張 培,申鉉日,李 川,段慶飛,王科威

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張 培,申鉉日*,李 川*,段慶飛,王科威

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

以金鯧魚內(nèi)臟為原料,依次采用pH7.0的磷酸鈉緩沖液浸提,0～55%硫酸銨沉淀,Sephadex G-100和Sephadex G-50凝膠過濾法得到純化的酸性蛋白酶,并研究了其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明,純化酶的分子量為18.5 ku,最適pH為4.0,最適溫度為35 ℃,具有較好的酸穩(wěn)定性和耐鹽能力;以血紅蛋白為底物時(shí),該蛋白酶的米氏常數(shù)Km為10.13 g/L;胃蛋白酶抑制劑(pepstatin A)對(duì)該酶活性有抑制作用,而乙二胺四乙酸(EDTA)、反-環(huán)氧丁二?；?L-亮氨酰胺基(4-胍基)丁烷(E-64)和苯甲基磺酰氟(PMSF)對(duì)此酶活性基本無(wú)影響,據(jù)此推斷該蛋白酶是一種天冬氨酸蛋白酶;此酶對(duì)羅非魚魚皮明膠的酶解能力強(qiáng)于豬胃蛋白酶,與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的能力相近。

金鯧魚,內(nèi)臟,酸性蛋白酶,酶學(xué)性質(zhì)

蛋白酶是市場(chǎng)上需求最大的三種酶之一[1],在食品[2]、藥品[3]和化工[4]等方面都有著廣泛的應(yīng)用。蛋白酶主要來(lái)源是陸生動(dòng)物、植物和微生物,但來(lái)源于海洋和其他水生動(dòng)物的蛋白酶并沒有被廣泛應(yīng)用。有研究報(bào)道指出,一些水生來(lái)源蛋白酶在大范圍pH和溫度條件下都具有高活性,在食品加工中具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。

食品加工行業(yè)對(duì)魚類蛋白水解酶的需求量日益增加。魚內(nèi)臟是水產(chǎn)品的加工過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)品之一,可作為提取蛋白酶的重要來(lái)源。魚內(nèi)臟中主要的消化蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和膠原酶)。酸性蛋白酶最適活性在pH2.0～4.0之間,而堿性蛋白酶最適活性在pH8.0～10.0之間[6]。天冬氨酸蛋白酶一般在酸性或中性pH范圍內(nèi)呈現(xiàn)活性,并且在活性位點(diǎn)都包含兩個(gè)天冬氨酸殘基[7]。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從沙丁魚[8]、鱸魚[9]和黃鱔[7]等魚類內(nèi)臟器官中分離出了天冬氨酸蛋白酶。

金鯧魚是我國(guó)南方沿海重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一,其魚肉細(xì)嫩,味道鮮美,國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)金鯧魚的需求不斷上升。目前,對(duì)于金鯧魚內(nèi)臟酶類資源的開發(fā)利用研究較少。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶進(jìn)行分離純化,并對(duì)分離純化的酸性蛋白酶性質(zhì)進(jìn)行初步研究,為該酶的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮金鯧魚 海口沿江三路市場(chǎng);蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Thermo Fisher公司;胃蛋白酶(1200 U/g) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木瓜蛋白酶(2000 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg) 西寧龐博生物工程有限公司;Sephadex G-100、Sephadex G-50 北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;牛血紅蛋白、E-64、pepstatin A、PMSF 美國(guó)Sigma公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

ST-16R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司;TV-1900/TV-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DYY-2C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶提取物的制備 粗酶提取物的制備參考肖鑫鑫等[10]的方法作適當(dāng)修改。具體方法如下:新鮮的金鯧魚即殺后取內(nèi)臟(46 g),使用冷蒸餾水洗凈,將內(nèi)臟切成小段,加入預(yù)冷的三倍體積50 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)進(jìn)行勻漿,置于4 ℃下浸提3 h,離心(10000×g,15 min),所得上清液即為金鯧魚內(nèi)臟粗酶提取物。

