張 超,吳建國(guó),易 駿,吳錦忠,鄭承劍,吳巖斌,*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建福州 350122;2.福建教育學(xué)院理科部,福建福州 350001;3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室,上海 200433)

HPLC-ELSD法測(cè)定三種植物基原金線蓮的金線蓮苷含量

張 超1,吳建國(guó)1,易 駿2,吳錦忠1,鄭承劍3,吳巖斌1,*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建福州 350122;2.福建教育學(xué)院理科部,福建福州 350001;3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室,上海 200433)

建立HPLC-ELSD法,測(cè)定三種植物基原金線蓮中金線蓮苷含量。采用phenomenex NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(92∶8,V/V)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫,流速為0.8 mL/min,柱溫室溫,ELSD霧化室溫度為70 ℃,氮?dú)饬魉贋?.5 L/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,金線蓮苷進(jìn)樣量在76.02～2432.64 μg/mL范圍內(nèi)線性良好(r=0.9991);精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD均≤3%;平均加樣回收率為97.55%,RSD為1.50%(n=6)。33批次金線蓮的金線蓮苷含量在6.37%～22.66%之間,平均含量為15.00%,存在較大的差異(RSD=26.29%)。該方法快速、簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,適用于金線蓮中金線蓮苷的定量分析。

金線蓮,金線蓮苷,HPLC-ELSD

金線蓮來(lái)源于蘭科(Orchidaceae)開(kāi)唇蘭屬(Anoectochilus)植物的新鮮或干燥全草。具有清熱涼血、祛風(fēng)利濕等功效,用于腎炎、膀胱炎、糖尿病、支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒急驚風(fēng)等癥[1]。金線蓮還未被《中國(guó)藥典》收載,對(duì)于金線蓮原植物的來(lái)源,一直以來(lái)也有較大爭(zhēng)議?！陡＝ㄖ兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》收載的金線蓮原植物來(lái)源為蘭科開(kāi)唇蘭屬植物花葉開(kāi)唇蘭(金線蘭)Anoectochilusroxburghii[1],《中國(guó)植物志》收載的金線蓮原植物來(lái)源為臺(tái)灣銀線蘭A.formosanus[2],《中華本草》、《全國(guó)中草藥匯編》等收載的金線蓮包括金線蘭和臺(tái)灣銀線蘭[3-4]。金線蓮是閩臺(tái)地方特色藥材,民間把金線蘭和臺(tái)灣銀線蘭都當(dāng)成金線蓮使用。另外,云南地區(qū)把滇越金線蘭A. chapaensis也當(dāng)成金線蓮使用[5-6]。以上這些不同植物基原的開(kāi)唇蘭屬植物都當(dāng)做金線蓮使用是否合理,仍有待探明。

金線蓮迄今尚未有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者多以黃酮的含量作為金線蓮質(zhì)量控制的主要模式,但這些成分缺乏專屬性,沒(méi)有體現(xiàn)與藥效的相關(guān)性,難以真正反映藥材內(nèi)在質(zhì)量。如測(cè)定金線蓮中槲皮素、山奈酚和異鼠李素等黃酮類成分的含量[7-10],而這些黃酮類成分既不是其主要有效成分,也不是其專屬性成分,檢測(cè)它們對(duì)其質(zhì)量控制幾乎沒(méi)有實(shí)際意義。因此,需要建立更加合理的評(píng)價(jià)指標(biāo),用于金線蓮的質(zhì)量控制。

金線蓮苷是金線蓮的特征性成分,是其主要的活性成分之一,在金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭和滇越金線蘭中均有分布,具有降血糖、抗炎、保肝、抗骨質(zhì)疏松、降血脂等生物活性[11-15]。目前有少量文獻(xiàn)報(bào)道金線蘭及金線蘭提取物中的金線蓮苷的含量[16-17],但是關(guān)于不同基原金線蓮的金線蓮苷含量比較研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用HPLC-ELSD法建立金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭和滇越金線蘭三種基原金線蓮的金線蓮苷含量,為金線蓮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金線蓮 16批組培金線蘭鮮品、8批組培臺(tái)灣銀線蘭鮮品均購(gòu)自福建省漳州市南靖縣,野生金線蘭和野生滇越金線蘭采自不同產(chǎn)地,金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭和滇越金線蘭均經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定,樣本存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院;金線蓮苷對(duì)照品 購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司,批號(hào):14052015;色譜乙腈 美國(guó)Fisher公司;甲醇 分析純;水 超純水。

1260高效液相色譜儀 安捷倫公司;Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)GRACE 公司;MS105DU電子天平 Mettler Toledo;DFT-200手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為phenomenex NH2(250 mm×4. 6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水(92∶8,V/V),等度洗脫;流速為0.8 mL/min;柱溫為室溫;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器霧化室溫度為70 ℃,載氣為高純氮?dú)?載氣流速1.5 L/min;進(jìn)樣量10 μL,比較DAD檢測(cè)器和ELSD檢測(cè)器對(duì)金線蓮苷測(cè)定結(jié)果的影響。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密量取金線蓮苷對(duì)照品12.67 mg(含金線蓮苷12.16 mg)到5 mL容量瓶,加甲醇到刻度,超聲溶解,配制成每1 mL含2.432 mg的金線蓮苷對(duì)照品溶液,即得。

