吳思雅,張志東,龐學群,朱 璇,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,廣東廣州 510642)

阿克蘇紅富士蘋果采后腐爛病原真菌的分離與鑒定

吳思雅1,張志東2,龐學群3,朱 璇1,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,廣東廣州 510642)

為了明確阿克蘇紅富士蘋果采后腐爛的主要病原菌種類。通過對阿克蘇紅富士蘋果采后常溫和低溫條件下自然發(fā)病的果實進行病原菌的分離篩選,采用經(jīng)典微生物分離篩選方法,結合形態(tài)學觀察、基因間隔序列(Internal transcribed spacer,ITS)、28S核糖體大亞基序列(large subunit rDNA,rDNA-LSU)及微管蛋白B(Beta tubulin,β-tubulin)序列的測定方法,并進行系統(tǒng)進化樹的構建;同時,進行菌株的回接及病斑形態(tài)的驗證。最終從腐爛的阿克蘇紅富士蘋果病斑中分離出2類真菌,由形態(tài)學觀察初步確定為鏈格孢霉(Alternariasp.)和青霉(Penicilliumsp.),通過進一步的多基因序列分析及菌株的回接及病斑的觀察鑒定2種真菌分別為交鏈格孢霉(Alternariaalternata)和擴展青霉(Penicilliumexpansum)。本研究結果可為新疆阿克蘇紅富士采后病原真菌的快速鑒定及病害的防治提供理論依據(jù)。

蘋果,采后病害,微管蛋白B,基因間隔序列,28S核糖體大亞基序列

新疆阿克蘇位于新疆天山南麓,塔里木盆地北緣,土地肥沃,光線充足,該地區(qū)適合種植各種農(nóng)作物和林果,且林果業(yè)種植面積已達到45萬畝,享有“中國紅富士之鄉(xiāng)”之名,新疆阿克蘇蘋果已經(jīng)通過有機果品基地認證,紅富士蘋果因果肉脆而多汁,味道芳香爽口,深受廣大消費者的喜愛,是我國蘋果的主要栽培和出口品種[1]。目前,我區(qū)阿克蘇蘋果的種植面積已達21.4萬畝,年產(chǎn)量達5000萬噸,但是由于采后保存方法的局限性,且隨著采后貯藏期的延長，果實質地會不斷變化,同時還伴隨果實腐爛,據(jù)不完全統(tǒng)計,蘋果爛果率達10%～18%,這嚴重影響了其經(jīng)濟效益,因此研究阿克蘇紅富士蘋果的保鮮品質和預防腐爛在我國保鮮領域中具有重要意義[2]。

果蔬在采后貯藏期間，病原真菌侵染而造成的腐爛是導致其損失的主要原因。傳統(tǒng)病原菌的鑒定方法主要是根據(jù)形態(tài)特征、分生孢子梗及菌落形態(tài)來進行分類,然而由于許多病原菌形態(tài)特征難以獲得及其培養(yǎng)性狀的可變性,此方法具有一定的局限性,存在著需要經(jīng)驗,耗時較長等問題。與傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定相比,基因間隔序列(Internal transcribed spacer,ITS)是中度保守區(qū)域,其保守性基本上表現(xiàn)為種內相對一致,種間差異比較明顯,ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內物種間或種內差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析。由于ITS的序列分析能實質性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異,此外ITS序列片段較小、易于分析,目前已被廣泛應用于真菌屬內不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[3-8]。早在1963年,Ledbetter和Porter最先報道在植物細胞中存在微管結構。微管蛋白是微管的組成單位,由α-tubulin蛋白和β-tubulin蛋白組成,其中β-tubulin蛋白由β-tubulin基因所編碼[9]。由于β-tubulin基因既有保守的外顯子又有許多內含子,已被用于真菌各級分類水平上的系統(tǒng)發(fā)育研究[10-11]。28S核糖體大亞基序列(large subunit rDNA,rDNA-LSU)主要由26S/28S rDNA組成,在生物體內含量較大且包括與核糖體功能密切相關的保守核心區(qū)段[12]。

由于ITS、LSU、β-tubulin基因序列在病原真菌的鑒定中具有簡便快捷,準確性高等優(yōu)點,故本研究采用形態(tài)學結合ITS、LSU及β-tubulin技術對新疆阿克蘇紅富士蘋果采后病原菌進行鑒定,為病害的進一步防治提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋果 于2015年11月采摘于新疆阿克蘇紅旗坡鄉(xiāng);馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基、察氏(CA)培養(yǎng)基 江萊生物;真菌基因組DNA提取試劑盒 上海生物工程;DNA純化試劑盒 上海鼎國生物技術有限公司;磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、硫酸亞鐵、氯化鉀、蔗糖、瓊脂、葡萄糖、無水乙醇、其余試劑 均為化學純。

