楊園園,史 娟,徐添鑫

(陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西漢中 723000)

如意草生物堿提取及抑菌活性研究

楊園園,史 娟*,徐添鑫

(陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,陜西漢中 723000)

通過(guò)采用單因素及正交實(shí)驗(yàn),以如意草中生物堿的光吸收值為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),優(yōu)化如意草生物堿的最佳提取工藝為:以乙醇為溶劑時(shí),乙醇濃度75%,料液比1∶10,超聲時(shí)間120 min,超聲溫度40 ℃。在此條件下,如意草生物堿提取率最高,達(dá)到1.656%。此外,研究了如意草生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌的抑菌活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:如意草生物堿對(duì)四種供試菌種均有明顯抑制作用,對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌最低抑菌濃度分別為40、50、40、50 μg/mL。

如意草,生物堿,超聲波提取,抑菌活性

如意草(CorydalistaliensisFr.)是罌粟科紫堇屬植物,別名大理紫堇、斷腸草、水黃連、水如意、五味草,主要分布于四川、貴州、云南等地。如意草味苦,性寒,歸肺、肝經(jīng),具有祛風(fēng)、清熱、止痛和清肝明目等作用[1]。罌粟科植物富含生物堿,全世界有43個(gè)屬,約700種,主要分布在北溫帶[2]。目前,如意草中已被鑒定有出含有七個(gè)生物堿[3],包括紫堇靈堿(corynoline)、原阿片堿(protopine)、乙酰紫堇靈(acetylcorynoline)、消旋紫堇靈(±)corynoline、必枯枯靈bicucline等,并被證實(shí)具有抗菌、鎮(zhèn)靜及保護(hù)肝臟損傷等多種活性作用[4]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),如意草中含有的生物堿成分,如原阿片堿、乙酰紫堇靈、紫堇靈堿等多具有廣泛的藥理活性[5],是許多中草藥及藥用植物的有效成分[6-8],具有消炎、抗菌[9]等多種特點(diǎn)。國(guó)外最新報(bào)道,紫堇靈生物堿在抗壞血病問(wèn)題上有較大潛力,而乙酰紫堇靈通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的功能有望成為提高免疫力的藥劑之一[10-12]。生物堿常用的提取方法有水或偏酸性水溶液提取、醇提法[13]、親脂有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法[14]。

國(guó)內(nèi)對(duì)如意草的研究報(bào)道較少,利用超聲技術(shù)對(duì)如意草中生物堿類(lèi)物質(zhì)的提取還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。超聲波提取法能提高有效成分的溶出速度和溶出次數(shù)、縮短提取時(shí)間、節(jié)省溶劑的消耗、提取率高[15],本文采用超聲波提取法提取如意草中的生物堿,同時(shí)對(duì)超聲波提取工藝進(jìn)行探討,采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳提取條件,為如意草生物堿的開(kāi)發(fā)和利用提供客觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

近年來(lái),國(guó)內(nèi)對(duì)如意草生物堿的抑菌作用還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為了更好地開(kāi)發(fā)利用如意草資源,本文采用幾種常用的抑菌方法(尹愛(ài)武[16]、何水平[17]等人在抑菌實(shí)驗(yàn)中的研究)對(duì)如意草生物堿對(duì)四種供試菌種的抑菌作用進(jìn)行探索,為如意草生物堿的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

如意草 2014年10月份采自陜西省榆林山區(qū),清洗去雜后置于烘箱內(nèi)50 ℃下烘干至恒重,粉碎成60目后,裝袋放置備用;鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 上海金穗生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、溴甲酚綠、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯仿等試劑 均為分析純;胰蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;革蘭氏陽(yáng)性菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella) 陜西理工學(xué)院生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

AL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Cary50型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安中國(guó)有限公司;DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RE-2A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公;SW-CJ-IB型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;SHP-80型生化培養(yǎng)箱 上海森德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SB3200DTDN超聲波清洗機(jī) 寧波斯芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取3.75 mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品,溶于少量蒸餾水中定容至25 mL,配成150 mg/L的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL移入25 mL刻度比色管中,分別加入1 mL蒸餾水、2 mL溴甲酚綠緩沖溶液(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液配制的0.04%溴甲酚綠溶液)、4 mL pH為5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液及5 mL三氯甲烷,充分振蕩搖均勻后靜置1 h觀察,以三氯甲烷做為參比,在414 nm處測(cè)定不同濃度鹽酸小檗堿的吸光度,得到鹽酸小檗堿濃度C(mg/mL)與吸光度A的回歸方程。

