王 芳,陸文俊,楊 靜,別小妹

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

高產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌的誘變選育研究

王 芳,陸文俊,楊 靜,別小妹*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

為獲得細(xì)菌素高產(chǎn)菌株,以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JLA-9為出發(fā)菌株,對(duì)其進(jìn)行亞硝基胍(NTG)誘變、常壓室溫等離子體(ARTP)誘變,以及基因組改組。結(jié)果表明,亞硝基胍誘變的最佳濃度為4 mg/mL,經(jīng)篩選得到兩株突變株N4-26、N4-27,其抑菌效價(jià)分別為2531.93、3057.32 IU/mL;常壓室溫等離子體誘變最佳時(shí)間為10 s,經(jīng)篩選得到兩株突變株ARTP10-37、ARTP10-61,其抑菌效價(jià)分別為2974.27、3261.62 IU/mL。將上述抑菌效價(jià)提高的菌株經(jīng)四輪基因組改組后,得到一株突變株F4-2,其抑菌效價(jià)達(dá)到7374.76 IU/mL,相對(duì)于原始菌株提高了2.35倍,且遺傳穩(wěn)定性良好。研究表明理化誘變結(jié)合基因組改組的方式是快速獲得理想菌株的有效方法。

細(xì)菌素,植物乳桿菌,誘變,基因組改組

細(xì)菌素是由核糖體合成的一些有生物活性的多肽或蛋白質(zhì),對(duì)親緣關(guān)系較近的微生物有較強(qiáng)的抑制作用[1-2],還有一些有廣譜抑菌活性[3-7]。幾乎所有細(xì)菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素[8-9],因?yàn)槠涞鞍滋匦?可被蛋白酶降解,因此被廣泛研究。但從自然界分離得到的菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力較低,無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要,通過(guò)傳統(tǒng)理化誘變及復(fù)合誘變獲得高產(chǎn)菌株的研究較多[10],但因其周期長(zhǎng)、工作量大、誘變效率低[11],人們開(kāi)始尋找其他更有效的方法。

基因組改組被譽(yù)為菌株改良技術(shù)和代謝工程中的里程碑[12],它是以原生質(zhì)體融合的方式對(duì)親本菌株進(jìn)行整個(gè)基因組的隨機(jī)重組,以期獲得目的性狀富集的菌株[13]。與傳統(tǒng)誘變方法相比,基因組改組更高效,更方便,不要求了解菌株的遺傳背景、代謝途徑等,可以避開(kāi)公眾對(duì)基因修飾菌的反感[11,14-15]。許多研究者先采用理化誘變方法獲得性狀提升的菌株,再經(jīng)過(guò)幾輪的基因組改組獲得理想菌株,為了提高產(chǎn)物產(chǎn)量[15-18],或?yàn)榱颂岣呔陮?duì)不良環(huán)境耐性[16-17],或?yàn)榱颂岣叩孜镛D(zhuǎn)化率[15,19-20]等等。實(shí)踐證明,通過(guò)傳統(tǒng)理化誘變與基因組改組相結(jié)合的方式改造菌株,是獲得高產(chǎn)細(xì)菌素菌株的有效方式[18,21]。

前期研究中,已分離出一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的植物乳桿菌,命名為L(zhǎng)actobacillusplantarumJLA-9[22]。本研究的目的是通過(guò)基因組改組提高該菌株的抑菌能力,用于基因組改組的菌株是原始菌株經(jīng)亞硝基胍(NTG)和常壓室溫等離子體(ARTP)誘變得到的,以蠟樣芽孢桿菌(AS 1.1846)作為指示菌。本研究將以L.plantarumJLA-9為原始菌株,通過(guò)亞硝基胍(NTG)和常壓室溫等離子體(ARTP)誘變得到細(xì)菌素產(chǎn)量提高的菌株,并以此為親本庫(kù)進(jìn)行基因組改組,獲得抑菌能力顯著提高的菌株,并測(cè)試其遺傳穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)JLA-9 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室分離保藏,已保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.10686);指示菌蠟樣芽孢桿菌(AS 1.1846) 來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心;MRS、NA培養(yǎng)基、生理鹽水 參考文獻(xiàn)配制[10];Nisin標(biāo)準(zhǔn)品 抑菌效價(jià)1000000 IU/g,Sigma公司。

