王艷麗,朱 寧,于 寧,張海平,朱 月,孫愛(ài)東

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

低電壓脈沖電場(chǎng)對(duì)花楸果汁大腸桿菌滅活工藝優(yōu)化

王艷麗,朱 寧,于 寧,張海平,朱 月,孫愛(ài)東*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100083)

為探尋低電壓脈沖電場(chǎng)對(duì)花楸果汁中大腸桿菌的滅活效果,實(shí)驗(yàn)考察了在指數(shù)衰減波的作用下,電壓、電容、電阻、介質(zhì)電導(dǎo)率及處理次數(shù)對(duì)大腸桿菌致死率的影響。經(jīng)單因素及正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到最佳處理工藝為:電壓400 V,電容300 μF,介質(zhì)電導(dǎo)率0.5 mS/cm,處理次數(shù)3次,該條件下大腸桿菌致死率達(dá)到2.242。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低電壓脈沖電場(chǎng)可以達(dá)到有效殺滅果汁中微生物的目的,這為該技術(shù)的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。

低電壓,脈沖電場(chǎng),花楸,大腸桿菌,致死率

花楸是薔薇科落葉灌木或小喬木[1],于上世紀(jì)九十年代引入我國(guó),主要種植于遼西地區(qū)[2-3]。花楸中富含黃酮、花青素、雙聯(lián)苯酚、類(lèi)山梨酸苷、生氰苷等成分,并具有強(qiáng)抗氧化、抗癌、抗輻射和止咳平喘等藥理作用[4-7],具有良好的開(kāi)發(fā)前景,如制成果汁、果酒、果干等。但目前果蔬制品大多采用熱殺菌工藝,過(guò)程中常伴隨著功能性成分的破壞,大大降低了果蔬制品的食用價(jià)值。

脈沖電場(chǎng)作為一種安全無(wú)污染的非熱殺菌方式,能有效減少食品在處理過(guò)程中感官品質(zhì)及物理性質(zhì)的變化[8],因而在食品領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的研究和應(yīng)用。目前,脈沖電場(chǎng)已成功應(yīng)用于牛奶、啤酒、葡萄酒、番茄汁等液體食品[9-10]。然而傳統(tǒng)的脈沖電場(chǎng)殺菌設(shè)備需要外界提供幾千伏至幾十千伏的高電壓[11]才能達(dá)到有效殺滅微生物的目的,對(duì)脈沖發(fā)生器要求較高,同時(shí)對(duì)操作人員存在安全隱患,極大地限制了脈沖電場(chǎng)這一非熱殺菌方式的工業(yè)化應(yīng)用。因此,如何在低電壓范圍內(nèi)有效殺滅微生物成為脈沖電場(chǎng)技術(shù)研究的新課題。本文探討了在低電壓范圍內(nèi)(≤400 V),使用指數(shù)衰減波作用于花楸果汁中的大腸桿菌時(shí),電壓、電容、電阻、介質(zhì)電導(dǎo)率及處理次數(shù)對(duì)大腸桿菌致死率的影響,以期為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸 吉林省延邊市,成熟果實(shí)為紫黑色,于-80 ℃冷藏待用;大腸桿菌菌種(Escherichiacoli,CGMCC1.1739) 中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所;LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

THERMO 702型超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher SCIENTIFIC公司;BCD-649WLE型冰箱 青島海爾股份有限公司;MJ-BL25B3型攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司;L3660D型低速離心機(jī) 上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;TS-100B型臺(tái)式恒溫振蕩器 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;UV-6100型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;DK-98-Ⅱ電子調(diào)溫萬(wàn)用電爐 天津泰斯特儀器有限公司;LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);RSPO1-B型數(shù)字注射泵(進(jìn)樣系統(tǒng)) 嘉善瑞創(chuàng)電子科技有限公司;ECM-830型細(xì)胞電穿孔信號(hào)發(fā)生器(脈沖發(fā)生器) 美國(guó)BTX公司;處理室 由北京林業(yè)大學(xué)功能性食品創(chuàng)新研究室自主研發(fā),處理室使用平行板電極結(jié)構(gòu),電極間距為100 μm,低電壓脈沖電場(chǎng)滅菌裝置示意圖見(jiàn)圖1,電路示意圖見(jiàn)圖2。

圖1 低電壓脈沖電場(chǎng)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of low-voltagepulsed electric field equipment

圖2 低電壓脈沖電場(chǎng)電路示意圖Fig.2 Circuit diagram of low-voltagepulsed electric field equipment

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花楸果汁制備 實(shí)驗(yàn)前將花楸從超低溫冰箱中取出,先放置于-20 ℃冰箱中冷凍過(guò)夜,再經(jīng)常溫解凍,清洗后榨汁,4000 r/min離心20 min,離心所得上清液通過(guò)8層紗布過(guò)濾后經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min),冷卻至室溫后按1%接種量接種大腸桿菌菌懸液,菌體濃度達(dá)到106～108cfu/mL,備用,果汁電導(dǎo)率約為1.0 mS/cm。