1.2.2 如意草生物堿的提取方法 稱(chēng)取一定質(zhì)量的如意草粉末,加入75%乙醇溶液作為溶劑浸泡12 h后,用超聲波提取、抽濾,收集濾液,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到浸膏,再用檸檬酸溶解浸膏,調(diào)其pH至2.5,再用無(wú)水Na2CO3調(diào)pH至10.5,即得到粗產(chǎn)物生物堿沉淀,離心后棄去上層清夜,在下層沉淀中加入10 mL乙醇溶解[18-21],在414 nm處測(cè)其吸光度并計(jì)算提取率。

如意草生物堿提取率(%)=(C×V×n)/m×100

其中,C為如意草生物堿濃度,V為提取體積,n為稀釋倍數(shù),m為原料質(zhì)量。

1.2.3 如意草生物堿的單因素實(shí)驗(yàn) 以如意草生物堿的吸光值為指標(biāo),分別考察乙醇濃度、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度4個(gè)因素對(duì)提取率的影響,每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)梯度,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),各單因素實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并取平均值。

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)生物堿提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g如意草粉末5份,置于5個(gè)錐形瓶中,按1.2.2中的方法超聲波提取,在料液比1∶25,超聲時(shí)間120 min,超聲溫度70 ℃的條件下,改變乙醇濃度為55%、65%、75%、85%、95%,考察乙醇濃度對(duì)生物堿吸光度的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)生物堿提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g如意草粉末5份,置于5個(gè)錐形瓶中,以85%乙醇為溶劑,固定超聲溫度70 ℃,超聲時(shí)間120 min,改變料液比為1∶10、1∶20、1∶25、1∶35、1∶45,考察料液比對(duì)生物堿吸光度的影響。

1.2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)生物堿提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g如意草粉末5份,置于5個(gè)錐形瓶中,以85%乙醇為溶劑,固定料液比1∶20,超聲溫度70 ℃,改變超聲時(shí)間為60、90、120、150、180 min,考察超聲時(shí)間對(duì)生物堿吸光度的影響。

1.2.3.4 超聲溫度對(duì)生物堿提取率的影響 準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g如意草粉末5份,置于5個(gè)錐形瓶中,以85%乙醇為溶劑,固定料液比1∶20,超聲時(shí)間120 min,改變超聲溫度為40、50、60、70、80 ℃,考察超聲溫度對(duì)生物堿吸光度的影響。

1.2.4 如意草生物堿的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比為因素,設(shè)計(jì)L9(34)實(shí)驗(yàn)以確定如意草生物堿提取的最佳工藝條件,各因素水平的設(shè)定如表1所示。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiments

1.2.5 如意草生物堿抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 如意草生物堿的制備 取如意草粉末5 g,加入50 mL 75%乙醇,超聲時(shí)間120 min、超聲溫度40 ℃,此時(shí)如意草生物堿的濃度為100 mg/mL,將得到的如意草生物堿取100 μL用無(wú)菌水稀釋配制成濃度分別為0.05、0.2、0.3、0.8、1.07 mg/mL的如意草生物堿濃度溶液,此時(shí)乙醇的體積在溶液中含量不足百分之一可以忽略其對(duì)抑菌的影響。

1.2.5.2 菌懸液的制備 在超凈工作臺(tái)中,將四種供試菌種用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃在搖床上振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌種活化,挑取活化的菌種于平板LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種分離純化(防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的交叉感染應(yīng)定期純化菌種,使實(shí)驗(yàn)更加準(zhǔn)確可靠),用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基中,對(duì)純化的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),最后將菌液稀釋配制成含菌量106cfu/mL的菌懸液,備用。

1.2.5.3 牛津杯法測(cè)定如意草生物堿抑菌效果 將已干燥滅菌的不銹鋼牛津杯(內(nèi)孔直徑為6 mm)用無(wú)菌鑷子夾取平放在含菌平板上,每個(gè)含菌平板上呈“品”字形放置3個(gè)牛津杯,分別在每個(gè)牛津杯中加入200 μL(濃度為1.07、0.8、0.3、0.2、0.05 mg/mL)的如意草生物堿,無(wú)菌水做對(duì)照,每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。將平板置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,取出后測(cè)量牛津杯抑菌圈直徑,每組測(cè)定6次取其平均值。

