周 冉,宋玉品,劉曉妹,荀賀風(fēng),侯冬梅,吳欣蕊,劉玲君

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊 050035;2.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300130;3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050000)

仿生硅化固定化葡萄糖氧化酶與辣根過氧化酶研究

周 冉1,宋玉品1,劉曉妹1,荀賀風(fēng)1,侯冬梅1,吳欣蕊2,劉玲君3

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊 050035;2.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300130;3.河北三元食品有限公司,河北石家莊 050000)

采用分步法將仿生硅化與脂質(zhì)體技術(shù)相結(jié)合,模擬細(xì)胞微結(jié)構(gòu),以卵磷脂為原料,制備脂質(zhì)體微囊,以胺類為誘導(dǎo)劑,在其表面硅化形成氧化硅殼層,實(shí)現(xiàn)對葡萄糖氧化酶(GOx)與辣根過氧化酶(HRP)雙酶固定。研究了超聲時間、誘導(dǎo)劑PDADMA用量、硅前驅(qū)體水解液(TMOS)用量、Triton X-100濃度等因素對固定化酶活性影響。結(jié)果表明,在200 μL PDADMA、0.7 mL TMOS、超聲50 min制得的固定化酶活性最高,能迅速硅化形成直徑200 nm左右的球形微囊。在此優(yōu)化條件下制備的固定化酶經(jīng)重復(fù)使用7次,依然達(dá)到初始催化酶活的61.46%,經(jīng)一個月冷藏后酶活仍能達(dá)到最初的74.1%?？梢?經(jīng)過固定化,雙酶系統(tǒng)的穩(wěn)定性得到了顯著提高。

仿生硅化,脂質(zhì)體,葡萄糖氧化酶,辣根過氧化酶,納米氧化硅微囊

含苯酚的廢水是一種常見工業(yè)污染物,主要來源于石油化工、木材加工、造紙和制藥等行業(yè)。殘存在環(huán)境中的高濃度酚類物質(zhì)會對人類及動植物產(chǎn)生極大的危害,是一種公認(rèn)的致癌致畸物質(zhì)。酶作為一種高效專一的生物催化劑,將其應(yīng)用于環(huán)境污染物處理,正得到日益廣泛重視與研究[1-2]。辣根過氧化物酶(HRP)能在較寬的溫度和pH范圍內(nèi)催化芳香族化合物氧化生成酚氧自由基,這些自由基會進(jìn)一步聚合生成溶解性較差的聚合物從溶液中沉淀出來。以往研究一般使用游離酶,但其本身存在易受廢水中其他污染物影響和不能循環(huán)使用等缺點(diǎn),限制了其在廢水處理方面的應(yīng)用,所以固定化酶的應(yīng)用受到廣泛的重視。

酶來源于生物體,在設(shè)計固定化酶載體時可借鑒酶在生物體中的存在環(huán)境。生物硅化過程反應(yīng)條件溫和,可在水環(huán)境、中性pH和較低的溫度下(通常在生理條件下)進(jìn)行[3-5]。通過仿生硅化制備有機(jī)質(zhì)/氧化硅納米復(fù)合物用作制備固定化酶的載體材料成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)[6-16]。近年來,研究人員將脂質(zhì)體技術(shù)與仿生相結(jié)合,研究出有機(jī)/無機(jī)雜化固定化載體,以達(dá)到綜合利用有機(jī)材料和無機(jī)材料的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行酶固定化的目的[17-25]。

應(yīng)用HRP催化去除苯酚的過程為雙底物反應(yīng),應(yīng)保證存在原位H2O2參加整個反應(yīng)。H2O2本身對酶有抑制作用且濃度不易控制。本研究將仿生硅化與脂質(zhì)體技術(shù)相結(jié)合,模擬細(xì)胞微結(jié)構(gòu),探討了以脂質(zhì)體為模板固定化葡萄糖氧化酶(GOx)和HRP雙酶的可行性。結(jié)合固定化雙酶系統(tǒng)中包埋的GOx,加入葡萄糖作為底物產(chǎn)生原位H2O2,減弱了直接加入H2O2時對酶產(chǎn)生的抑制作用[23]。并優(yōu)化反應(yīng)條件,考察了超聲時間、誘導(dǎo)劑PDADMA的用量、硅前驅(qū)體水解液(TMOS)用量、Triton X-100的濃度等條件的影響,以及固定化酶的重復(fù)使用性和儲存穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