1.2.2 分離純化

1.2.2.1 硫酸銨沉淀 金鯧魚內(nèi)臟粗酶粗提物(155 mL)經(jīng)0～55%飽和度硫酸銨沉淀后,在4 ℃,10000×g下離心15 min,沉淀溶解在5 mL的50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中,然后在4 ℃的蒸餾水中透析24 h,每8 h換一次蒸餾水。

1.2.2.2 Sephadex G-100凝膠過濾層析 透析液上樣于Sephadex G-100凝膠柱(1.6 cm×100 cm),采用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)進(jìn)行平衡,并用相同的緩沖液洗脫,流速為1.2 mL/min,3.6 mL/管,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,收集活性峰。在冷蒸餾水中透析12 h后冷凍干燥。

1.2.2.3 Sephadex G-50凝膠過濾層析 將凍干樣品溶解于2 mL,50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中,上樣于Sephadex G-50凝膠柱(1.6 cm×100 cm),采用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡柱子,并用相同緩沖液進(jìn)行洗脫,流速為1.2 mL/min,3.6 mL/管,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,收集活性峰。在冷蒸餾水中透析12 h后冷凍干燥。

1.2.3 酶活測(cè)定 蛋白酶活性的測(cè)定參考Anson等[11]的方法并適當(dāng)修改,具體測(cè)定方法如下:50 μL酶液與500 μL 0.1 mol/L甘氨酸-HCl緩沖液(pH4.0)混合,加入500 μL 2%酸變性牛血紅蛋白后開始反應(yīng)。在35 ℃下孵育20 min后,混合物添加500 μL的20.0%三氯乙酸(TCA),然后在10000×g下離心10 min。上清液在280 nm下測(cè)定吸光度。在上述反應(yīng)體系中,將20 min內(nèi)蛋白酶消化底物使其上清液吸光度增加1.0定義為一個(gè)酶活單位。蛋白酶活重復(fù)測(cè)定,重復(fù)樣本間的差異小于5%;中間值被采用。

1.2.4 蛋白含量測(cè)定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品,按Lowry法[12]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 蛋白酶分子量測(cè)定 根據(jù)Laemmli法[13],采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定,分離膠濃度為12.5%。

1.2.6 最適pH和溫度 在35 ℃下,以2%牛血紅蛋白作為底物,pH1.0～7.0的范圍內(nèi)測(cè)定酶活來(lái)確定酶的最適pH。在pH4.0,20～60 ℃的不同溫度條件下測(cè)定酶活,計(jì)算相對(duì)酶活來(lái)確定最適溫度。最適pH和溫度下的酶活設(shè)定為100%。選用的緩沖液體系為:100 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液,pH1.0～4.0;100 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液,pH5.0～6.0;100 mmol/L磷酸緩沖液,pH7.0。

1.2.7 pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 將酶置于不同pH環(huán)境中處理30 min后,在35 ℃下,以2%牛血紅蛋白為底物,測(cè)定酶液殘余活力,以確定金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶pH穩(wěn)定性。酶液分別在20、30、35、40、50、60 ℃條件下處理30 min后,測(cè)定酶液殘余活力,以確定金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶熱穩(wěn)定性。

1.2.8 NaCl濃度對(duì)酶活的影響 分別測(cè)定NaCl濃度為5%、10%、15%、20%和25%條件下的酶活,不加NaCl作為空白對(duì)照組,對(duì)應(yīng)的酶活設(shè)定為100%。

1.2.9 米氏常數(shù)Km的測(cè)定 在35 ℃,pH4.0的條件下分別以質(zhì)量濃度為5、4、3、2、1、0.5 g/L的血紅蛋白溶液為底物,用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)作圖,y=0時(shí)的x負(fù)倒數(shù)即為Km值。