1.2.5.4 如意草生物堿最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 參考微量肉湯稀釋法[22-23],對(duì)如意草生物堿進(jìn)行MIC的測(cè)定。將如意草生物堿樣品溶解在無(wú)菌水中,配制成樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL,經(jīng)計(jì)算,得到系列如意草生物堿質(zhì)量濃度為:30、40、50、60、70 μg/mL。實(shí)驗(yàn)組每支試管加入20 μL菌液及一定體積的LB液體培養(yǎng)基和一定體積的樣品(表2),對(duì)照組只加20 μL菌液100 μL無(wú)菌水和100 μL的LB液體培養(yǎng)基。將試管置于37 ℃的搖床上振蕩培養(yǎng)16～18 h,取出,觀察試管中液體的渾濁情況。液體澄清的為無(wú)菌生長(zhǎng),渾濁的為有菌生長(zhǎng)。以第幾號(hào)試管以下不再發(fā)生明顯渾濁現(xiàn)象,這一試管的濃度即為該細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)。

表2 如意草生物堿的試管實(shí)驗(yàn)Table 2 Test on alkaloids of Corydalis taliensis Fr.

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù),取平均值,數(shù)據(jù)分析采用Origin8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

以鹽酸小檗堿濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為:A=2.18452C-0.38939,R2=0.99326,表明鹽酸小檗堿的濃度(mg/mL)與吸光度有良好的線性關(guān)系,可將其用于提取率的測(cè)定中。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 最佳乙醇濃度的選擇 以吸光值為指標(biāo),如意草生物堿的吸光度越大提取率就越高。如圖1所示,在乙醇濃度為55%～85%內(nèi),隨著乙醇濃度的增大,如意草生物堿的吸光度逐漸增大,這是因?yàn)樯飰A類(lèi)物質(zhì)較易溶于乙醇,乙醇濃度越大,如意草生物堿的溶出效果越好。當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí),如意草生物堿測(cè)得的吸光度最大。但當(dāng)乙醇濃度過(guò)高時(shí),吸光度下降,可能是因?yàn)橐掖紳舛冗^(guò)高,其它一些醇溶性雜質(zhì)溶出也增多,影響了如意草生物堿的溶出。因此提取如意草生物堿時(shí),選擇乙醇濃度為85%最佳。

圖1 不同乙醇濃度的提取效果Fig.1 Results of different ethanol concentration

2.1.2 最佳料液比的選擇 從圖2可知,如意草生物堿的吸光度隨著料液比增加先是大幅度升高,然后逐漸呈現(xiàn)不同幅度的下降,料液比在1∶20時(shí),如意草生物堿的吸光度達(dá)到最大值,之后隨料液比的增大而不斷降低,這是由于在一定范圍內(nèi)增加提取劑用量過(guò)大反而不利于如意草生物堿的溶出,從而造成影響提取效果;而溶劑過(guò)多則會(huì)吸收超聲波輻射能力,因而影響生物堿的溶出,從而影響產(chǎn)率。故選擇料液比1∶20最佳。

圖2 不同料液比的提取效果Fig.2 Results of different material/liquid ratio

2.1.3 最佳超聲時(shí)間的選擇 從圖3可以看出,在一定范圍內(nèi),如意草生物堿的吸光度隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷提高,但當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)120 min后,提取率逐漸變小,這可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理影響了部分如意草生物堿的組成及結(jié)構(gòu),并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),溶劑揮發(fā)也越多,進(jìn)一步影響提取率。故選擇120 min為最佳超聲時(shí)間。

圖3 不同超聲時(shí)間的提取效果Fig.3 Extraction effect of different ultrasonic time

2.1.4 最佳超聲溫度的選擇 從圖4可以看出,超聲溫度為40～50 ℃時(shí),如意草生物堿的吸光度隨溫度的升高而增大,溫度高于50 ℃時(shí),吸光度下降。這是由于溫度過(guò)高,溶劑揮發(fā)損失,導(dǎo)致生物堿提取不完全,也可能會(huì)破壞如意草中的一些成分結(jié)構(gòu)。因此,選擇50 ℃為最佳超聲溫度。

圖4 不同超聲溫度的提取效果Fig.4 Extraction effect of different ultrasonic temperature

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表3可知,各因素對(duì)如意草生物堿吸光度的影響大小是D>C>B>A,即超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比>乙醇濃度。如意草生物堿的最佳提取工藝條件是A1B1C2D1,即乙醇濃度為75%,料液比為1∶10,超聲時(shí)間為120 min,超聲溫度為40 ℃。由表4方差分析結(jié)果可知,F比

表5 不同濃度的如意草生物堿的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of different concentration on alkaloids of Corydalis taliensis Fr.