正硅酸甲酯(TMOS) 天津市化學(xué)試劑研究所;葡萄糖氧化酶>100 U/mg(GOx)、辣根過氧化物酶>150 U/mg(HRP) 上海源葉生物科技有限公司;聚二甲基二烯丙基銨[PDADMA(20 wt.% in H2O)] Sigma公司;4-氨基安替比啉(4-AAP)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;大豆卵磷脂、膽固醇 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

冷凍高速離心機(jī) Sigma公司;UV1100紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Brukervector22傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電子天平、pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;S-4800掃描電鏡 JEOL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 包覆雙酶脂質(zhì)體模板的制備 將卵磷脂與膽固醇以質(zhì)量比4∶1溶于10 mL氯仿中,于4 ℃下冷藏保存待用。取3.6 mL上述溶液于100 mL圓底燒瓶中,減壓除去氯仿,直至在燒瓶內(nèi)壁形成均勻的透明薄膜[26]。加入12 mL GOx和HRP混合溶液,利用超聲形成均勻的脂質(zhì)體乳濁液,控制超聲時間實(shí)現(xiàn)對模板形貌和酶活保持性的優(yōu)化。

1.2.2 以脂質(zhì)體為模板誘導(dǎo)形成氧化硅殼層 取經(jīng)超聲后形成粒徑均勻的脂質(zhì)體溶液,在攪拌速度200 r/min下依次滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 mg/mL的PDADMA溶液、TMOS水解液(54.82 mmol/L硅醇溶液)。硅化1 h后離心洗滌5次[27]。

1.2.3 去除脂質(zhì)體模板 將已除去游離酶和雜質(zhì)的固定化酶在一定濃度的Triton X-100溶液中浸泡1 h,離心洗滌2次,得到除去模板的固定化酶。

1.2.3.1 誘導(dǎo)劑用量的影響 將3.6 mL卵磷脂溶液于100 mL圓底燒瓶中旋蒸成膜,加入混合酶液12 mL(其中VGOx∶VHRP=1∶2),超聲水浴振蕩形成均質(zhì)乳化液。分別取樣1 mL于2 mL離心管中。以PDADMA(2 mg/mL,0.1 mol/L PBS,pH6.88)的用量作為變量(取140、160、180、200、220、240 μL),再分別加入0.6 mL TMOS鹽酸水解液,靜置硅化1 h,常溫300 r/min離心5 min,用蒸餾水洗滌四次后檢測酶活。

1.2.3.2 超聲時間的影響 本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體,超聲時間的長短會影響固定化酶活性。本實(shí)驗(yàn)以超聲時間為變量(20,40,50,70,100,120,140 min),其余變量采用篩選所得最優(yōu)條件,即200 μL PDADMA,硅化1 h后離心洗滌檢測酶活。

1.2.3.3 前驅(qū)體水解液用量的影響 將各管中分別加入200 μL PDADMA,以TMOS鹽酸水解液的用量為變量(0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 mL),靜置硅化1 h,然后離心洗滌四次后檢測酶活。

1.2.3.4 WGOx與WHRP比例的影響 以雙酶的質(zhì)量比例為變量(WGOx∶WHRP分別為1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5,1∶6),按照上面優(yōu)化好的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),最后離心洗滌檢測酶活。

1.2.3.5 Triton X-100濃度的影響 誘導(dǎo)劑和前驅(qū)體的用量采用優(yōu)化得到的條件,即分別加入200 μL PDADMA,0.7 mL TMOS,靜置硅化1 h后離心洗滌備用。以Triton X-100的質(zhì)量濃度為變量,在30%的濃度基礎(chǔ)上進(jìn)行梯度稀釋,獲得濃度為0.3%、0.4%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的溶液。各取1 mL上述溶液加入到已制得的固定化酶中浸泡1 h,離心棄上清用蒸餾水洗滌一次后,檢測酶活。

1.2.3.6 不同酶比例下固定化酶重復(fù)使用性 分別將不同比例下(WGOx∶WHRP分別為1∶4,1∶3,1∶2,1∶1)的固定化酶連續(xù)反應(yīng)7次,檢測酶活。

1.2.3.7 儲藏穩(wěn)定性 分別將游離雙酶和固定化雙酶在4 ℃儲藏30 d后,檢測游離雙酶和固定化雙酶的剩余酶活。相對酶活R(Relative activity,%)為以同一組實(shí)驗(yàn)內(nèi)酶活力最高點(diǎn)記為100%,相對酶活則為其他數(shù)據(jù)點(diǎn)酶活值與此最高值之比。

