向極釬,王應(yīng)玲,劉曉鵬,姜 寧,殷紅清,王秋霜

(1.湖北民族學(xué)院生科院,湖北恩施 445000; 2.恩施清江生物工程有限公司,湖北恩施 445000;3.湖北省地質(zhì)局第二地質(zhì)大隊(duì),湖北恩施 445000;4.南京醫(yī)藥股份股份有限公司,博士后工作站,江蘇南京 210012)

忍冬藤總黃酮超聲輔助提取工藝及其體外抗氧化活性研究

向極釬1,2,王應(yīng)玲3,劉曉鵬1,4,*,姜 寧1,殷紅清2,王秋霜4

(1.湖北民族學(xué)院生科院,湖北恩施 445000; 2.恩施清江生物工程有限公司,湖北恩施 445000;3.湖北省地質(zhì)局第二地質(zhì)大隊(duì),湖北恩施 445000;4.南京醫(yī)藥股份股份有限公司,博士后工作站,江蘇南京 210012)

本研究采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助提取忍冬藤總黃酮的工藝;以 1,1-二苯基-二苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS+·)清除能力,Fe2+螯合力和鐵離子還原抗氧化力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)為指標(biāo),研究了忍冬藤總黃酮的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:超聲輔助提取忍冬藤總黃酮的最佳提取工藝為:乙醇濃度70%、液固比31∶1(mL/g)、超聲功率210 W,超聲時(shí)間8 min,按此工藝提取忍冬藤總黃酮,得率達(dá)7.74%±0.10%。體外抗氧化活性的研究顯示忍冬藤總黃酮清除DPPH自由基的IC50為48.1 μg/mL、清除ABTS+自由基的IC50為66.1 μg/mL、Fe2+螯合力的EC50為83.6 μg/mL,在6.25～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi),FRAP 值與總黃酮的濃度呈線性關(guān)系:Y=0.0019x+0.1527(R2=0.9964)。此研究為忍冬藤總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

忍冬藤,總黃酮,超聲輔助,抗氧化

忍冬藤為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥莖枝,分布廣泛,忍冬藤與金銀花為植物忍冬的不同藥用部位,均收載于2010年版中國藥典[1]。忍冬藤味甘、性寒,具有清熱解毒,通絡(luò)之功效。用于溫病發(fā)熱,瘡癰腫毒,熱毒血痢,風(fēng)濕熱痹[1]?，F(xiàn)代研究表明,忍冬藤具有抗病毒[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]以及調(diào)節(jié)免疫[5]等藥理作用。

忍冬藤富含黃酮[6],黃酮具有多種藥理功能,但目前對忍冬藤總黃酮的提取和體外抗氧化活性研究沒有報(bào)道。本研究首次通過中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲輔助提取忍冬藤總黃酮的提取工藝,并以DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力、Fe2+螯合力和鐵離子還原抗氧化力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)為指標(biāo),檢測忍冬藤總黃酮的體外抗氧化活性。該研究為忍冬藤總黃酮的工業(yè)化提取和進(jìn)一步開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

忍冬藤 由南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供,60 ℃烘干,粉碎,過60目篩;DPPH、ABTS+、菲咯嗪、TPTZ和Trolox 購自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;葡萄糖、無水乙醇、蒽酮、硫酸等 均為分析純,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RT-02A型多功能粉碎機(jī) 弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司;JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芒生物科技股份有限公司;BECKMAN COUCTER型離心機(jī) 美國BECKMAN公司;HHS型恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;多功能酶標(biāo)儀 Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及總黃酮得率的計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及忍冬藤總黃酮得率的計(jì)算參照《中國藥典》2010版[7]。以吸光度A為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。按如下公式計(jì)算總黃酮得率。

式中:c為測定樣液的黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);V為提取體積(mL);m為忍冬藤質(zhì)量(mg)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇濃度對黃酮得率的影響 稱取一定量的忍冬藤粉末,按液固比20∶1(mL/g)分別加入濃度為50%、60%、70%、80%和90%的乙醇,超聲處理4 min,超聲功率為150 W。將浸提液4000 r/min離心30 min,測上清液中的總黃酮含量,計(jì)算得率。