1.2.3 樣品溶液的制備 取新鮮金線蓮,60 ℃干燥,粉碎,過(guò)60目篩得金線蓮藥材粉末。取金線蓮0.5 g,精密稱定,置具塞三角瓶中,精密加入甲醇100 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)40 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失重,搖勻,0.22 μm濾膜濾過(guò),即得。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 將對(duì)照品溶液稀釋至2432.64、1216.32、304.08、152.04、76.02 μg/mL,進(jìn)樣10 μL,測(cè)定峰面積,以峰面積積分值(A)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(y),對(duì)照品濃度B的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得到金線蓮苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下制備的金線蓮苷對(duì)照品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。

1.2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(NO.24)0.5 g,平行稱取6份,按“1.2.3”項(xiàng)下處理,按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,記錄峰面積。

1.2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(NO.24)0.5 g,按“1.2.3”項(xiàng)下處理,按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件,分別于0、2、4、6、12、24、48 h測(cè)定,記錄峰面積。

1.2.5.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含有量的樣品(NO.24)0.25 g,平行稱定6份,精密稱定,置50 mL容量瓶中,精密加入對(duì)照品15 mg(含金線蓮苷14.40 mg),加甲醇至刻度,浸泡20 min,250 W超聲40 min,按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算回收率。

1.2.6 樣品含量的測(cè)定 取不同植物基原的金線蓮藥材各0.5 g,以“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣10 μL,按“1.2.1”項(xiàng)下測(cè)定峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

以乙腈-水(92∶8,V/V)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫,流速為0.8 mL/min,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器霧化室溫度為70 ℃,載氣流速1.5 L/min,可有效分離出金線蓮苷,結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1(A、B、C、D)分別為金線蓮苷對(duì)照品HPLC色譜圖和三種不同基原金線蓮(金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭、滇越金線)樣品溶液的HPLC色譜圖。結(jié)果證明,在該色譜條件下,目標(biāo)成分和其他雜質(zhì)峰分離良好。

圖1 金線蓮苷對(duì)照品和三種植物基原金線蓮樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of kinsenoside and Jin-Xian-Lian sample from three Anoectochilus species注:1.金線蓮苷;A.金線蓮苷對(duì)照品;B.金線蘭;C.臺(tái)灣銀線蘭;D.滇越金線蘭。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Result of recovery tests(n=6)

本實(shí)驗(yàn)比較了DAD檢測(cè)器和ELSD檢測(cè)器對(duì)金線蓮苷測(cè)定結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)金線蓮苷在較大濃度時(shí),其紫外吸收度不強(qiáng),而其他成分的吸收峰較強(qiáng),用DAD檢測(cè)器無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定金線蓮苷的含量,而采用ELSD檢測(cè)器測(cè)定金線蓮苷,金線蓮苷的吸收峰較強(qiáng),其他類成分的吸收較弱,因此選擇HPLC-ELSD測(cè)定金線蓮苷的含量。這與金線蓮苷的結(jié)構(gòu)有關(guān),金線蓮苷是葡萄糖與五元內(nèi)酯環(huán)的手性碳以氧苷鍵形式連接形成的苷,結(jié)構(gòu)中沒(méi)有共軛雙鍵,以DAD檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)只有末端吸收。另外,本實(shí)驗(yàn)比較了不同色譜柱對(duì)金線蓮苷的分離效果,考察了YMC-Pack-ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm)、YMC-Triart C18(250 mm×4. 6 mm,5 μm)、phenomenex NH2(250 mm×4.6 mm,5 μm),發(fā)現(xiàn)采用YMC-Pack-ODS-A和YMC-Triart C18色譜柱分離金線蓮苷,以5%乙腈-水進(jìn)行等度洗脫,金線蓮苷的出峰時(shí)間在3 min左右,而且溶劑峰和其他成分的干擾較大,無(wú)法準(zhǔn)確定量,當(dāng)采用phenomenex NH2氨基柱,以92%乙腈-水等度洗脫時(shí),金線蓮苷的出峰時(shí)間在10 min以后,其分離度比較好,避免了溶劑峰以及其他成分的干擾,故選擇phenomenex NH2氨基柱進(jìn)行分離。這可能是因?yàn)榻鹁€蓮苷的極性偏大,以反相柱分離時(shí),過(guò)早出峰,而以正相柱分離可以得到較好的分離效果。

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

計(jì)算得到金線蓮苷含量測(cè)定的回歸方程:y=1.2891x+0.4179(r=0.9991),結(jié)果表明金線蓮苷在76.02～2432.64 μg/mL內(nèi)線性良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 計(jì)算結(jié)果顯示金線蓮苷峰面積的RSD值為2.06%,表明該方法測(cè)定金線蓮苷的含量精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 計(jì)算結(jié)果顯示金線蓮苷峰面積的RSD值為2.25%,表明該方法測(cè)定金線蓮苷的含量重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 計(jì)算結(jié)果顯示金線蓮苷峰面積的RSD值為2.79%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn) 回收率結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)果顯示,金線蓮苷的平均回收率為97.55%,RSD為1.50%,表明金線蓮苷的加樣回收率良好。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