1.2.10 抑制劑對(duì)酶活的影響 分別添加四種不同類型的蛋白酶抑制劑(pepstatin A、E-64、EDTA和PMSF)到酶液中,使其終濃度分別為:0.1 mg/mL、0.1 mg/mL、5 mmol/L和5 mmol/L?；旌衔?5 ℃下放置30 min后,以血紅蛋白為底物分別測(cè)定其相對(duì)活力,以不添加抑制劑的酶液活性作為對(duì)照,設(shè)為100%。

1.2.11 幾種不同蛋白酶對(duì)羅非魚魚皮明膠酶解能力研究 羅非魚魚皮明膠采用郭培等[14]的方法制備。取1 mL濃度為10 mg/mL的羅非魚皮明膠溶液,加入0.85 U的金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶、豬胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶,然后在各自適宜的pH和溫度(金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶為pH4.0,35 ℃;豬胃蛋白酶為pH2.0,37 ℃;木瓜蛋白酶為pH6.0,50 ℃;堿性蛋白酶為pH10.0,50 ℃)下反應(yīng)60 min后,煮沸3 min終止反應(yīng)。用分離膠為7.5%,濃縮膠為4.5%的SDS-PAGE檢測(cè)反應(yīng)后的分子量分布。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析 每組實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行三次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn),用SPSS 19.0 for Windows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用Origin 7.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的分離純化

金鯧魚內(nèi)臟粗提物經(jīng)0～55%飽和度的硫酸銨沉淀后,運(yùn)用Sephadex G-100層析柱洗脫,如圖1(A)得到5個(gè)蛋白峰,第1個(gè)峰酶活最高,合并活性峰組分,透析凍干后,上樣于Sephadex G-50層析柱,如圖1(B)所示,得到3個(gè)蛋白峰,收集合并活性最高峰峰1,透析凍干后備用。

圖1 金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的純化圖Fig.1 Sephadex G-100(A),Sephadex G-50(B)column chromatographic profiles for purification of acid protease from golden pompano viscera注:A:Sephadex G-100凝膠層析;B:Sephadex G-50凝膠層析。

純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,經(jīng)過硫酸銨鹽析、Sephadex G-100和Sephadex G-50凝膠過濾等一系列步驟純化后,得到12.65 mg蛋白,酶活得率為20.95%,純化倍數(shù)為17.79。Khaled等[8]從沙丁魚內(nèi)臟中分離出的天冬氨酸蛋白酶得率為23.3%,純化倍數(shù)為9.47。林建城等[15]從日本鰻鱺腸道中分離出蛋白酶得率為42.01%,純化倍數(shù)為18.12。實(shí)驗(yàn)中純化得率較低可能是由于分離純化過程沒有達(dá)到最優(yōu)化,造成蛋白酶的損失。

SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示,考馬斯亮藍(lán)染色顯示一條蛋白帶,純化酶相對(duì)分子量約為18.5 ku。該分子量低于黃鱔[16]胃部蛋白酶(36 ku)和魷魚[17]肝胰腺中組織蛋白酶D(36.5 ku)的分子量。與Khaled等[8]從沙丁魚內(nèi)臟中提取的天冬氨酸蛋白酶分子量接近(17 ku)。

圖2 金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of acid proteasefrom golden pompano viscera注:1:蛋白Marke;2:純化酶。

2.2 pH對(duì)純化酶酶活及穩(wěn)定性的影響

如圖3最適pH曲線所示,純化酶在pH4.0酶活達(dá)到最大值,說(shuō)明該酶的最適pH為4.0,為酸性蛋白酶。隨著pH的升高,金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶在pH1.0～4.0范圍內(nèi)活性逐漸增加;在pH4.0～7.0范圍內(nèi)活性逐漸減小。pH為1.0和7.0時(shí)酶活較低,推測(cè)可能由于蛋白酶在強(qiáng)酸和中性條件下,自身所帶電荷數(shù)改變從而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化引起。

圖3 pH對(duì)純化酶酶活及穩(wěn)定性的影響Fig.3 The effect of pH on the activity and stability of purified protease