1.2.2.2 液固比對黃酮得率的影響 將一定量的忍冬藤粉末,分別按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1(mL/g)加入70%的乙醇溶液,150 W超聲處理4 min,然后將浸提液4000 r/min離心30 min,上清測總黃酮含量,計(jì)算得率。

1.2.2.3 超聲功率對黃酮得率的影響 按液固比20∶1(mL/g)加入70%的乙醇溶液,分別用功率為50、100、150、200、250、300 W的超聲波處理4 min。超聲處理后,將提取液4000 r/min離心30 min,上清測總黃酮含量,計(jì)算得率。

1.2.2.4 超聲時(shí)間對黃酮得率的影響 按液固比20∶1(mL/g)向忍冬藤粉末中加入70%乙醇溶液,超聲功率150 W,分別處理2、4、6、8、10、12 min。然后,4000 r/min離心30 min,取上清測總黃酮含量,計(jì)算得率。

1.2.3 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化忍冬藤總黃酮提取工藝 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以乙醇濃度、液固比、超聲功率和超聲時(shí)間為自變量,黃酮得率為響應(yīng)值以優(yōu)化忍冬藤黃酮的提取工藝。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels table

根據(jù)中心復(fù)合實(shí)驗(yàn),建立乙醇濃度、液固比、超聲功率和超聲時(shí)間與總黃酮得率的回歸方程,并進(jìn)行響應(yīng)面分析,優(yōu)化出忍冬藤總黃酮提取的最佳工藝,并對優(yōu)化的工藝進(jìn)行驗(yàn)證,以證明此工藝是否可行。

1.2.4 忍冬藤總黃酮體外抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 將100 μL不同濃度的測試樣品和VC及Trolox溶液與100 μL 0.1 mol/L的DPPH·溶液加入到96孔培養(yǎng)板的孔內(nèi),搖勻,室溫下暗處靜置 30 min 后測定其517 nm處的吸光值,以同時(shí)測定100 μL DPPH·溶液與100 μL溶劑混合后的吸光度為對照。DPPH自由基清除率計(jì)算如下:

其中,As為樣品或陽性對照的吸收值,Ac為空白對照的吸收值[8]。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除能力的測定 忍冬藤總黃酮ABTS+自由基清除能力的測定按參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。具體操作如下:將25 mL 7 mmol/L ABTS+與440 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀(K2S2O8)溶液配勻,在避光處放置12～16 h,使用時(shí)用去離子水或90%乙醇稀釋至734 nm處的吸光值為0.7±0.02,ABTS+·工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。將不同濃度的樣品或陽性對照溶液取50 μL加入96孔板中,加入ABTS+·溶液150 μL,混勻10 min后,測734 nm處吸光度,以去離子水或90%乙醇50 μL加ABTS+·溶液150 μL為空白對照。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下:

式中,As為樣品的吸光值,Ac為空白對照的吸光值。

1.2.4.3 Fe2+螯合力的測定 Fe2+螯合力的方法參考文獻(xiàn)[10]。主要操作如下:吸取50 μL不同濃度的待測液(樣品和EDTA-2Na溶液),加入5 μL氯化亞鐵溶液(2 mmol/L),160 μL去離子水,室溫振蕩反應(yīng)5 min后,加入10 μL菲咯嗪溶液(5 mmol/L,溶于甲醇),搖勻,室溫反應(yīng)10 min,于562 nm處測吸光值。

其中Ac為空白吸光值,As為不加菲咯嗪時(shí)的吸光值。

1.2.4.4 鐵離子還原抗氧化力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)的測定 標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品(10 μL),混合于200 μL的ferric-TPTZ試劑(300 mmol/L pH3.6的醋酸緩沖液,溶于40 mmol/L HCl的10 mmol/L TPTZ,20 mmol/L的 FeCl3·6H2O溶液按體積比10∶1∶1混合),然后加入96孔板中。微板于37 ℃ 孵育30 min后,于593 nm處測吸光值。吸收值越高,還原性越強(qiáng)[11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和體外抗氧化活性數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示,采用統(tǒng)計(jì)軟件 Origin 8.0進(jìn)行單因素方差分析,組間差異比較采用Tukey實(shí)驗(yàn);中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果由Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 忍冬藤總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 乙醇濃度對忍冬藤總黃酮得率的影響 乙醇濃度對忍冬藤總黃酮得率的影響如圖1所示,隨著乙醇濃度的增加,總黃酮得率也顯著增加,當(dāng)乙醇濃度增至70%后,黃酮的得率升高不再顯著。說明忍冬藤總黃酮在70%乙醇溶液中已大部分溶出,提取乙醇濃度不再會(huì)使總黃酮溶解。