1.2.2 微生物數(shù)量測(cè)定 微生物數(shù)量測(cè)定按照GB/T 4789.2-2010[12]中方法進(jìn)行。

1.2.3 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 吸取大腸桿菌培養(yǎng)液,按1%接種量接種于含LB液體培養(yǎng)基的試管中,于恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)(150 r/min,37 ℃)。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h 時(shí)各取出一支試管,以未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,測(cè)定各試管中菌懸液在600 nm處的吸光值,平行測(cè)定3次。

1.2.4 低電壓脈沖電場(chǎng)殺菌 低電壓脈沖電場(chǎng)殺菌設(shè)備放置于超凈工作臺(tái)內(nèi),使用前打開(kāi)紫外燈殺菌30 min,除人員操作時(shí)間外保持紫外燈處于打開(kāi)狀態(tài),以防止微生物污染。進(jìn)樣管路及樣品收集管路均可拆卸,使用前經(jīng)高壓蒸汽滅菌,使用時(shí)使用無(wú)菌水沖洗5 min,以最大程度保證管路的無(wú)菌狀態(tài)。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)操作3次。

1.2.4.1 電壓對(duì)殺菌效果的影響 設(shè)定電容為400 μF,電阻100 Ω,果汁電導(dǎo)率為1.0 mS/cm,設(shè)置電壓分別為200、250、300、350、400 V,處理次數(shù)為1次,考察不同電壓對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.2 電容對(duì)殺菌效果的影響 設(shè)定電壓為400 V,電阻100 Ω,果汁電導(dǎo)率為1.0 mS/cm,設(shè)置電容分別為100、200、300、400、500、600 μF,處理次數(shù)為1次,考察不同電容對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.3 電阻對(duì)殺菌效果的影響 設(shè)定電壓為400 V,電容400 μF,果汁電導(dǎo)率為1.0 mS/cm,設(shè)置電阻分別為100、200、300、400、500 Ω,處理次數(shù)為1次,考察不同電阻對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.4 果汁電導(dǎo)率對(duì)殺菌效果的影響 設(shè)定電壓為400 V,電阻100 Ω,電容400 μF,調(diào)節(jié)NaCl含量使果汁電導(dǎo)率分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mS/cm,處理次數(shù)為1次,考察不同電導(dǎo)率對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.5 處理次數(shù)對(duì)殺菌效果的影響 設(shè)定電阻為100 Ω,電容400 μF,調(diào)節(jié)果汁電導(dǎo)率為0.5 mS/cm,在不同電壓(200、250、300、350、400 V)下分別處理1、2、3次,考察不同處理次數(shù)對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響。

1.2.4.6 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取電壓、電容、電導(dǎo)率和處理次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以期得到最優(yōu)殺菌工藝,正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 計(jì)數(shù)方式 殺菌效果用致死率對(duì)數(shù)值lg S表示:

lg S=lg(N0/N)

式中:N0為處理前微生物數(shù),cfu/mL;N為處理后微生物數(shù),cfu/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果

大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知大腸桿菌延遲生長(zhǎng)期處于0～2 h之間,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～10 h之間,其中對(duì)數(shù)初期、中期、末期分別出現(xiàn)在培養(yǎng)2、6、10 h,穩(wěn)定初期為培養(yǎng)10 h。由于處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞群體在細(xì)胞的化學(xué)組成、代謝活性和其他一些特性方面均最為接近一致[13],且對(duì)脈沖電場(chǎng)最為敏感[14],能最大程度反映出脈沖電場(chǎng)的致死作用,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇培養(yǎng)時(shí)間為6.5 h的大腸桿菌作為處理對(duì)象。

圖3 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3 Growth curve of E. coli

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 電壓對(duì)花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響 電壓對(duì)花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響見(jiàn)圖4。可知,隨著電壓的升高,大腸桿菌致死率明顯增大。當(dāng)電壓升至350 V后,致死率呈緩慢上升趨勢(shì)。分析可知,平行板電極電場(chǎng)強(qiáng)度隨著電壓增大而增大,場(chǎng)強(qiáng)的增加會(huì)明顯促進(jìn)微生物的死亡[14]。綜合考慮滅活效果及低電壓范圍(≤400 V),正交實(shí)驗(yàn)中選取300、350、400 V三個(gè)水平。

圖4 電壓對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響Fig.4 Effect of voltage on inactivation of E. coli

圖5 電容對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響Fig.5 Effect of capacitance on inactivation of E. coli

2.2.3 電阻對(duì)花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響 電阻對(duì)花楸果汁中大腸桿菌的滅活效果見(jiàn)圖6。由圖6可知,電阻的變化對(duì)大腸桿菌的致死率無(wú)顯著影響(p=0.066>0.05)。電阻的大小主要改變電路中電流的大小,而對(duì)果汁中微生物跨膜電壓的形成并無(wú)顯著影響。由于在脈沖電場(chǎng)作用下,微生物的死亡主要與其跨膜電壓的形成有關(guān)[15-17],因此,電阻這一參數(shù)的改變對(duì)殺菌效果無(wú)顯著影響。