如圖3 pH穩(wěn)定性曲線所示,純化酶在偏酸性環(huán)境下有較高的穩(wěn)定性,在35 ℃下孵育30 min后,在pH1.0～5.0范圍內(nèi)酶活維持了初始活性的60%以上。這與之前的研究結(jié)果相符,Khaled等[8]從沙丁魚中提取出一種酸性蛋白酶在pH1.0～5.0條件下穩(wěn)定。

2.3 溫度對(duì)純化酶的酶活及穩(wěn)定性影響

金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的溫度曲線如圖4所示。在35 ℃下達(dá)到最大值,說(shuō)明其最適溫度為35 ℃。隨著溫度的升高,金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶在20～35 ℃范圍內(nèi)活性逐漸增加;在35～60 ℃范圍內(nèi)活性逐漸減小。該酶最適溫度低于長(zhǎng)鰭金槍魚[18](50 ℃)和海鯛[19](45 ℃)酸性蛋白酶,與歐洲鰻鱺[20](35 ℃)酸性蛋白酶相同。最適溫度的不同可能與生長(zhǎng)環(huán)境和物種導(dǎo)致的酶構(gòu)效差異有關(guān)。

圖4 溫度對(duì)純化酶酶活及穩(wěn)定性的影響Fig.4 The effect of tempreature on the activity and stability of purified protease

熱穩(wěn)定性曲線如圖4所示。金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶表現(xiàn)出一定的耐熱性,20～40 ℃時(shí)孵育30 min仍保持60%以上的活性。溫度高于40 ℃,酶活急劇下降。60 ℃下殘留活性降至24.4%。

2.4 NaCl濃度對(duì)酶活的影響

NaCl濃度對(duì)金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶酶活的影響如圖5所示。隨著NaCl濃度的增加,酶活逐漸降低。當(dāng)NaCl濃度為10%時(shí),相對(duì)活性為60.27%;濃度為25%時(shí),相對(duì)活性降至31.5%?；钚越档涂赡苡捎贜aCl濃度增加引起“鹽析”作用有關(guān)。高濃度的氯化鈉可能與酶競(jìng)爭(zhēng)水結(jié)合,導(dǎo)致更強(qiáng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,從而引起沉淀。Khaled等[8]報(bào)道了沙丁魚純化酶在10% NaCl濃度下相對(duì)活性降為20%。Klomklao等[21]也報(bào)道了一種鱈魚胃中提取的兩種蛋白酶活性隨著NaCl濃度的升高而活性降低。

圖5 NaCl濃度對(duì)純化酶酶活的影響Fig.5 The effect of NaCl concentration on the activity of purified protease

2.5 酶的米氏常數(shù)Km

通過測(cè)定不同底物濃度下的反應(yīng)速度,可以確定酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)Km。采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法),以1/V為縱坐標(biāo),1/[S]為橫坐標(biāo)作圖。如圖6所示,金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的Km為10.13 g/L。

圖6 Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk

2.6 抑制劑對(duì)酶活的影響

不同抑制劑對(duì)金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶活性的影響如表2所示,Pepstatin A(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)對(duì)純化酶活性有強(qiáng)烈抑制作用,說(shuō)明該酶活性中心具有天冬氨酸殘基,是一種天冬氨酸蛋白酶;E-64(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)、EDTA(金屬蛋白酶抑制劑)和PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)對(duì)純化酶活力基本無(wú)影響,說(shuō)明該酶可能不屬于半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。

表2 不同抑制劑對(duì)金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of inhibitors on activity of acid protease from golden pompano viscera

注:ND代表未檢出。

2.7 幾種不同蛋白酶對(duì)羅非魚魚皮明膠酶解能力研究

圖7 羅非魚魚皮明膠酶解產(chǎn)物電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of Tilapia skin gelatin hydrolysates注:1:未添加酶的羅非魚魚皮明膠;2:純化酶處理明膠;3:豬胃蛋白酶處理明膠;4:木瓜蛋白酶處理明膠;5:堿性蛋白酶處理明膠。