圖1 乙醇濃度對忍冬藤總黃酮得率的影響 Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae注:不同大寫字母表示差異極顯著,p<0.01;不同小寫字母表示差異顯著,p<0.05;圖1～圖4同。

2.1.1.2 液固比對忍冬藤總黃酮得率的影響 圖2為液固比對忍冬黃酮得率影響的結(jié)果,從圖2可以看出,液固比較小(<20∶1)時(shí),增加提取液的體積,對黃酮得率影響顯著(p<0.01),當(dāng)液固比>30∶1時(shí),黃酮的得率不再顯著上升,當(dāng)液固比超過40∶1后,得率有下降趨勢。這是因?yàn)橐汗瘫仍黾?可以增加忍冬藤細(xì)胞內(nèi)的黃酮與溶液中黃酮的濃度差,從而增加溶出量,但當(dāng)浸提液體積過大,會(huì)使后續(xù)操作困難和浪費(fèi)增加,從而使得率下降。

圖2 液固比對忍冬藤總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.1.1.3 超聲功率對忍冬藤總黃酮得率的影響 超聲功率也能顯著影響忍冬總黃酮的得率(圖3),超聲功率較低時(shí),提高功率能極顯著提高總黃酮得率(p<0.01),當(dāng)超聲功率達(dá)200 W后,總黃酮得率不再顯著上升,至300 W時(shí),得率反而下降。這是因?yàn)樘岣叱暪β誓茉鰪?qiáng)超聲波的空化作用,從而促進(jìn)黃酮的溶出,但功率過大,反而會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)或增加其它物質(zhì)的溶出從而抑制黃酮的得率。

圖3 超聲功率對忍冬藤總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.1.1.4 超聲時(shí)間對忍冬藤總黃酮得率的影響 超聲時(shí)間也顯著影響著忍冬藤黃酮的得率(圖4)。當(dāng)超聲時(shí)間較短時(shí)(<8 min),隨著時(shí)間的延長,黃酮的得率顯著升高(p<0.01),但當(dāng)提取時(shí)間超過8 min后,黃酮的得率不再提高。

表2 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 2 Results of central composite test

圖4 超聲時(shí)間對忍冬藤總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.1.2 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)

2.1.2.1 回歸模型的建立和檢驗(yàn) 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化忍冬藤總黃酮提取工藝的結(jié)果如表2所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0分析,建立了如下四元二次回歸方程:

R=7.52-0.44A+0.30B+0.74C+0.20D-0.20AB+0.24AC+0.30AD+0.11BC-0.034BD-0.53CD-0.74A2-0.75B2-0.86C2-0.59D2,R2=0.9600。

方差分析結(jié)果列于表3中。從表3中可能得出,該模型顯著水平為極顯著,失擬實(shí)驗(yàn)為不顯著(p>0.05),說明此回歸模型與實(shí)際情況擬合得很好。根據(jù)各項(xiàng)偏回歸系數(shù)的絕對值大小,可以判斷出各因素對黃酮得率影響程度大小順序?yàn)镃2>B2>A2>C>D2>A>CD>B>AD>D>AC>AB>BC>BD,其中AB、BC、BD項(xiàng)不顯著(p>0.05),所以將上述回歸模型的這三項(xiàng)刪除,最終回歸模型如下:

R=7.52-0.44A+0.30B+0.74C+0.20D+0.24AC+0.30AD-0.53CD-0.74A2-0.75B2-0.86C2-0.59D2,R2=0.9227。

2.1.2.2 黃酮提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證 根據(jù)建立的回歸模型,計(jì)算得出當(dāng)A=-0.28,B=0.27,C=0.45,D=-0.12,即乙醇濃度68.6%,液固比31.4∶1(mL/g),超聲功率211.2 W,超聲時(shí)間7.9 min,黃酮的得率最高,理論值為7.77%。為了操作方便,將工藝定為乙醇濃度70%、液固比31∶1(mL/g)、超聲功率210 W,超聲時(shí)間8 min,按此工藝提取忍冬藤總黃酮,得率達(dá)7.74%±0.10%,與理論值接近度高,說明該工藝具有較強(qiáng)的使用價(jià)值。