1.2.4 酶活測定方法 在此雙酶體系中,GOx催化底物葡萄糖產(chǎn)生原位H2O2,HRP催化原位H2O2與苯酚反應(yīng)生成有色基團(tuán),根據(jù)此反應(yīng)體系在500 nm下吸光值表征雙酶體系的催化速率。

1.2.4.1 底物溶液的配制 A液,0.35 mg 4-AAP和1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%苯酚溶于20 mL 0.1 mmol/mL PBS中。B液,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%的葡萄糖溶液。

1.2.4.2 游離GOx活性測定 在1 cm比色皿中,加1.5 mL A液、1.5 mL B液,充分混合,作為參比液;取一定量未固定的GOx于10 cm離心管中,加入1.5 mL A液混勻,加入1.5 mL B液的同時開始計時,測定其反應(yīng)30 s時在500 nm下吸光值。

1.2.4.3 固定GOx活性測定 在1 cm比色皿中,加1.5 mL A液、1.5 mL B液,充分混合,作為參比液;取一定量固定化的GOx于10 cm離心管中,加入1.5 mL A液混勻,加入1.5 mL B液的同時開始計時,磁力攪拌反應(yīng)1 min,以針筒式過濾器迅速過濾分離出固定化GOx以終止反應(yīng),測上清液在500 nm下吸光值。

1.2.5 SEM表征 固定化酶氧化硅粉體形貌采用Hitachi S-4300場發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行分析,樣品用無水乙醇超聲分散10 min,滴于硅片上,待乙醇完全揮發(fā)后觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 誘導(dǎo)劑用量

酶活隨PDADMA用量的變化情況如圖1所示。結(jié)果表明,當(dāng)PDADMA的量為200 μL時酶活最高(相對濃度為0.02 mg PDADMA/mg脂質(zhì)體,脂質(zhì)體濃度為:18.75 mg/mL)。當(dāng)PDADMA用量較低時不能充分發(fā)揮脂質(zhì)體的模板作用,即PDADMA只能誘導(dǎo)少部分脂質(zhì)體表面形成氧化硅微囊,其余為僅由脂質(zhì)體包埋的囊狀結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體本身結(jié)構(gòu)比較脆弱,在外界條件干擾下(振蕩、攪拌等)易發(fā)生破裂,導(dǎo)致包埋失效,使固定化酶在洗滌過程中流失,所以隨著PDADMA用量增加酶活逐漸升高,直至達(dá)到最大值。當(dāng)PDADMA用量超過最適值(酶活最高時對應(yīng)的PDADMA的量)后,過量的PDADMA不僅誘導(dǎo)脂質(zhì)體表面進(jìn)行硅化,同時也使脂質(zhì)體發(fā)生粘連作用,導(dǎo)致脂質(zhì)體的比表面積減小,分散性降低,嚴(yán)重影響硅化質(zhì)量;此外,過量游離的PDADMA會使模板失去作用,即TMOS不借助脂質(zhì)體的作用而形成不規(guī)則的結(jié)構(gòu),這兩者都是導(dǎo)致酶活逐漸下降的原因,這與前人的報道結(jié)果[26]一致。

圖1 PDADMA的用量與固定化酶活性的關(guān)系Fig.1 The relationship between the amount of PDADMA and the immobilized enzyme

2.2 超聲時間

超聲時間對固定化酶活性的影響如圖2所示。結(jié)果表明,在一定時間范圍內(nèi)隨超聲時間延長酶活逐漸升高,在50 min時達(dá)到最大,達(dá)到最大值之后隨著超聲時間的延長酶活逐漸降低。

圖2 超聲時間對固定化酶活性影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the activity of immobilized enzyme

2.3 前驅(qū)體水解液用量

酶活力隨TMOS用量的變化情況如圖3所示。當(dāng)TMOS鹽酸水解液的用量為0.7 mL時酶活最高(0.306 mg TMOS/mg脂質(zhì)體,脂質(zhì)體濃度為:18.75 mg/mL)。TMOS可以在酸性水環(huán)境中迅速水解完全,而無需使用助溶劑來提高其水解能力。TMOS水解得到帶有四個硅氧鍵的溶膠粒子,縮聚能力極強(qiáng),酶分子的加入更是加劇了溶膠粒子的縮聚速度。當(dāng)前軀體TMOS的量較低時只能利用一部分脂質(zhì)體在誘導(dǎo)劑的作用下形成納米氧化硅微囊。隨TMOS用量的增加,利用脂質(zhì)體的量也逐漸升高,形成的包埋雙酶的氧化硅微囊逐漸增加,酶活逐漸升高直到達(dá)到最大。由于脂質(zhì)體本身為納米級微粒,良好的分散性是保證酶與底物充分接觸、產(chǎn)物及時擴(kuò)散出微囊的必要條件,所以當(dāng)TMOS的用量超過最適值后,水解生成的大量硅酸會提高環(huán)境中的離子強(qiáng)度,影響脂質(zhì)體的分散效果[26],導(dǎo)致酶活逐漸下降。

