李景恩,趙 穎,陳 卓

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045)

乙醇分級法分離南酸棗多糖及其理化性質(zhì)和抗氧化性研究

李景恩,趙 穎,陳 卓

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045)

本文依次采用60%(v/v)和80%(v/v)的乙醇溶液對南酸棗粗多糖進(jìn)行分級沉淀,分別獲得兩個(gè)組分CAP-60和CAP-80,上清液部分冷凍干燥后標(biāo)記為CAP-S。采用分析化學(xué)法測得三個(gè)組分的中性糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)含量,并應(yīng)用紅外光譜儀分別檢測各組分的光譜學(xué)特征。最后通過DPPH自由基和羥基自由基清除及還原力實(shí)驗(yàn),檢測南酸棗多糖各組分的抗氧化活性。結(jié)果表明CAP-60、CAP-80和CAP-S的總糖含量分別為94.95%±2.51%、71.50%±2.02%、35.18%±2.06%,且三個(gè)組分中均含有糖醛酸,與紅外光譜圖中1700～1600 cm-1附近的吸收峰一致。在上述三種抗氧化體系中,CAP-S均表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化能力,但在最高濃度下仍略次于抗壞血酸。

南酸棗多糖,乙醇分級法,理化性質(zhì),抗氧化性

南酸棗系漆樹科南酸棗屬植物,其果實(shí)又名五眼果、山棗、醋酸果等,主要分布于我國的湖北、湖南、廣東、廣西、福建、云南、浙江、貴州和江西等地。南酸棗鮮果為金黃色,呈橢圓形,其滋味酸中帶甜,常被用作水果新鮮食用或加工成酸棗糕、飲料等食品,食之具有助消化、增食欲、治療食滯腹痛、便秘等功效[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)南酸棗果實(shí)、果皮和棗核中含有豐富的酚酸類、黃酮類、甾醇類、胸腺嘧啶脫氧尿苷類及脂肪族類等藥用成分[3-6]。此外,趙玉英等[7]在其成熟的干燥果實(shí)(廣棗)中提取到大量多糖成分(總含量約18.1%),其中水溶性多糖占9.8%,主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖組成。然而,南酸棗鮮果中的多糖尚未見有關(guān)報(bào)道。

目前常見的多糖純化方法主要有分級沉淀法(乙醇、中性鹽等)、季銨鹽沉淀法、柱層析法(離子交換柱、凝膠柱、親和層析柱等)、超濾法等[8]。其中分級沉淀法由于具有操作簡單,分離速度快等優(yōu)點(diǎn),而常被優(yōu)先考慮。該方法根據(jù)不同分子量多糖在一定濃度的乙醇或中性鹽溶液中具有不同的溶解度而進(jìn)行分離[9]。因此本文首先利用傳統(tǒng)的熱水浸提法得到南酸棗鮮果中的粗多糖,然后采用乙醇分級沉淀法對其進(jìn)行初步分離純化,并測定所得各組分的中性糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)含量及其抗氧化活性。研究結(jié)果旨在幫助開發(fā)南酸棗鮮果中的多糖成分,為后續(xù)的結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究奠定前期基礎(chǔ),同時(shí)也為開發(fā)一種新型天然抗氧化制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮南酸棗 采自江西省贛州市崇義縣,洗凈、去核、烘干、粉碎后備用;濃硫酸、磷酸、水楊酸、三氯乙酸、無水乙醇、丙酮、無水乙醚、30%雙氧水、苯酚、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖、牛血清蛋白(BSA)、四硼酸鈉、m-羥基聯(lián)苯、3-苯基苯酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、抗壞血酸 阿拉丁試劑(上海)有限公司;DPPH、光譜純溴化鉀、半乳糖醛酸 美國Sigma公司。