超凈工作臺 蘇州凈化設備廠;YXQ-SG46-280S高壓滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;生化培養(yǎng)箱 江蘇南通五金電器廠;XSP-2CA顯微鏡 廈門Motic實業(yè)集團有限公司;PCRDL9700擴增儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 挑取表面有腐爛癥狀的蘋果分別放于常溫和低溫(4 ℃,RH95%)讓其自然發(fā)病備用。對180個蘋果進行了病原菌的分離,獲得了兩株菌種,通過菌落形態(tài)學觀察初步確定為兩類。

采集典型發(fā)病的紅富士蘋果果實,切取病健交界處組織放置于70%酒精溶液中約30 s,以殺滅所帶雜菌,然后置于無菌水中沖洗3次,參考方中達所述方法[7],將沖洗干凈的組織分別移置到PDA培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)。待菌落生長到1 cm時用接種針刮取菌的邊緣,移植在新的培養(yǎng)基上,劃線培養(yǎng),直到形成單一菌種。

采用涂布法培養(yǎng),將腐爛的蘋果組織用滅菌的生理鹽水做10倍梯度的稀釋,混合均勻后,用移液槍分別吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7七個稀釋梯度的樣品稀釋液各0.2 mL涂布于PDA培養(yǎng)基中,每個稀釋梯度涂布3個平板,設3個重復,恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃的條件下培養(yǎng)5～7 d,使長出單菌落。

采用稀釋純化法,菌落平板內加20 μL滅菌水,輕輕搖晃,倒入滅菌燒杯內,加30 μL滅菌水稀釋,取一滴于顯微鏡下觀察,不斷稀釋到每一小滴懸液中只有一個孢子,用滅菌水沖洗到培養(yǎng)基上,靜置10 min后,倒去多余的懸液,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌的鑒定

1.2.2.1 病原菌的形態(tài)學鑒定 根據(jù)病原菌在蘋果果實上的發(fā)病癥狀,再結合病原菌在PDA和CA上的菌落特征,菌絲形態(tài),分生孢子形態(tài),大小和數(shù)量,分生孢子梗形態(tài)特征,厚垣孢子的有無、形態(tài)和大小等,參照魏景超[13]《真菌鑒定手冊》和張?zhí)煊睢吨袊婢尽穂14],對病原菌進行形態(tài)學鑒定。

1.2.2.2 病原菌的分子生物學鑒定 采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA,作為PCR擴增的模板。采用真菌通用引物ITS1:5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3′,NL41:GGTCCGTGTTTCA AGACGG擴增菌株的rDNA ITS1區(qū)和LSU D1/D2區(qū)序列。PCR采用25 μL反應體系,通過Ex Taq(TaKaRa)進行。反應條件:95 ℃變性45 s,58 ℃復性30 s,72 ℃延伸1.5 min,共35個循環(huán);采用真菌通用引物BT1819R:TTCCGTCCCGACAACTTCGT,BT2916F:CTCAGCCTCAGTGAACTCCAT擴增菌株的β-tubulin基因序列。反應條件:95 ℃變性45 s,55 ℃復性30 s,72 ℃延伸1.5 min,共35個循環(huán)。上述PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化,交由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行測序。

將從實驗菌株的所獲得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行相似性序列比對,確定實驗菌株親緣關系最近的種屬。并從數(shù)據(jù)庫獲得相關序列,利用MEGA 5.0軟件包[15]進行聚類分析,并采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)、最小進化法(Minimum Evolution,ME)和最大似然法(maximum likelihood,ML)構建系統(tǒng)進化樹,分析各種樹的穩(wěn)定性,以確定菌種生物學分類地位。

1.2.3 回接侵染實驗 分別配制鏈格孢霉和擴展青霉的孢子懸浮液,選取無病害的阿克蘇蘋果果實,采用針刺傷果實接種,分別對鏈格孢霉和擴展青霉進行蘋果的回接侵染實驗,以無菌水作對照。接種后的蘋果果實放置于相對濕度約95%的塑料盒中,于20 ℃條件下貯藏,觀察發(fā)病癥狀并統(tǒng)計發(fā)病率。發(fā)病率(%)=腐爛果個數(shù)/回接總果數(shù)。

2 結果與分析

2.1 新疆阿克蘇紅富士采后病原菌的篩選

從新疆阿克蘇紅旗鄉(xiāng)采樣,采樣完成后,置于常溫一周后,挑取表面有腐爛癥狀的蘋果,主要發(fā)現(xiàn)病斑有兩種形態(tài),經(jīng)過分離純化獲得觀察菌落形態(tài)學初步確定為兩類(A、B)。

圖3 基于菌株A rDNA ITS區(qū)和LSU D1/D2區(qū)序列的NJ進化樹Fig.3 Neighbor-joining tree based on phylogenetic analysis of ITS and LSUD1/D2 regions sequences of isolate A