2.1.2.3 兩因素間交互作用 作用顯著的兩因素間的交互作用如圖5～圖7所示,三組圖直觀地反映了當(dāng)其它兩個(gè)因素處于最佳水平時(shí),乙醇濃度和超聲功率、乙醇濃度和超聲時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用對忍冬藤總黃酮得率的影響。

圖5表示當(dāng)液固比為31.4∶1(mL/g),超聲處理7.9 min時(shí),乙醇濃度和超聲功率對忍冬藤總黃酮得率的影響。圖中顯示,當(dāng)乙醇濃度和超聲功率較低時(shí),總黃酮得率很低,隨著二者的上升,得率顯著增加,當(dāng)乙醇濃度達(dá)65%～70%,超聲功率200～225 W之間時(shí),總黃酮得率最高。

圖5 乙醇濃度和超聲功率對忍冬藤總黃酮得率的影響Fig.5 Interactive effects of ethanol concentration and ultrasonicpower on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

圖6為液固比為31.4∶1(mL/g),超聲功率211.2 W時(shí),乙醇濃度和超聲時(shí)間交互作用對總黃酮得率的影響。如圖所示,只有乙醇濃度和超聲時(shí)間分別在65%～70%和7～8 min范圍內(nèi),總黃酮的得率才能達(dá)到最高值,任何因素的升高或下降都會(huì)降低得率。

表3 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 ANOVA of central composite test results

圖6 乙醇濃度和超聲時(shí)間對忍冬藤總黃酮得率的影響Fig.6 Interactive effects of ethanol concentration and ultrasonictime on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

*:差異顯著(p<0.05);**:差異極顯著(p<0.01)。當(dāng)乙醇濃度為68.6%、液固比31.4∶1(mL/g)時(shí),超聲功率和超聲時(shí)間對得率的交互影響如圖7所示?？梢缘弥?當(dāng)超聲功率較低、超聲時(shí)間很短時(shí),黃酮的得率極低;隨著二因素的水平的提高,得率急劇上升,當(dāng)超聲功率達(dá)200～225 W、提取時(shí)間7～8 min,得率達(dá)極大值;而進(jìn)一步提高超聲功率、延長超聲處理時(shí)間,得率反而緩緩下降。

圖7 乙醇濃度和超聲時(shí)間對忍冬藤總黃酮得率的影響Fig.7 Interactive effects of ultrasonic power and ultrasonictime on total flavonoids yield from Caulis Lonicerae

2.2 忍冬藤總黃酮體外抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH自由基清除能力 忍冬藤總黃酮DPPH清除能力如圖8所示。樣品與標(biāo)準(zhǔn)品(Trolox和VC)的DPPH自由基清除率均呈劑量依賴性,Trolox的清除率與濃度(0.94～30 μg/mL)的線性方程為y=2.6964x+5.5816,R2為0.9982;VCDPPH自由基清除率與濃度(1.56～80 μg/mL)的回歸方程為y=1.1442x+3.1050,R2為0.979;樣品忍冬藤總黃酮的DPPH自由基清除率與濃度(3.75～120 μg/mL)的關(guān)系可用如下回歸方程表示:y=0.7573+13.584,R2為0.9345。三者的IC50分別為16.5、41.0、48.1 μg/mL。說明,其中Trolox的DPPH自由基清除能力最強(qiáng),忍冬藤總黃酮的DPPH自由基清除能力與VC相當(dāng)。

圖8 忍冬藤總黃酮DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH radical scavenging capacity of total flavonoids from Caulis Lonicerae