V-5600型紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;METTLER-TOLEDO AL104型電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Milli-Q型超純水制備系統(tǒng) 美國Millipore公司;101A-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;HH-60型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱 常州國華儀器有限公司;SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DZF-6090Z型真空干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;YP-2型壓片機(jī) 上海山岳科學(xué)儀器有限公司;Nicolet iS5型傅立葉變換紅外光譜儀 美國熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南酸棗粗多糖的制備 稱取20.0 g粉碎過的南酸棗干燥果實(shí),加入800 mL蒸餾水,于100 ℃下提取5 h后過濾。將濾液濃縮至一定體積,然后加入3倍體積的無水乙醇,置于4 ℃冰箱過夜,再以4800 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,所得沉淀部分即為南酸棗粗多糖(CAP)。最后分別以無水乙醇、丙酮和無水乙醚各洗滌2次,冷凍干燥后備用。

1.2.2 乙醇分級法分離南酸棗粗多糖 精密稱取3.0 g上述南酸棗粗多糖,以一定量的蒸餾水復(fù)溶,緩慢均勻地加入無水乙醇。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%(v/v)時(shí),溶液中出現(xiàn)大量沉淀,于4 ℃靜置12 h后,再于4800 r/min下離心10 min,沉淀冷凍干燥后得組分CAP-60。繼續(xù)向上清液中添加無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%(v/v),第二次出現(xiàn)大量沉淀時(shí),重復(fù)上述步驟,得組分CAP-80。剩余上清液部分濃縮、冷凍干燥后標(biāo)記為CAP-S,分別計(jì)算各組分得率。

1.2.3 理化性質(zhì)測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,苯酚-硫酸法測定中性糖含量[10];以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品,間羥聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[11];以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品,考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[12]。所有樣品重復(fù)測定3次,取其平均值。

1.2.4 紅外光譜測定 分別稱取1～2 mg干燥的多糖樣品,按1∶200的比例混合加入光譜純的KBr晶體,一起研磨成粉后壓片,利用傅立葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.5 抗氧化活性研究 分別通過DPPH自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)清除及還原力實(shí)驗(yàn),檢測南酸棗多糖各組分的抗氧化活性。

1.2.5.1 DPPH·清除率測定 取不同質(zhì)量濃度的多糖溶液(78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mL)各2.0 mL于試管中,分別加入40 μg/mL新鮮配制的DPPH-乙醇溶液2.0 mL,避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長處測定吸光度(Ai)。再取上述多糖液2.0 mL,加入2.0 mL去離子水,放置30 min,于517 nm處測定吸光度(Aj),作為樣品的本底吸收。取2.0 mL DPPH-乙醇溶液,加入2.0 mL 無水乙醇,放置30 min后測定吸光度(A0),作為空白對照。每個(gè)濃度的樣品重復(fù)測定3次取平均值。以抗壞血酸作為陽性對照,DPPH·的清除率計(jì)算公式為:

式(1)

1.2.5.2 ·OH清除率測定 反應(yīng)體系中依次加入6 mmol/L FeSO41 mL,6 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL,以及不同濃度的南酸棗多糖1 mL(78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mL)。最后加入1 mL 6 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng),于37 ℃反應(yīng)1 h。以蒸餾水代替多糖樣品作空白對照,抗壞血酸作陽性對照,于510 nm下測定各樣品的吸光度。每組樣品均以1 mL蒸餾水代替1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇作為樣品的本底吸收。·OH清除率的計(jì)算公式為:

式(2)

其中，A0為空白對照的吸光度,A1為加入多糖或陽性對照的吸光度,A2為不加水楊酸-乙醇的樣品本底吸收。

1.2.5.3 還原力測定 根據(jù)Chen Jingjing等的測定方法[13],取2 mL不同濃度的多糖樣品(78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mL),分別與2.0 mL PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.0 mL鐵氰化鉀溶液[K3Fe(CN)6](1%,w/v)混合均勻,然后于50 ℃水浴中保溫20 min。向反應(yīng)液中加入2.5 mL三氯乙酸(10%,w/v)終止反應(yīng),然后于3000 r/min離心10 min。取2.0 mL上清液與2.0 mL蒸餾水和1.0 mL FeCl3(0.1%,w/v)混勻,靜置10 min,然后于700 nm測定吸光度,以相同濃度的抗壞血酸作陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

表1 不同濃度乙醇制備南酸棗多糖的得率和化學(xué)組成分析Table 1 The yields and chemical composition of Choerospondias axillarispolysaccharides precipitated by different concentrations of ethanol