注:6.00 mm(牛津杯內(nèi)徑),表示未觀察到明顯抑菌圈。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性,按上述最佳條件:乙醇濃度為75%,料液比為1∶10,超聲時(shí)間為120 min,超聲溫度為40 ℃,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值為5.641,并計(jì)算出如意草生物堿的提取率,得到的平均提取率為1.656%。

2.3 牛津杯法測(cè)定如意草生物堿的抑菌活性

2.3.1 如意草生物堿的抑菌效果 以牛津杯法測(cè)定的抑菌圈直徑為指標(biāo),評(píng)價(jià)如意草生物堿對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的抑菌效果[24]:無(wú)抑菌圈者為抑菌效果不明顯、抑菌圈直徑7～9 mm為低度抑菌、抑菌圈直徑10～15 mm為中度抑菌、抑菌圈直徑>15 mm為高度抑菌。如意草生物堿對(duì)四種供試菌種的抑菌效果見(jiàn)表5,由表5可知如意草生物堿對(duì)2種具有致密細(xì)胞壁的革蘭氏陽(yáng)性菌和2種細(xì)胞壁較疏松的革蘭氏陰性菌都有不同程度的抑菌作用,具有抑菌活性。此外,如意草生物堿對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最強(qiáng),對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑制作用相當(dāng),對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制能力較差。隨著提取物濃度的增大,其抑菌活性逐漸增強(qiáng)。由此可見(jiàn),如意草生物堿具有一定的抑菌能力。

2.3.2 如意草生物堿最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 如意草生物堿對(duì)四種細(xì)菌的最低抑菌濃度如表6所示,由表6中可知,如意草生物堿對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌濃度各不相同,最低抑菌濃度(MIC)分別40、40、50、50 μg/mL。隨著如意草生物堿濃度增大,抑菌活性也在逐漸增強(qiáng)。如意草生物堿對(duì)四種菌抑制能力最強(qiáng)的是大腸桿菌和沙門(mén)氏菌,其總的抑菌活性順序:大腸桿菌=沙門(mén)氏菌<金黃色葡萄球菌=枯草芽孢桿菌。

表6 如意草生物堿對(duì)供試菌種的最低抑菌濃度(MIC)Table 6 Minimal inhibitory concentration(MIC)of alkaloids of Corydalis taliensis Fr.different strains

注:-表示無(wú)菌生長(zhǎng);+表示菌生長(zhǎng)少;++表示菌生長(zhǎng)較多;+++表示菌生長(zhǎng)多。3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用超聲波法對(duì)如意草生物堿進(jìn)行了提取,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到如意草生物堿的最佳提取工藝是:乙醇濃度75%,料液比1∶10,超聲時(shí)間120 min,超聲溫度40 ℃,該條件下如意草生物堿的提取率為1.656%。

3.2 如意草生物堿的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度的如意草生物堿對(duì)供試的4種細(xì)菌,呈現(xiàn)不同的抑制作用。其中,1.07 mg/mL的生物堿對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制能力最強(qiáng),其次為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,沙門(mén)氏菌的抑菌效果最弱;其中枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為40 μg/mL,大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的MIC為50 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)表明,用超聲波提取如意草生物堿的方法可行,具有提取率較高、時(shí)間短、溫度低等特點(diǎn),以乙醇為介質(zhì)對(duì)如意草生物堿進(jìn)行超聲波處理,有利于生物堿的提取。另外,此生物堿具有較明顯的抑菌活性,從資源利用的角度來(lái)看,如意草也具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。

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Extraction and antibacterial activity of alkaloidsfrom theCorydalistaliensisFr.

YANG Yuan-yuan,SHI Juan*,XU Tian-xin

(Chemistry and Environmental Science,Dept.,Shaanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723000,China)

To select the basicextracting way of alkaloid from theCorydalistaliensisFr. with ultrasonic,the best one was selected with absorbency of alkaloid as index by single factor test and orthogonal test. The results showed the optimum extraction conditions were as follow:the concentration of ethanol 75%,material to liquid ratio was 1∶10,ultrasonic time was 120 min and ultrasonic temperature was 40 ℃.The alkaloidsextraction yield could reach 1.656% in the optimum conditions. In addition to,the antibacterial activities of alkaloidCorydalistaliensisFr. was determined. The minimum inhibitory concentration(MIC)ofCorydalistaliensisFr. alkaloidon Staphylococcus aureus,Escherichiacoli,BacillussubtilisandSalmonellatyphimuriumwas 40,50,40,50 μg/mL,respectively.

CorydalistaliensisFr. ;alkaloids;ultrasonic extraction;antibacterial activity

2016-06-28

楊園園(1995-)，女，大學(xué)本科，研究方向：天然產(chǎn)物的研究開(kāi)發(fā)，E-mail：yangyuanyuan910@126.com。

*通訊作者:史娟(1978-),女，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)和有機(jī)合成，E-mail:446269824@qq.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)02-0277-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.045