2.2.2 ABTS+自由基清除能力 圖9為忍冬藤總黃酮ABTS+自由基清除能力的測定結(jié)果。Trolox表現(xiàn)出極強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力,清除率與濃度(0.47～15 μg/mL)的線性回歸方程是 y=6.227x-0.8917,R2為0.9959;VCABTS+自由基清除率與濃度(3.13～100 μg/mL)的關(guān)系為 y=0.886x+5.507,R2為0.9726;而忍冬藤總黃酮ABTS+自由基清除率與其濃度(4.69～150 μg/mL)的關(guān)系為 y=0.5745x+12.04,R2則是0.9572。計(jì)算它們的IC50值,得出:Trolox 8.2 μg/mL、VC50.2 μg/mL、忍冬藤總黃酮 66.1 μg/mL。

圖9 忍冬藤總黃酮ABTS+自由基清除能力 Fig.9 ABTS radical scavenging capacity of total flavonoids from Caulis Lonicerae

2.2.3 Fe2+螯合力的測定 以EDTA-2Na為標(biāo)準(zhǔn)品,通過菲咯嗪試劑,測定忍冬藤總黃酮的Fe2+螯合能力(圖10)。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的Fe2+螯合力均與劑量相關(guān),其中EDTA-2Na的Fe2+螯合率與濃度(2.81～90 μg/mL)的線性關(guān)系可表示為:y=1.0147x+9.6334,R2為0.9719;忍冬藤總黃酮的Fe2+螯合率與濃度(2.34～150 μg/mL)的線性關(guān)系則為:y=0.5535x+3.7404,R2=0.9874。通過線性回歸方程計(jì)算它們的EC50值,分別為39.8 μg/mL(EDTA-2Na),83.6 μg/mL(樣品)。所以,忍冬藤總黃酮的Fe2+螯合能力約為EDTA-2Na的50%。

圖10 忍冬藤總黃酮Fe2+螯合能力Fig.10 Fe2+chelating ability of total flavonoids extraction from Caulis Lonicerae

2.2.4 FRAP測定 以Trolox和VC為標(biāo)準(zhǔn)品,測定忍冬藤總黃酮的FRAP值,可以發(fā)現(xiàn),兩種標(biāo)準(zhǔn)品和忍冬藤總黃酮的FRAP值均呈濃度依賴性(圖11)。在3.75～120 μg/mL濃度范圍內(nèi),Trolox的OD與濃度呈線性關(guān)系,線性方程為:y=0.006x+0.0015(R2=0.9923);在4.38～140 μg/mL濃度范圍內(nèi),VC的OD值與濃度的線性關(guān)系為:Y=0.0055x-0.0202(R2=0.9952);對于忍冬藤總黃酮來說,在6.25～200 μg/mL的濃度范圍內(nèi),OD與濃度的線性關(guān)系可以表示為:Y=0.0019x+0.1527(R2=0.9964)。

圖11 忍冬藤總黃酮FRAP的測定Fig.11 FRAP assay of total flavonoids from Caulis Lonicerae

3 結(jié)論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化了忍冬藤總黃酮的超聲輔助提取工藝,優(yōu)化的工藝為乙醇濃度70%、液固比31∶1(mL/g)、超聲功率210 W,超聲時(shí)間8 min,按此工藝提取忍冬藤總黃酮,得率達(dá)7.74%±0.10%。前期,本實(shí)驗(yàn)室曾優(yōu)化了水浴法的忍冬藤總黃酮工藝,得率為5.22%[12],因此,超聲輔助提取的總黃酮得率較普通水浴法的

得率提高了40.22%。通過對DPPH自由基清除力、ABTS+自由基清除力、Fe2+螯合力和FRAP的體外抗氧化指標(biāo)的測定,表明忍冬藤總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。該研究為忍冬藤這一傳統(tǒng)中藥的進(jìn)一步開發(fā)提供了理論依據(jù)。對忍冬藤總黃酮的體內(nèi)抗氧化活性和其中具體成分的研究是本課題組下一步的目標(biāo)。

[1]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典[M].2010版. 一部. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:179.

[2]周虎,俞慶福.忍冬藤對慢性乙型病毒性肝炎血漿內(nèi)皮素的影響[J].臨床軍醫(yī)雜志,2002,30(6):25-26.

[3]童惠云,熊源胤,李建武,等. 五藤湯辨治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2007,19(4):321-322.