圖3 TMOS的用量對固定化酶活性的影響Fig.3 Effect of TMOS amount on the relativeactivity of immobilized enzyme

2.4 WGOx與WHRP比例

酶活隨雙酶比例的變化情況如圖4所示。結(jié)果表明,隨著GOx/HRP比例的降低,酶活逐漸升高,GOx催化葡萄糖分解產(chǎn)生的H2O2逐漸跟HRP反應(yīng)。當(dāng)GOx/HRP=1/4時酶活性最高,在此比例時,GOx催化葡萄糖分解產(chǎn)生的H2O2可能恰好與HRP反應(yīng)完全,在苯酚和4-AAP的作用下產(chǎn)生大量粉色物質(zhì);當(dāng)GOx過量時,HRP成為反應(yīng)限制因素,GOx催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的過量H2O2,受脂質(zhì)體的阻滯作用向微囊外擴(kuò)散速率緩慢,導(dǎo)致其在氧化硅微囊中局部積累,對GOx產(chǎn)生抑制作用,所以此時測得的酶活較低;當(dāng)HRP過量時,GOx為限制因素,其含量逐漸降低使產(chǎn)生的H2O2量逐漸減少,同樣使雙酶體系表現(xiàn)較低活性。

圖4 雙酶比例對固定化酶活性的影響Fig.4 The effect of activity of the ratio of GOx and HRP on immobilized enzyme

2.5 Triton X-100濃度的影響

酶活與Triton X-100的濃度變化關(guān)系如圖5所示。結(jié)果表明在低濃度范圍內(nèi)隨著洗滌劑濃度的升高酶活逐漸增大,經(jīng)濃度為1%的Triton X-100溶液浸泡的固化酶活性最高,超過該濃度后酶活逐漸下降最后維持在0.4左右。首先,Triton X-100作為一種非離子型的表面活性劑具有洗滌去污作用,能夠分解作為模板的脂質(zhì)體,增加底物和酶的接觸機(jī)會,有效地降低傳質(zhì)阻力;同時它能分解氧化硅微囊之間粘連的脂質(zhì),在一定程度上提高微囊的分散性,增大了底物進(jìn)入微囊的概率[27],這兩點(diǎn)都是導(dǎo)致在一定范圍內(nèi)隨著濃度升高酶活增大的原因。當(dāng)TritonX-100溶液的濃度超過一定值后,過量的去污劑不僅會分解脂質(zhì)體模板,而且會破壞氧化硅微囊的骨架結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶釋放出來,經(jīng)洗滌后流失,從而導(dǎo)致酶活逐漸下降。酶活降低到一定值后Triton X-100的濃度對酶活基本不再產(chǎn)生較大影響。

圖5 Triton X-100的濃度對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of Triton X-100 concentration on the relative activity of immobilized enzyme

2.6 固定化酶SEM表征

采用薄膜分散法所得固定化雙酶氧化硅微囊見圖6,其為球形粒子,其大小在200 nm左右,表面比較光滑,彼此之間有團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖6 固定化GOx 的SEM圖 Fig.6 SEM image of immobilized GOx particles

2.7 不同比例下固定化酶重復(fù)使用性

固定化酶可以有效解決反應(yīng)后產(chǎn)物分離和重復(fù)使用兩大問題,在一定程度上可以降低生產(chǎn)成本。所以,固定化酶的重復(fù)使用性是評價其性能優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。固定雙酶系統(tǒng)的重復(fù)使用性見圖7。隨著反應(yīng)次數(shù)增加,酶活力逐漸降低。當(dāng)GOx∶HRP=1∶4時,酶活力損失程度較低,一方面是因?yàn)檠趸栉⒛医Y(jié)構(gòu)將內(nèi)部酶系統(tǒng)和外界環(huán)境隔離開來,使GOx催化葡萄糖分解產(chǎn)生的H2O2聚集在微囊內(nèi),為反應(yīng)提供較高底物濃度的微環(huán)境,提高反應(yīng)速率。另一方面,隨著GOx含量升高,H2O2在反應(yīng)微環(huán)境內(nèi)富集現(xiàn)象明顯,導(dǎo)致H2O2局部濃度過高,對HRP產(chǎn)生毒害抑制作用,所以隨著GOx/HRP的升高酶活損失逐漸增大。另外,重復(fù)使用多次,酶的相對活性下降,這是因?yàn)槊看畏磻?yīng)會有部分酶分子泄露,而且產(chǎn)物富集會堵塞氧化硅的孔道,造成表觀酶活下降[28]。