注:a指粗多糖CAP的質(zhì)量占南酸棗原材料干重的百分比;b指乙醇分級沉淀所得各組分的質(zhì)量占溶解時(shí)所使用粗多糖干重的百分比。

水提醇沉法制備的南酸棗粗多糖經(jīng)不同濃度的乙醇分級沉淀后得到三個(gè)新的組分CAP-60、CAP-80和CAP-S,其得率和化學(xué)組成分析見表1。由表1可知,粗多糖CAP的總糖含量為84.48%±0.39%,CAP-60的總糖含量最高(94.95%±2.51%),得率也最高(61.02%),說明該段提取物為粗多糖的主要組分。3個(gè)組分中都檢測到蛋白質(zhì)和糖醛酸,說明它們都屬于酸性糖蛋白復(fù)合物。

2.2 紅外光譜分析

ACP-60、ACP-80和ACP-S的紅外光譜見圖1。由于多糖結(jié)構(gòu)具有一定相似性,因此它們的紅外光譜圖也具有某些相似的特征吸收峰。圖1中,3種多糖在3600～3200 cm-1附近均具有較寬的吸收峰,即多糖的O-H伸縮振動(dòng),而3000～2800 cm-1處的小肩峰為C-H(CH,CH2和-CH3)的伸縮振動(dòng)[14]。

圖1 CAP-60、CAP-80和CAP-S的紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of CAP-60,CAP-80 and CAP-S

3種多糖在1700～1600 cm-1附近均有明顯的吸收峰,為-COOH中C=O的不對稱伸縮振動(dòng),說明多糖結(jié)構(gòu)中含有糖醛酸,與表1結(jié)果一致。其中1630 cm-1處的強(qiáng)吸收峰代表游離羧基中C=O的伸縮振動(dòng),而1740 cm-1處的吸收峰則代表羧基被酯化后C=O的伸縮振動(dòng),二者面積之比可用于計(jì)算果膠類多糖的酯化度[15-16]。

1000 cm-1附近的吸收峰是由吡喃糖環(huán)C-O-C結(jié)構(gòu)中兩種C-O鍵的伸縮振動(dòng)引起的[17]。1000～800 cm-1間有許多弱小吸收峰,證明β-D-吡喃葡萄糖環(huán)的存在[18]。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH·清除率 如圖2所示,3種多糖對DPPH·均具有一定的清除能力,且隨多糖濃度的增加,各組分對DPPH·的清除率也逐漸增加。當(dāng)濃度為1250 μg/mL時(shí),CAP-S對DPPH·的清除率為90.3%,CAP-60和CAP-80的清除率分別為23.7%和11.5%,說明南酸棗多糖對DPPH·具有較好的清除能力,且分子量小的組分比分子量大的清除效果更好。由圖2可見,濃度在78.1～1250 μg/mL范圍時(shí),CAP-S對DPPH·的清除率隨濃度增加而明顯上升;濃度大于1250 μg/mL時(shí),其清除率趨于平緩。計(jì)算可得各樣品的IC50值分別為CAP-S(373 μg/mL)

圖2 南酸棗多糖對DPPH·的清除率Fig.2 DPPH· scavenging rate of Choerospondias axillaries polysaccharides

2.3.2 ·OH清除率 圖3為3種南酸棗多糖組分對·OH清除率的影響。隨多糖濃度的增加,3種多糖對·OH的清除率均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系,其中CAP-S的清除作用最強(qiáng)。5000 μg/mL濃度下,CAP-S對·OH的清除率為84.0%,與馬齒莧多糖、榆耳菌絲體多糖相似[20-21]。該濃度下,CAP-60和CAP-80的清除率只有13.19%和19.14%。計(jì)算CAP-S的IC50值為1888 μg/mL,略高于百合多糖(IC50=1040 μg/mL)[22],而遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于黃連多糖(IC50>3880 μg/mL)[23]。本實(shí)驗(yàn)中抗壞血酸的IC50值為485 μg/mL,說明CAP-S對·OH的半清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及陽性對照組。

圖3 南酸棗多糖對·OH的清除率Fig.3 Hydroxyl radical(·OH)scavenging rate of Choerospondias axillaries polysaccharides