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;Anke DL-5-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) SHIMADZU;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ARTP誘變育種儀 無(wú)錫源清天木生物科技有限公司;數(shù)顯游標(biāo)卡尺 上海恒量量具制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1LactobacillusplantarumJLA-9生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將于-20 ℃甘油管保存的L.plantarumJLA-9劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h。然后將活化好的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中(1%,v/v),在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、36、40、44、48 h時(shí)間點(diǎn)取樣,測(cè)定其OD值、pH。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD值、pH分別為縱坐標(biāo),繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 Nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定 通常情況下,細(xì)菌素以Nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定其相對(duì)抑菌效價(jià)。Nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法如下[10]:準(zhǔn)確稱取0.10 g Nisin溶于10 mL 0.02 mol/L的稀鹽酸中,得到效價(jià)為10000 IU/mL的母液,通過(guò)稀釋分別得到效價(jià)為5000、2500、1000、500、250 IU/mL的Nisin溶液。采用牛津杯法做抑菌實(shí)驗(yàn),以蠟樣芽孢桿菌為指示菌,繪制Nisin效價(jià)對(duì)數(shù)值和抑菌圈直徑之間的散點(diǎn)圖,添加趨勢(shì)線,得到Nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.2976X-1.6382,R2=0.9974,式中:Y代表Nisin效價(jià)對(duì)數(shù)值;X代表抑菌圈直徑,mm。

1.2.3 誘變方法 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期(16 h)的菌液離心(8000 r/min,10 min),棄上清液,用生理鹽水洗滌2次并重懸得到菌懸液(108CFU/mL)。

1.2.3.1 亞硝基胍(NTG)誘變 移取1 mL菌懸液于2 mL滅菌離心管中,加入亞硝基胍母液(50 mg/mL)使其終濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL。混勻后37 ℃水浴20 min,處理完成后立即用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適的梯度(10-5～10-6),取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基,于 37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng),以未經(jīng)亞硝基胍處理的菌懸液作為對(duì)照,培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)[23]并計(jì)算致死率。挑取單菌落發(fā)酵(37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h)并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)[24],計(jì)算正突變率。通過(guò)致死率和正突變率確定最佳的亞硝基胍誘變濃度。多次在最佳亞硝基胍誘變濃度下誘變?cè)季?通過(guò)初篩和復(fù)篩篩選抑菌效價(jià)明顯提高的菌株。

亞硝基胍母液(50 mg/mL):稱取500 mg亞硝基胍固體,溶于10 mL丙酮,經(jīng)0.45 μL濾膜過(guò)濾待用。

1.2.3.2 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變 將小鐵片在酒精燈上灼燒滅菌,置于滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中,待小鐵片冷卻后取10 μL菌懸液均勻涂在其上,放入ARTP誘變育種儀進(jìn)行處理。處理時(shí)間分別為2、3、5、10、12、15 s,處理相應(yīng)時(shí)間后用生理鹽水稀釋至合適的梯度(10-5～10-6),取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),以未經(jīng)ARTP誘變處理的菌懸液作對(duì)照,培養(yǎng)24 h后菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算致死率。挑取單菌落發(fā)酵并進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),計(jì)算正突變率。通過(guò)致死率和正突變率確定最佳的ARTP誘變時(shí)間。多次在最佳ARTP誘變時(shí)間下誘變?cè)季?通過(guò)初篩和復(fù)篩篩選抑菌效價(jià)明顯提高的菌株。

1.2.3.3 基因組改組 原生質(zhì)體制備、滅活與融合:將理化誘變得到的優(yōu)良菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,離心收集菌體,用原生質(zhì)體緩沖液洗滌兩次并重懸。向重懸菌液中加入溶菌酶溶液(50 mg/mL,20 μL),并于37 ℃水浴中處理10 min,處理完畢后立即離心(4000 r/min,15 min)去除酶液,并用原生質(zhì)體緩沖液洗滌兩次并重懸,得到原生質(zhì)體液。將原生質(zhì)體液分別采用紫外滅活(紫外照射距離為30 cm,照射時(shí)間為210 s)和熱滅活(58 ℃水浴中處理50 min)方法進(jìn)行滅活。取等量經(jīng)紫外滅活和熱滅活得到的原生質(zhì)體液混合,離心去上清,重懸于一定量原生質(zhì)體緩沖液中,加入9倍原生質(zhì)體緩沖液體積的促融劑PEG6000,體積分?jǐn)?shù)為40%,37 ℃水浴6 min,結(jié)束后立即用原生質(zhì)體緩沖液稀釋,離心重懸于原生質(zhì)體緩沖液中。將融合后的原生質(zhì)體溶液稀釋一定倍數(shù),涂于再生平板,37 ℃培養(yǎng)得到融合菌落。將融合后的原生質(zhì)體溶液稀釋到10-3～10-4,涂于再生平板,37 ℃培養(yǎng)48 h得到融合菌落?；蚪M改組:將NTG、ARTP誘變得到的菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合,將得到的融合子發(fā)酵進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),選擇抑菌效價(jià)高的作為第一輪改組菌株F1。將F1再次進(jìn)行原生質(zhì)體制備、滅活、融合,篩選抑菌效價(jià)高的菌株作為第二輪改組菌株F2,以此類推。