2.2 新疆阿克蘇紅富士采后病原菌形態(tài)學鑒定

2.2.1 病原菌A形態(tài)學鑒定 由圖1可知,菌株A可在果實表面或內部發(fā)病,先形成褐色水漬斑,之后生出白色菌絲,然后長出青色或綠色霉層,最后導致全果腐爛。菌落在CA上25 ℃培養(yǎng)12 d,直徑38～52 mm,有少量的放射狀皺紋,近與平坦或有多道同心環(huán)紋;質地絨狀,在菌落邊緣或全部菌落面有粉末狀、顆粒狀;分生孢子結構大量產(chǎn)生,藍綠色或微黃藍綠色,近于白屈菜綠色、鼠尾草綠色(Celandine green,Sage green,R.RI.XLVII)、林肯綠色或葉綠素(Lincoln green,leafgreen,R.RI.XLVII);菌絲體白色;滲出液少量,淡黃色或近于無色,也有缺乏者;反面淡黃色、黃褐色或紫褐色;可溶性色素通常存在,近于較淡的反面顏色。參照魏景超[20]《真菌鑒定手冊》和張?zhí)煊頪21]《中國真菌志》初步鑒定為青霉屬(Penicilliumsp.)。

圖1 病原真菌A的形態(tài)及培養(yǎng)性狀Fig.1 Form and culture character of pathogenic fungi A

2.2.2 病原菌B形態(tài)學鑒定 由圖2可知病原菌B在蘋果果實上的發(fā)病癥狀為病斑較硬,略凹陷,表面有褐色或者黑色孢子霉層。菌株在PDA平板上,初為灰白色,氣生菌絲薄層絮狀,產(chǎn)孢后為淺綠色至褐色,有明顯的輪紋,培養(yǎng)一周的菌落直徑為69～86.2 mm。分生孢子串生,孢子倒棍型或長卵型,具有柱狀的喙。分生孢子梗單生,分枝或不分枝,淺褐色,有隔2～7個,長21.5～59.2 μm。參照魏景超[20]《真菌鑒定手冊》和張?zhí)煊頪21]《中國真菌志》初步鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)。

圖2 病原真菌B的形態(tài)及培養(yǎng)性狀Fig.2 Form and culture character of pathogenic fungi B

2.3 新疆阿克蘇紅富士采后病原菌分子學鑒定結果

2.3.1 病原菌A的分子鑒定 通過實驗獲得的病原菌A rDNA ITS區(qū)和LSU D1/D2區(qū)序列與GeneBank中序列比對,調取與之最為相近菌種相關序列,使用MEGA 5.0進行Clustal X多重比對,分別利用NJ、MP、ML法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,NJ法系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖3、圖4所示。

結果表明,病原菌A歸屬于青霉屬,其與PenicilliumexpansumNRRL 32293、CNU 7002和NRRL 35231有較高同源性,支持率為100%。進一步利用β-tubulin基因序列構建進化樹表明,病原菌A與PenicilliumexpansumPSN396具有較高同源性,支持率為100%,確定病原菌A為擴展青霉(Penicilliumexpansum)。

圖6 基于菌株B β-tubulin基因序列的NJ進化樹Fig.6 Neighbor-joining tree based on phylogenetic analysis of β-tubulin regions sequences of isolate B

圖4 基于菌株A β-tubulin基因序列的NJ進化樹Fig.4 Neighbor-joining tree based on phylogeneticanalysis of β-tubulin regions sequences of isolate A

2.3.2 病原菌B的分子鑒定 將測序獲得的病原菌B rDNA ITS區(qū)和LSU D1/D2區(qū)序列與GeneBank中序列比對,并調取與之最為相近菌種相關序列,使用MEGA 5.0進行Clustal X多重比對,分別利用NJ、MP、ML法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,NJ法系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖5、圖6所示。

圖5 基于菌株B rDNA ITS區(qū)和LSU D1/D2區(qū)序列的NJ進化樹Fig.5 Neighbor-joining tree based on phylogeneticanalysis of ITS and LSUD1/D2 regions sequences of isolate B

結果表明,病原菌B歸屬于鏈格孢屬(Alternaria),其與AlternariamaliAY154683,AlternariaalternataH02-747S-5和H02-781S-3b具有最高同源性,支持率為100%,與AlternariaburnsiiAB-03的同源較高,支持率為99.8%,無法確定具體歸屬。進一步利用β-tubulin基因序列構建進化樹表明,病原菌B與已知Alternariaalternata單獨形成一枝,支持率為100%,與已知菌株Alternariaalternata(HQ413316)、Alternariaalternata1E最高同源,支持率分別為100%和99.8%,且能很好的與Alternariamali,Alternariaburnsii分開。因此,確定病原菌B為鏈格孢霉(Alternariaalternata)。