圖7為利用不同蛋白酶酶解羅非魚魚皮明膠獲得的明膠水解產(chǎn)物的電泳圖,如泳道1所示,不添加酶的羅非魚魚皮明膠電泳圖上方有膠原蛋白特征的3條帶,分別為α1、α2和β鏈。分析試樣2～5的電泳條帶可知,添加酶反應(yīng)60 min后,大分子量條帶均呈現(xiàn)不同程度的水解現(xiàn)象。其中金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶處理的明膠水解產(chǎn)物與豬胃蛋白酶處理組相比分子量更小,說(shuō)明金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶對(duì)羅非魚明膠的酶解能力強(qiáng)于胃蛋白酶。該結(jié)果與肖鑫鑫等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。內(nèi)臟酸性蛋白酶處理的明膠水解產(chǎn)物與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶處理組相近,說(shuō)明金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶對(duì)羅非魚明膠的酶解能力與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶相似。酶法是制備明膠水解產(chǎn)物的方法之一,酶促水解得到的水解明膠分子量分布較窄,容易被人體吸收。Ngo等[22]使用不同的蛋白酶酶解羅非魚魚鱗明膠制備出具有抗氧化活性的水解產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)可為金鯧魚內(nèi)臟蛋白酶制備小分子膠原蛋白肽的應(yīng)用方面提供參考。

3 結(jié)論

本研究經(jīng)純化得到的金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶比酶活為45.72 U/mg,純化倍數(shù)為17.79,回收率為20.95%;SDS-PAGE測(cè)定該酶的分子量約為18.5 ku。金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的最適pH為4.0,最適溫度為35 ℃,具有較好的酸穩(wěn)定性和耐鹽能力。該酶的米氏常數(shù)Km為10.13 g/L,天冬氨酸蛋白酶抑制劑Pepstatin A能強(qiáng)烈抑制其酶活,而E-64、EDTA和PMSF對(duì)其基本沒有抑制效果,說(shuō)明該酶屬于天冬氨酸蛋白酶類。用純化得到的金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶酶解羅非魚魚皮明膠,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其酶解能力強(qiáng)于豬胃蛋白酶,與木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶相似。本文為金鯧魚內(nèi)臟酸性蛋白酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

[1]吳燕燕,李來(lái)好,郝志明,等. 羅非魚腸蛋白酶的分離純化及其性質(zhì)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào),2010,34(3):357-366.

[2]何林玲,何貝,張霞. 蛋白酶在食品加工中的應(yīng)用進(jìn)展研究[J]. 食品工程,2014(1):12-14.

[3]Fujishiro M,Oka M,Yahagi N,et al. Correlation of serum pepsinogens and gross appearances combined with histology in early gastric cancer[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research Cr,2006,25(2):207-212.

[4]趙昌俊. 蛋白酶在洗衣皂中的應(yīng)用研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué),2015.

[5]Jellouli,Bougatef K,Daassi A,et al. New alkaline trypsin from the intestine of Grey triggerfish(Balistescapriscus)with high activity at low temperature:Purification and characterization[J]. Food Chemistry,2009(3):664-650.

[6]Khaled H B,Bougatef A,Balti R,et al. Isolation and characterisation of trypsin from sardinelle(Sardinellaaurita)viscera[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,2008,88(15):2654-2662.

[7]吳濤. 黃鱔和歐洲鰻鱺胃蛋白酶原的分離純化與酶的性質(zhì)研究[D]. 廈門:集美大學(xué),2009.

[8]Khaled H B,Ghorbel-Bellaaj O,Hmidet N,et al. A novel aspartic protease from the viscera of Sardinelle(Sardinellaaurita):Purification and characterisation[J]. Food Chemistry,2011,128(4):847-853.

[9]Miura Y,Kageyama T,Moriyama A. Pepsinogens and pepsins from largemouth bass,Micropterus salmoides:Purification and characterization with special reference to high proteolytic activities of bass enzymes[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2015,183:42-48.

[10]肖鑫鑫,申鉉日,張培. 金鯧魚內(nèi)臟復(fù)合蛋白酶的分離及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 食品科技,2015(9):140-145.