溶菌酶溶液(50 mg/mL):1 g溶菌酶(索萊寶)溶于5 mL原生質(zhì)體緩沖液,0.22 μL水相濾膜過(guò)濾除菌,-20 ℃冰箱保存。

原生質(zhì)體緩沖液配制:Tris-HCl 1.21 g,蔗糖171.14 g,MgCl2·6H2O 4.07 g,雙蒸水1 L,pH6.8,115 ℃,20 min滅菌備用。

再生培養(yǎng)基配制:在MRS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,不加吐溫-80,另加入明膠2.5%,25 mmol/L MgCl2,25 mmol/L CaCl2,0.5 mol/L蔗糖,1.7%瓊脂,115 ℃,30 min滅菌備用。

1.2.4 致死率與正突變率的計(jì)算 致死率(%)=(未處理平板菌落數(shù)-處理平板菌落數(shù))/未處理平板菌落數(shù)×100

正突變率(%)=抑菌效價(jià)提高菌落數(shù)/用于測(cè)定效價(jià)菌落數(shù)×100

1.2.5 細(xì)菌素高產(chǎn)菌株篩選

1.2.5.1 初篩 挑取單菌落用2 mL離心管進(jìn)行發(fā)酵(37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h),采用打孔法[10]進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),初步篩選出抑菌活性較好的菌株。

1.2.5.2 復(fù)篩 將初篩得到的菌株用三角瓶發(fā)酵,采用牛津杯法[10]進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),篩選得到抑菌相對(duì)效價(jià)明顯提高的菌株,用甘油管于-20 ℃保藏。

1.2.6 細(xì)菌素高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)試 將復(fù)篩得到的抑菌效價(jià)最高的菌株連續(xù)傳代5次，于37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測(cè)定其相對(duì)抑菌效價(jià)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)都做三組平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(SD)。數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1LactobacillusplantarumJLA-9生長(zhǎng)曲線測(cè)定

L.plantarumJLA-9接種后,在0～2 h處于延滯期,生長(zhǎng)緩慢,OD值無(wú)明顯變化;在2 h之后,菌株生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期,菌體密度迅速增加,pH迅速降低;16 h之后,菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期,OD值與pH均維持穩(wěn)定狀態(tài),發(fā)酵產(chǎn)物開(kāi)始積累。菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)誘變劑較敏感,且生長(zhǎng)狀態(tài)比較同步,為了保障一定的菌體量,因此選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期進(jìn)行誘變處理。對(duì)于菌株L.plantarumJLA-9,選擇16 h作為進(jìn)行理化誘變和原生質(zhì)體制備的菌株培養(yǎng)時(shí)間。

圖1 Lactobacillus plantarum JLA-9生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacillus plantarum JLA-9

2.2 亞硝基胍(NTG)誘變

選用終濃度為1.0～6.0 mg/mL的亞硝基胍對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變處理,涂布培養(yǎng)后結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出,隨著亞硝基胍濃度的增加,乳酸菌致死率不斷提高,當(dāng)亞硝基胍濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí),致死率達(dá)到75.5%,正突變率相對(duì)較高,為16.7%,因此選取4 mg/mL為最佳亞硝基胍誘變濃度。在此條件下進(jìn)行誘變,經(jīng)篩選得到8株抑菌活性提高的菌株(見(jiàn)圖3),其中兩株抑菌活性提高較大的菌株N4-26、N4-27,其抑菌效價(jià)分別為2531.93、3057.32 IU/mL,相對(duì)于原始菌株分別提高了14.94%、38.79%。

圖2 NTG誘變致死率與正突變率曲線Fig.2 The fatality rate curve and positive mutation rate curve of NTG mutagenesis

圖3 Lactobacillus plantarum JLA-9原始菌株與NTG誘變突變菌株相對(duì)效價(jià)的比較Fig.3 Comparison of the wild-type and mutant strains of Lactobacillus plantarum JLA-9 with NTG for relative potency

2.3 常壓室溫等離子體(ARTP)誘變

選用ARTP誘變處理時(shí)間分別為2、3、5、10、12、15 s對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變處理,涂布培養(yǎng)后結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出,隨著處理時(shí)間的增加,乳酸菌致死率不斷提高,當(dāng)處理時(shí)間為10 s時(shí)致死率為87.8%。此時(shí)菌株發(fā)生正向突變的概率為34.375%,因此選擇10 s作為ARTP最佳誘變時(shí)間。在此條件下進(jìn)行誘變,經(jīng)篩選得到8株抑菌活性提高的菌株(見(jiàn)圖5),其中兩株抑菌活性提高較大的菌株ARTP10-37、ARTP10-61,其抑菌效價(jià)分別為2974.27、3261.62 IU/mL,相對(duì)于原始菌株分別提高了35.02%、48.06%。

