28.0、89.1、297.4、84.6和30.6 μg/g,見圖3(C);白藜蘆醇、對硝基苯甲酸和鷹嘴豆芽素A含量在第2 d達到最大值,分別為89.6、70.8和237.0 μg/g,見圖3(D);楊梅酮、兒茶素和橙皮素含量在第6 d達到最大值,分別為40.7、712.1和58.2 μg/g,見圖3(E);而綠豆種子在萌發(fā)過程中,19種酚類化合物總含量在第7 d有最大值3508.8 μg/g,見圖3(F)。

3 結論與討論

本文建立了同時測定綠豆醇提液中19種酚類化合物的HPLC方法,并用該方法對綠豆種子萌發(fā)1～7 d過程的19種酚類化合物進行了定性定量檢測,研究表明綠豆種子在萌發(fā)過程中19種酚類化合物的種類和總量均發(fā)生了明顯的變化。

綠豆種子在萌發(fā)初期,在呼吸作用和吸脹作用的條件下,主要黃酮C-糖苷被內(nèi)源性β-葡糖苷酶水解成糖苷配基芹黃素,也有可能從水解糖苷中獲得小分子物質如單糖提供能源,從而促進次生代謝產(chǎn)物的合成[21]。在萌發(fā)中期,由于苯丙氨酸裂合酶(PAL)活性增強以及氫氧根和配糖苷的加入,使得山奈酚、咖啡酸、槲皮素等酚類化合物含量增加。在萌發(fā)后期,可能由于在呼吸作用下,更多的活性氧和羥基自由基被合成[8,21],使膜脂質過氧化作用增強,導致含氧類黃酮增加,如蘆丁、兒茶素、染料木素等。研究結果為常用藥食同源植物綠豆中酚類化合物的含量提供了數(shù)據(jù)參考,具有較強的食用價值,也為研究綠豆種子萌發(fā)過程中的代謝組學提供了理論基礎。

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The contents dynamic change of phenolic compounds during the germination of mung bean seeds

CHEN Li,HUANG Xue-yong,ZHANG Ting-ting,LUO Li-ping*

(School of Life Sciences,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

This paper established a high performance liquid chromatography(HPLC)method for simultaneous determination of 19 kinds phenolic compounds in ethanol extract of mung bean(EEM),analysis of these chemical components during germination for 1～7 days by combining with the referent standards. The results showed that the type and total content of phenolics and polyphenolic increased during the germination. Gallic acid and caffeic acid contents increased during germination. Rutin,daidzein,keampferol,p-coumaric,ferulic acid and genistein reached their maximum levels at the 7th day,respectively 1574.5,114.3,80.3,43.3,207.9 and 45.3 μg/g. Quercetin contents at the 4th day had a maximum of 28.0 μg/g. Protocatechuic acid,hesperetin,cinnamic scid and naringenin contents showed their maximum levels at the 5th day,respectively 89.1,297.4,84.6 and 30.6 μg/g. Contents of resvaratrol,4-nitrobenzoic acid and biochanin A had their maximum at the 2th day,respectively 89.6,70.8 and 237.0 μg/g. Myricetin,protocatechuic acid and hesperetin exhibited their maximum levels at the 6th day,respectively 40.7,712.1 and 58.2 μg/g. The total content of 19 kinds of phenolic compounds at the 7th day had the maximum value,reaching 3508.8 μg/g. During the germination of mung bean seeds,due to more types of enzyme and activity increased,more secondary metabolites were synthesized,so phenolic compounds contents increased.

mung bean;seed germination;high performance liquid chromatography(HPLC);phenolic compounds

2016-07-06

陳麗(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：植物次生代謝產(chǎn)物，E-mail：1447169754@qq.com。

*通訊作者:羅麗萍(1972-)，女，博士，教授，主要從事植物學新技術、新方法，植物次生代謝產(chǎn)物方面的研究，E-mail：lluo2@126.com。

江西省教育廳項目(KJLD12051)；江西省科技廳項目(20123BCB22004)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.021