圖7 固定化酶的重復(fù)使用性Fig.7 The number of reuses of immobilized enzyme

2.8 儲藏穩(wěn)定性

目前來說衡量固定化酶性能優(yōu)劣的一個非常重要的指標(biāo)就是儲藏穩(wěn)定性。如圖8所示,經(jīng)過30 d的4 ℃冷藏存放后,游離雙酶系統(tǒng)活性為最初的65.5%,而固定化雙酶系統(tǒng)則為74.1%。一般來說微生物的降解作用是酶儲存過程中活力喪失的主要原因,固定化酶的微孔結(jié)構(gòu)是防止微生物降解的主要屏障,所以固定化酶的儲藏穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。

圖8 固定化酶的儲藏穩(wěn)定性Fig.8 The storage stability of immobilized enzyme

3 結(jié)論

將仿生硅化與脂質(zhì)體技術(shù)相結(jié)合,在室溫條件下,實(shí)現(xiàn)了對葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的同時固定,得到粒徑分布在200 nm左右的固定化酶微囊。研究發(fā)現(xiàn),在200 μL PDADMA、0.7 mL TMOS、超聲50 min制得的固定化酶活性最高。在此優(yōu)化條件下制備的固定化酶經(jīng)重復(fù)使用7次,依然達(dá)到初始催化酶活的61.46%,經(jīng)一個月冷藏后酶活仍能達(dá)到最初的74.1%。固定化雙酶較游離雙酶表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性及對變性劑的耐受能力。該固定化方法,既克服了有機(jī)載體易溶脹、機(jī)械強(qiáng)度差和無機(jī)載體質(zhì)地脆、易破碎等缺點(diǎn),又實(shí)現(xiàn)對氧化硅載體形貌的控制,獲得了活性和穩(wěn)定性較高的固定化雙酶,為新型固定化酶系統(tǒng)的設(shè)計提供了新思路。

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[28]Zhu Y N,Jiang Y J,Gao J,et al. Immobilization of glucose oxidase in liposome-templated biomimetic silica particles[J]. Chinese Journal of Catalysis,2013,34:741-750.

權(quán)威·核心·領(lǐng)先·實(shí)用·全面

Immobilization of glucose oxidase and horseradish peroxidase in biomimetic silica particles

ZHOU Ran1,SONG Yu-pin1,LIU Xiao-mei1,XUN He-feng1,HOU Dong-mei1,WU Xin-rui2,LIU Ling-jun3

(1.School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China;2.School of Chemical Engineering,Heibei University of Technology,Tianjin 300130,China;3.Hebei San Yuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050000,China)

The fractional step method was applied to immobilize GOx and HRP by the combination of biomimetic silicification and liposome technology,using amine as an inducer,liposome as template. The time of ultrasonic,the dosage of PDADMA,the dosage of TMOS and the concentration of TritonX-100 on the effect of enzyme activity were studied. The results showed that the immobilized enzyme prepared with 200 μL PDADMA,0.7 mL TMOS,1% Triton X-100 and 50 min for ultrasound had the highest activity. The results of SEM showed that immobilized enzyme particles were near-spheres,which were about 200 nm. The immobilized enzyme prepared under the optimal conditions could be of higher stability and recovery rate. The immobilized enzyme repeated seven cycles could still retain 61.46% of its initial activity. In the storage of the 30 days,the relative activity of immobilized GOx could still retain 74.1% of its initial activity. Thus,the stability of the double enzyme system has been significantly improved after immobilization.

biomimetic silicification;liposome;glucose oxidase;horseradish peroxidase;nanosilica microcapsule

2016-07-18

周冉(1981-)女，博士，講師，研究方向：載體材料制備，E-mail：helly30072004@163.com。

河北省自然科學(xué)基金(H2016106034)；石家莊學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(20160421)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.034