圖4 南酸棗多糖的還原力測定Fig.4 The reducing power of Choerospondias axillaries polysaccharides

2.3.3 還原力 還原力是評價(jià)多糖抗氧化性的另一項(xiàng)重要指標(biāo),與多糖的抗氧化能力直接相關(guān)[24]。吸光度越大,代表樣品的還原力越大。由圖4可知,抗壞血酸、CAP-60、CAP-80和CAP-S對Fe3+均具有一定的還原能力,強(qiáng)弱順序?yàn)榭箟难?CAP-S>CAP-60>CAP-80,其中CAP-60和CAP-80無顯著性差異。2500 μg/mL濃度下CAP-S吸光值達(dá)到1.733,還原力為抗壞血酸的57.8%,計(jì)算此時(shí)CAP-60和CAP-80的還原力僅為抗壞血酸的11.7%和11.0%。通過與文獻(xiàn)對比發(fā)現(xiàn),南酸棗多糖CAP-S的還原力明顯高于大蒜多糖[25]、槐花多糖[26]、紅參多糖[27]等。

3 結(jié)論

本文采用不同濃度的乙醇從南酸棗粗多糖中依次沉淀出3個(gè)新組分CAP-60、CAP-80和CAP-S,并初步分析它們的基本化學(xué)組成、紅外光譜性質(zhì)及抗氧化活性。結(jié)果表明3種多糖結(jié)構(gòu)中均含有糖醛酸和少量蛋白質(zhì),說明它們都屬于酸性糖蛋白復(fù)合物,其中CAP-60的糖醛酸含量高達(dá)70.373%±0.836%。紅外光譜顯示,CAP-60、CAP-80和CAP-S在3600～3200 cm-1和3000～2800 cm-1區(qū)域內(nèi)都出現(xiàn)糖類物質(zhì)典型的特征吸收峰,且在1700～1600 cm-1附近具有明顯的糖醛酸吸收峰?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各多糖組分清除DPPH·和·OH的能力及對Fe3+的還原力都隨多糖濃度升高而增加,呈現(xiàn)一定的正相關(guān)。3種體外抗氧化體系中,CAP-S的抗氧化能力明顯高于CAP-60和CAP-80。其清除DPPH·及·OH的IC50值分別為373 μg/mL和1888 μg/mL,可見CAP-S清除DPPH·的能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于清除·OH的能力,而其在最高濃度下對還原Fe3+的能力與抗壞血酸相同。

綜上,本研究不僅確定了南酸棗鮮果中多糖的基本化學(xué)組成,同時(shí)也驗(yàn)證了其體外抗氧化能力,從而為后續(xù)研究其抗氧化機(jī)理,其他生物學(xué)活性,結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性等內(nèi)容奠定了基礎(chǔ)。

[1]羅登宏. 野生南酸棗發(fā)酵保健飲料的研制[J]. 中國釀造,2010(1):164-166.

[2]劉曉庚,陳優(yōu)生. 南酸棗果實(shí)的成分分析[J]. 中國野生植物資源,2000,19(3):35-40.

[3]邰文泉,白玉霞. 蒙藥廣棗的提取工藝和化學(xué)成分研究新進(jìn)展[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2006,21(1):65-66.

[4]王鳳華,楊玉梅. 蒙藥廣棗及其總黃酮的研究進(jìn)展[J]. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,20(3):258-260.

[5]李長偉,崔承彬,蔡兵,等. 南酸棗的芳香族化合物及其體外抗腫瘤活性[J]. 中國藥物化學(xué)雜志,2005,15(3):138-141,147.

[6]樊海燕,宋一亭,賽音. 廣棗中一種胸腺嘧啶脫氧尿苷的分離與鑒定[J]. 中國天然藥物,2005,3(2):83-85.

[7]趙玉英,海平,孫占才,等. 蒙藥廣棗中多糖的組分分析和糖含量測定[J]. 藥物分析雜志,2001,21(6):440-442.

[8]方積年,丁侃. 天然藥物——多糖的主要生物活性及分離純化方法[J]. 中國天然藥物,2007,5(5):338-347.

[9]劉銳. 多糖類物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(9):1722-1725.

[10]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry,1956,28(3):350-356.