圖6 電阻對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響Fig.6 Effect of resistance on inactivation of E. coli

2.2.4 果汁電導(dǎo)率對(duì)花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響 果汁電導(dǎo)率對(duì)花楸果汁中大腸桿菌滅活效果的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知,隨著電導(dǎo)率的增加,大腸桿菌致死率逐漸減小。當(dāng)電導(dǎo)率為0.5 mS/cm時(shí),大腸桿菌致死率最大,為1.710;當(dāng)果汁電導(dǎo)率增加至2.0 mS/cm后,大腸桿菌致死率降低至0.13。分析可知,介質(zhì)電導(dǎo)率對(duì)大腸桿菌的滅活效果存在顯著影響(p<0.01),當(dāng)介質(zhì)電導(dǎo)率超過(guò)一定范圍后,低電壓脈沖電場(chǎng)無(wú)法有效殺滅大腸桿菌。這是由于電導(dǎo)率大的食品會(huì)在處理室中產(chǎn)生很小的峰值電場(chǎng),使處理室兩端的電壓難以升高,不利于脈沖電場(chǎng)殺菌[18]。由于繼續(xù)減小果汁電導(dǎo)率,會(huì)導(dǎo)致果汁顏色發(fā)生明顯改變,嚴(yán)重影響其感官品質(zhì),因此正交實(shí)驗(yàn)中選擇0.5、1.0、1.5 mS/cm三個(gè)水平。

圖7 電導(dǎo)率對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響Fig.7 Effect of conductivity on inactivation of E. coli

表3 低電壓脈沖電場(chǎng)滅活大腸桿菌正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design for optimizationof inactivation of E. coli by low-voltage pulsed electric field

注:“***”表示F0.05),這可能是由于經(jīng)過(guò)1次處理后,花楸果汁中的部分大腸桿菌處于亞致死狀態(tài)[19-21],第2次處理后,大部分亞致死狀態(tài)的大腸桿菌已死亡,因此繼續(xù)增加處理次數(shù)大腸桿菌致死率未出現(xiàn)明顯上升。另外也有文獻(xiàn)表明,隨著介質(zhì)中菌落總數(shù)的減少,脈沖電場(chǎng)的殺菌效果減弱[22],這可能也是處理3次后大腸桿菌致死率沒(méi)有明顯上升的原因。

圖8 不同電壓下處理次數(shù)對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響Fig.8 Effect of treatment times on inactivation of E. coli under different voltages

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 低電壓脈沖電場(chǎng)滅活大腸桿菌正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results for optimizationofinactivation of E. coli by low-voltage pulsed electric field

由表3中極差分析結(jié)果可知,各因素對(duì)大腸桿菌滅活效果的影響大小依次為D>A>B>C,即處理次數(shù)>介質(zhì)電導(dǎo)率>電壓>電容,最佳工藝組合為A1B3C3D3,在此條件下大腸桿菌致死率為2.388±0.044;由方差分析結(jié)果可知,A、B、D因素對(duì)結(jié)果影響高度顯著,C因素對(duì)結(jié)果影響不顯著,故為降低能量消耗,最佳工藝組合確定為A1B3C1D3,即果汁電導(dǎo)率為0.5 mS/cm,處理電壓為400 V,電容300 μF,處理次數(shù)為3次。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到大腸桿菌平均致死率為2.242,與正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳工藝相比,致死率無(wú)明顯降低。

3 結(jié)論

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Optimization of low-voltage pulsed electric field for inactivation ofEscherichiaColiin rowan juice

WANG Yan-li,ZHU Ning,YU Ning,ZHANG Hai-ping,ZHU Yue,SUN Ai-dong*

(1.Department of Food Science,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.Beijing Foresty University,Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security,Beijing 100083,China)

In order to explore the effect of low-voltage electric field on the inactivation ofE.coliin rowan juice,different levels of voltage,capacitance,resistance,medium conductivity and treatment times were tested under the action of exponential decay wave. The results showed that the optimal conditions were obtained as follows:the voltage was 400 V,capacitance was 300 μF,medium conductivity was 0.5 mS/cm,treatment times was 3,and the lethality was 2.242. The low-voltage pulsed electric field could inactivate microbes in juice effectively. This result provided theoretical basis for further research.

low-voltage;pulsed electric field;rowan;E.coli;lethality

2016-08-16

王艷麗(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品，E-mail:wangyanli03@qq.com。

*通訊作者:孫愛(ài)東(1968-)，女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品，E-mail：adsun@bjfu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31471593)；“十三五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0400302)。

TS201.3

B

1002-0306(2017)02-0246-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.039