圖4 ARTP誘變致死率與正突變率曲線Fig.4 The fatality rate curve and positive mutation rate curve of ARTP mutagenesis

圖5 Lactobacillus plantarum JLA-9原始菌株與ARTP誘變突變菌株相對(duì)效價(jià)的比較Fig.5 Comparison of the wild-type and mutant strains of Lactobacillus plantarum JLA-9 with ARTP for relative potency

2.4 基因組改組

以NTG、ARTP誘變獲得的四株抑菌效價(jià)相對(duì)較高的菌株N4-26、N4-27、ARTP10-37、ARTP10-61為出發(fā)菌株進(jìn)行基因組改組。經(jīng)第一輪基因組改組,篩選到四株抑菌效價(jià)高的菌株,其中F1-23效價(jià)為2895.45 IU/mL,相對(duì)于原始菌株提高了31.44%;經(jīng)第二輪基因組改組,篩選到效價(jià)最高的菌株為F2-4,其效價(jià)為4026.17 IU/mL,相對(duì)于原始菌株提高了82.77%;以此類推,經(jīng)過(guò)四輪基因組改組,篩到一株抑菌效價(jià)最高的菌株F4-2,其效價(jià)達(dá)到7374.76 IU/mL,相對(duì)于原始菌株提高了2.35倍(見(jiàn)圖6)。

圖6 Lactobacillus plantarum JLA-9原始菌株與突變菌株相對(duì)效價(jià)的比較Fig.6 Comparison of the wild-type and mutant strains of Lactobacillus plantarum JLA-9 for relative potency

2.5 細(xì)菌素高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)試

為觀察篩選到的細(xì)菌素高產(chǎn)菌株F4-2的遺傳穩(wěn)定性,將其連續(xù)傳代5次,以蠟樣芽孢桿菌為指示菌,測(cè)定其相對(duì)抑菌效價(jià)變化。從圖7可以看出,菌種傳代5次以后抑菌效價(jià)無(wú)顯著差異(p<0.05),說(shuō)明該菌有較好的遺傳穩(wěn)定性,可作為后續(xù)應(yīng)用研究的出發(fā)菌株。

圖7 F4-2遺傳穩(wěn)定性Fig.7 Genetic stability of F4-2 after five generation注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

采用NTG、ARTP兩種理化方式對(duì)植物乳桿菌JLA-9(抑菌效價(jià)為2202.84 IU/mL)進(jìn)行誘變,以期獲得高產(chǎn)細(xì)菌素菌株。以致死率和正突變率為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)NTG濃度為4 mg/mL、ARTP處理時(shí)間為10 s時(shí),兩種誘變方式均能獲得較好的誘變效果。經(jīng)過(guò)篩選,得到4株效價(jià)有所提高的菌株,分別為N4-26、N4-27、ARTP10-37、ARTP10-61,其抑菌效價(jià)分別為2531.93、3057.32、2974.27、3261.62 IU/mL。將上述4株菌株進(jìn)行基因組改組,經(jīng)4次改組后,獲得一株抑菌效價(jià)明顯提高的菌株F4-2,其效價(jià)達(dá)到7374.76 IU/mL,相較于原始菌株,其效價(jià)提高了2.35倍。實(shí)踐證明,理化誘變結(jié)合基因組改組的方式是快速獲得理想菌株的有效方法。

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Study on screeging of high-yield bacteriocin producingLactobacillusplantarumstains induced by mutations

WANG Fang,LU Wen-jun,YANG Jing,BIE Xiao-mei*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

In order to obtain a high-yield bacteriocin producing strain,LactobacillusplantarumJLA-9 was used as the starting stain and mutagenized with nitrosoguanidine(NTG),atmospheric and room temperature plasma(ARTP)and genome shuffling. The results showed that the optimal concentration of NTG was 4 mg/mL,and two mutants named N4-26,N4-27 were obtained,the antibacterial titer of which were 2531.93 IU/mL,3057.32 IU/mL respectively. The optimal irradiation time of ARTP was 10 s,and two mutants named ARTP10-37,ARTP10-61 were obtained,the antibacterial titer of which were 2974.27 IU/mL,3261.62 IU/mL respectively. The four strains with higher inhibitory activity were subjected to recursive protoplast fusion. After four rounds of genome shuffling,a strain named F4-2 was screened. The antibacterial titer of strain F4-2 was increased to 7374.76 IU/mL,2.35 times compared with the wild-type strain. Research showed that physical and chemical mutagenesis combined with genome shuffling was an effective method for obtaining ideal strains.

bacteriocin;Lactobacillusplantarum;mutagenesis;genome shuffling

2016-06-13

王芳(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:2014108001@njau.edu.cn。

*通訊作者:別小妹(1964-)，女，博士，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail:bxm43@njau.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2017)02-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.028