[11]Blumenkrantz N,Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids[J]. Analytical Biochemistry,1973,54(2):484-489.

[12]李婷婷,張暉,吳彩娥,等. 油茶籽糖蛋白提取工藝優(yōu)化及抗氧化性[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2012,43(4):148-155.

[13]Chen J J,Zhang T,Jiang B,et al. Characterization and antioxidant activity of Ginkgo biloba exocarp polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers,2012,87(1):40-45.

[14]孫延芳,梁宗鎖,單長卷,等. 野生棗果硒多糖純化與光譜分析[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2011,42(6):148-151.

[15]Manrique G D,Lajolo F M. FT-IR spectroscopy as a tool for measuring degree of methyl esterification in pectins isolated from ripening papaya fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2002,25(1):99-107.

[16]Chatjigakis A K,Pappas C,Proxenia N,et al. FT-IR spectroscopic determination of the degree of esterification of cell wall pectins from stored peaches and correlation of textural changes[J]. Carbohydrate Polymers,1998,37(4):395-408.

[17]周慧吉,馬海樂,郭丹釗,等. 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇沉淀桑黃胞內(nèi)多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué),2015,36(19):34-38.

[18]李紅法,郭松波,滿淑麗,等. 乙醇分級沉淀提取黃芪多糖及其理化性質(zhì)和抗氧化活性研究[J]. 中國中藥雜志,2015,40(11):2112-2116.

[19]孟憲軍,劉曉晶,孫希云,等. 藍(lán)莓多糖的抗氧化性與抑菌作用[J]. 食品科學(xué),2010,31(17):110-114.

[20]姚秋萍,姚芝榮. 馬齒莧多糖的乙醇分級純化及抗氧化研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(8):3656-3658.

[21]王應(yīng)男,張公亮,劉洋,等. 榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(12):194-196,213.

[22]王多寧,張小莉,楊穎,等. 百合多糖對羥基自由基的清除作用[J]. 陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,29(4):53-55.

[23]王偉,劉世軍,安法娥,等. 黃連多糖提取、分離純化鑒定及清除羥基自由基能力測定[J]. 山東醫(yī)藥,2013,53(10):79-82.

[24]Meir S,Kanner J,Akiri B,et al. Determination and involvement of aqueous reducing compounds in oxidative defense systems of various senescing leaves[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1995,43:1813-1819.

[25]李朝陽,劉魁,韓忠宵,等. 大蒜多糖的酶法提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué),2008,29(1):117-120.

[26]王麗華,段玉峰,馬艷麗,等. 槐花多糖的提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,36(8):213-217,228.

[27]許海順,蔣劍平,徐攀,等. 紅參多糖抗氧化活性的研究[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,35(6):909-912.

Physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides isolated fromChoerospondiasaxillarisby ethanol fractional precipitation method

LI Jing-en,ZHAO Ying,CHEN Zhuo

(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Two new polysaccharides(CAP-60 and CAP-80)were fractionated from the crude polysaccharides ofChoerospondiasaxillarisby 60%(v/v)and 80%(v/v)ethanol,successively. A third fraction CAP-S was obtained from the supernatant by freeze drying. Neutral sugar,uronic acid and protein contents were determined by analytical chemistry methods,and their spectral characteristics were determined by FTIR spectrometer. DPPH free radical and hydroxyl radical scavenging test,as well as reducing power were applied to evaluate the antioxidant activities of these three fractions. The results indicated that the total sugar of CAP-60,CAP-80 and CAP-S were 94.95%±2.51%,71.50%±2.02% and 35.18%±2.06%,respectively. They all contained uronic acids in their structures,which were consistent with the absorption peaks of 1700～1600 cm-1in the infrared spectrum. What’s more,CAP-S possessed the strongest antioxidant activities among these three antioxidant systems above,but was still inferior to ascorbic acid even under the highest concentration.

Choerospondiasaxillariespolysaccharides;ethanol fractional precipitation;physicochemical properties;antioxidant activities

2016-06-17

李景恩(1984-)，女，博士，講師，研究方向：天然多糖的分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究，E-mail：enen928@163.com。

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(GJJ150433)；江西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)費(fèi)(9232305199)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.016