[4]姚存姍,伍期專. 忍冬藤提取物光敏化作用的初步研究[J].中國激光醫(yī)學(xué)雜志,2006,15(6):361-364.

[5]孫志平,馬寧寧,丁櫻,等.丁櫻教授配伍應(yīng)用雞血藤和忍冬藤經(jīng)驗(yàn)[J].中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué),2010,2(6):503-504.

[6]陳 玲,張海艷,李曉,等. 忍冬的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床,2015,30(1):108-114.

[7]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典[M]. 2010版. 一部. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:355.

[8]Chen D,Fan J,Wang P,et al. Isolation,identification and antioxidative capacity of water-soluble phenylpropanoid compounds from Rhodiola crenulata[J]. Food Chemistry,2012,134(4):2126-2133.

[9]Lv J,Yu L,Lu Y,et al. Phytochemical compositions,and antioxidant properties,and antiproliferative activities of wheat flour[J]. Food Chemistry,2012,135(2):325-331.

[10]Tuba Ak,Gülcin I. Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin[J]. Chemico-Biological Interactions,2008,174(1):27-37.

[11]Fernandes VC,Domingues VF,Freitas V,et al. Strawberries from integrated pest management and organic farming:Phenolic composition and antioxidant properties[J].Food Chemistry,2012,134(4):1926-1931.

[12]姜寧,劉曉鵬,張俊霞,等. 響應(yīng)面法對忍冬藤總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(10):2459-2462.

Ultrasound-assisted extraction and antioxidant activitiesinvitroof total flavonoids fromCaulisLonicerae

XIANG Ji-qian1,2,WANG Ying-ling3,LIU Xiao-peng1,4,*,JIANG Ning1,YIN Hong-qing2,WANG Qiu-shuang4

(1.School of Biological Science and Technology,Hubei Institute for Nationalities,Enshi 445000,China;2. Enshi QingJiang Bio-Engineering Co.,Ltd.,Enshi 445000,China;3. No.2 Geological Brigade of Geological Department of Hubei Province,Enshi 445000,China;4. Postdoctoral Research Station,Nanjing Medical Co.,Ltd.,Nanjing 210012,China)

The optimization of ultrasound-assisted extraction process of total flavonoids fromCaulisLoniceraewas investigated by response surface methodology(RSM)based on central composite design and the antioxidant activitiesinvitroof the extracted flavonoids was measured using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH·)scavenging,2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid(ABTS+·)radical scavenging,Fe2+chelating activity and ferric reducing antioxidant power(FRAP)methods. The results showed that the optimal ultrasound-assisted extraction conditions for total flavonoids fromCaulisLoniceraewere obtained as follows:ethanol concentration was 70%,liquid-solid ratio 31∶1(mL/g),ultrasonic power 210 W,ultrasonic time 8 min. Under these conditions,the yield of total flavonoids was 7.74%±0.10%. The extracted flavonoids exhibited powerful antioxidant activitiesinvitro. The IC50of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH radical)scanvenging and ABTS+radical scanvenging capcities were 48.1,66.1 μg/mL,respectively. The EC50of Fe2+chelating ability was 83.6 μg/mL,and in the concentration range of 6.25～200 μg/mL,the linear regression equation of relationship between TRAP value and total flavonoids concentration from was as follow:Y=0.0019x+0.1527(R2=0.9964). This research might provide a theoretical basis for the further development and utilization of total flavonoids fromCaulisLonicerae.

CaulisLonicerae;total flavonoids;ultrasound-assisted;antioxidant

2015-10-09

向極釬(1968-)，男，高級農(nóng)藝師，研究方向：天然產(chǎn)物研究，E-mail:hmxjq@163.com。

*通訊作者:劉曉鵬(1971-)，男，教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究，E-mail:18913386031@189.cn。

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI04B04-5)資助；江蘇省“企業(yè)博士后集聚計(jì)劃”項(xiàng)目(2011033)資助；2013年湖北省戰(zhàn)略性新興(支柱)產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)(2013029)項(xiàng)目資助；2014年度湖北省本科高?！皩I(yè)綜合改革”試點(diǎn)項(xiàng)目(2014029)資助。

TS201.1

B

1002-0306(2017)02-0251-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.040