[11]Anson M L. The estimation of pepsin,trypsin,papain,and cathepsin with hemoglobin[J]. The Journal of General Physiology,1938,22:79-89.

[12]Lowry Q H,Rosebrough N J,Farr L A,et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry,1951,193:256-275.

[13]Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227(5259):680-685.

[14]郭培,申鉉日,徐翠紅,等. 一種添加魚皮明膠的羅非魚魚碎肉魚糜制品的配方研究[J]. 食品科技,2015(9):128-132.

[15]林建城,王國(guó)玲,閔志勇. 日本鰻鱺腸道蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,43(1):45-52.

[16]Weng W Y,Wu T,Chen W Q,et al. Purification and characterization of pepsinogens and pepsins from the stomach of rice field eel(MonopterusalbusZuiew)[J]. Fish Physiology & Biochemistry,2011,37(3):543-552.

[17]Komai T,Kawabata C,Amano M,et al. Todarepsin,a new cathepsin D from hepatopancreas of Japanese common squid(Todarodespacificus)[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology,2004,137(3):373-382.

[18]Nalinanon S,Benjakul S,Kishimura H. Biochemical properties of pepsinogen and pepsin from the stomach of albacore tuna(Thunnusalalunga)[J]. Food Chemistry,2010,121(1):49-55.

[19]Zhou Q,Fu X P,Zhang L J,et al. Purification and characterization of sea bream(SparuslatusHouttuyn)pepsinogens and pepsins[J]. Food Chemistry,2007,103(3):795-801.

[20]Wu T,Sun L C,Du C H,et al. Identification of pepsinogens and pepsins from the stomach of European eel(Anguillaanguilla)[J]. Food Chemistry,2009,115(1):137-142.

[21]Klomklao S,Kishimura H,Yabe M,et al. Purification and characterization of two pepsins from the stomach of pectoral rattail(Coryphaenoidespectoralis)[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B,2007,147(4):682-689.

[22]Ngo D H,Qian Z J,Ryu B M,et al.Invitroantioxidant activity of a peptide isolated from Nile tilapia(Oreochromisniloticus)scale gelatin in free radical-mediated oxidative systems[J]. Journal of Functional Foods,2010,2(2):107-117.

Isolation,purification and enzymatic characterization of acid protease from golden pompano viscera

ZHANG Pei,SHEN Xuan-ri*,LI Chuan*,DUAN Qing-fei,WANG Ke-wei

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Golden pompano viscera was taken as raw material in the present study. Acid protease was obtained by homogenation of tissue in sodium phosphate buffer(pH7.0),precipitation by 0～55% ammonium sulfate,Sephadex G-100 gel and Sephadex G-50 gel.Then the enzymatic characterization was also studied. The experimental results showed that the molecular weight of purification enzyme was 18.5 ku,the optimum pH was 4.0 and the most suitable temperature was 35 ℃. It had good acid stability and salt tolerance. Using hemoglobin as a substrate,the Kmwas 10.13 g/L. Pepstatin A inhibited the enzyme,while EDTA,E-64 and PMSF had no influence on the enzyme,which indicated that this enzyme was probably aspartic proteinase. It had the similar hydrolysis ability of gelatin of tilapia fish skin to papain and alkaline protease,and stronger than porcine pepsin.

golden pompano;viscera;acid protease;characterization

2016-08-09

張培(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)資源高效利用技術(shù)，E-mail:zhangpeilzx2014@163.com。

*通訊作者:申鉉日(1968-)，男，博士，教授，研究方向：海洋生物資源利用、食品科學(xué)、組織工程學(xué)，E-mail:shenxuanri2009@163.com。 李川(1986-)，男，博士，講師，研究方向：熱帶水產(chǎn)品的精深加工、食品營(yíng)養(yǎng)與功能評(píng)價(jià)，E-mail:lichuanbest@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31260376)；海南省科協(xié)青年科技英才學(xué)術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(HAST201624)；海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KYQD1609)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)02-0210-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.032