2.4 回接侵染實驗

通過潛在病原菌的回接,發(fā)現(xiàn)菌株A、菌株B均會引起蘋果的發(fā)病(圖7、圖8),發(fā)病率統(tǒng)計見表1。菌株A主要會引起果實表面或內部發(fā)病,先形成褐色水漬斑,之后生出白色菌絲,然后長出青色或綠色霉層,最后導致全果腐爛,一旦發(fā)病后生長迅速,分生孢子面暗灰綠色或暗綠色、質地絨狀;菌株B主要會引起蘋果果實上的發(fā)病癥狀為病斑較硬,略凹陷,表面有褐色或者黑色孢子霉層,如圖7、圖8,其結果證明,菌株A、菌株B與上述形態(tài)學和分子生物學鑒定的菌種相同均為Penicilliumexpansum和Alternariaalternata。

表1 回接發(fā)病率統(tǒng)計Table 1 Incidence of tieback statistics

圖7 菌株A病果Fig.7 Strain is A disease of fruit

圖8 菌株B病果Fig.8 Strain is B disease of fruit

3 討論與結論

阿克蘇紅富士蘋果具有較高的經(jīng)濟價值,但在采后貯藏中,特別是貯藏條件不是很理想的情況下品質變化加快,并且有侵染型病害發(fā)生,降低、甚至失去商品價值,造成經(jīng)濟損失。通過形態(tài)學初步鑒定,采后引起蘋果腐爛的病原菌主要有:鏈格孢霉(Alternariasp.)和青霉(Penicilliumsp.)。隨著分子生物學的不斷發(fā)展,基因間隔序列(Internal transcribed spacer,ITS)、28S核糖體大亞基序列(large subunit rDNA,rDNA-LSU)及微管蛋白B(Beta tubulin,β-tubulin)進行病原菌鑒定技術廣泛應用于棗、甜瓜、蘆筍、櫻桃、李、香梨、杏等產(chǎn)品采后病原菌的鑒定中[16-21],此方法從分子水平上對病原菌進行了準確鑒定,為果蔬采后病害研究提供了理論依據(jù)。

本實驗以新疆阿克蘇紅富士蘋果為主要原料,通過形態(tài)學結合ITS、LSU、β-tubulin的方法,最后進行侵染回接實驗對實驗結果進行驗證,引起紅富士蘋果果實采后腐爛的主要病原真菌有兩種,分別為交孢鏈格孢霉(Alternariaalternata)和擴展青霉(Penicilliumexpansum);但是由于病原果實取材范圍較窄,若想全面地揭示引起蘋果果實采后病原菌的種類和優(yōu)勢菌株等問題,需要進一步擴大采樣范圍,且隨著分子生物學的迅猛發(fā)展,對蘋果果實主要病原菌更深入的研究將成為可能,對延長果實貯藏保鮮具有重要意義。

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Isolation and identification of main pathogenic fungus from post-harvest Akesu Fuji apple fruits

WU Si-ya1,ZHANG Zhi-dong2,PANG Xue-qun3,ZHU Xuan1,*

(1.Institute of Food Sciece,Xinjiag Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Institute of Microbiology,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830091,China;3.College of Life Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

The objective of this project was to clarify the main pathogenic fungus on harvested Akesu Fuji apple after rotten. The harvested Akesu Fuji apple was used for the isolation and screening of pathogenic bacteria under the condition of room temperature and low temperature.The method was the classical microorganism of isolation and screening with the morphological observation,the internal transcribed spacer,(ITS)28S ribosomal(large subunit rDNA,rDNA-LSU)and testing the sequence of microtubulin B(Beta tubulin,β-tubulin)as well as the structure of phylogenetic tree. Meanwhile the verification of tie-back of bacterial strain and the lesion were conducted.The lesion was separated into two fungus from the storage of red Fuji apple,and also the two fungus were identified asAlternariasp. andPenicilliumsp. through the morphological observation. Further sequence analysis using the tie-back of bacterial train and lesion confirmed that,the two types of Fuji wereAlternariaalternataandPenicilliumexpansum.This study provided the theoretical basis for the research of rapid identification of pathogenic bacteria in harvested Akesu red Fuji apple in Xinjiang.

apple;pathogens after harvest;β-tubulin;ITS;LSU

2016-06-15

吳思雅(1993-)，女，碩士研究生,研究方向：果蔬貯藏與保鮮，E-mail:wsy930218@sina.com。

*通訊作者:朱璇(1971-)，女，博士，教授，研究方向：果蔬貯藏與保鮮，E-mail：zx9927@126.com。

國家科技支撐計劃(2015BAD16B07)。

TS255

A

1002-0306(2017)02-0205-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.031