33批次金線蓮的金線蓮苷含量有較大的差異,在6.37%～22.66%之間,其中批次16的組培臺(tái)灣銀線蘭的金線蓮苷含量最高,批次24的野生金線蓮的金線蓮苷含量最低,結(jié)果見(jiàn)表2。15批次組培金線蘭的金線蓮苷含量在12.54%～19.99%之間,其中批次1～5的組培金線蘭來(lái)自同一廠家,金線蓮苷的含量差異較小,在16.21%～17.83%之間,而批次6～15的組培金線蘭來(lái)自不同廠家,金線蓮苷的含量差異較大,在12.54%～19.99%之間;另外,8批次不同廠家的組培臺(tái)灣銀線蘭的金線蓮苷含量也具有一定的差異,這說(shuō)明不同公司生產(chǎn)的組培金線蘭和組培臺(tái)灣銀線蘭的外植體種源可能不一樣,此外組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、光源、光照時(shí)間等可能對(duì)金線蓮苷的積累也會(huì)有一定的關(guān)系。不同產(chǎn)地的野生金線蘭的金線蓮苷含量也差異懸殊,8批次野生金線蘭的金線蓮苷含量在6.37%～13.43%之間,2批次野生滇越金線蘭的金線蓮苷含量分別為12.44%和13.45%,這可能與不同的生長(zhǎng)年限、不同生態(tài)環(huán)境等有關(guān)。

本研究所收集的組培金線蘭和組培臺(tái)灣銀線蘭的金線蓮苷含量普遍高于野生金線蘭和野生滇越金線蘭,因此如果要從金線蓮中提取分離金線蓮苷,可考慮采用組培金線蘭或組培臺(tái)灣銀線蘭為原料進(jìn)行提取,這樣可以節(jié)約提取分離成本,也可避免該瀕危珍稀植物的過(guò)度采摘。此外,組培金線蓮的金線蓮苷含量雖然普遍高于野生金線蓮,但是組培金線蓮是否能替代野生金線蘭使用,這些都還有待進(jìn)一步的研究。

表2 三種植物基原金線蓮中金線蓮苷的含量Table 2 Determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from three Anoectochilus species

注:福建南靖組培金線蘭1～5來(lái)自同一廠家,6～15來(lái)自不同廠家;福建南靖組培銀線蘭1～8來(lái)自不同廠家。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示,33批次金線蓮的金線蓮苷含量在6.37%～22.66%之間,平均含量為15.00%,存在較大的差異(RSD=26.29%),提示不同植物基原、不同廠家、不同產(chǎn)地的金線蓮質(zhì)量可能存在較大差異。

本實(shí)驗(yàn)建立了不同植物基原金線蓮中金線蓮苷含量的HPLC-ELSD測(cè)定方法,該定量分析方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確,為綜合評(píng)價(jià)金線蓮的質(zhì)量提供參考。

[1]黃有霖.福建中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].福州:海風(fēng)出版社,2006:154.

[2]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].第17卷.北京:科學(xué)出版社,2000:204.

[3]國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草[M].第二十四卷.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:672.

[4]王國(guó)強(qiáng).全國(guó)中草藥匯編[M].卷二.北京:人民衛(wèi)生出版社,2014:656-657.

[5]張鐵,萬(wàn)京,沐建華.文山地區(qū)金線蓮種質(zhì)資源初步調(diào)查[J].文山師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào),2005,18(1):26-28.

[6]張鐵,李洪超,劉偉.文山野生金線蓮的RAPD鑒別[J].中藥材,2009,32(3):347-348.

[7]鄭成鳳,潘裕添,蔡文燕,等.HPLC-UV-MS/MS法對(duì)金線蓮中黃酮類組分的鑒定和測(cè)定[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2013,25(10):1381-1386.

[8]劉知遠(yuǎn),沈廷明,吳仲玉.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定福建產(chǎn)金線蓮中槲皮素、山柰素、異鼠李素的量[J].中草藥,2015,46(3):432-434.

[9]黃麗萍,黃麗英,林守二,等.液-質(zhì)聯(lián)用分析金線蓮中4種黃酮類化合物[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,49(2):72-77.

[10]關(guān)琛,王春蘭,郭順星,等.高效液相色譜法測(cè)定金線蓮中黃酮含量[J].藥物分析雜志,2008,28(1):9-11.

[11]Zhang Y,Cai J,Ruan H,et al. Antihyperglycemic activity of kinsenoside,a high yielding constituent from Anoectochilus roxburghii in streptozotocin diabetic rats[J]. J Ethnopharmacol,2007,114(2):141-145.

[12]Hsiao HB,Hsieh CC,Wu JB,et al. Kinsenoside inhibits the inflammatory mediator release in a type-II collagen induced arthritis mouse model by regulating the T cells responses[J]. BMC Complement Altern Med,2016,16(1):1-12.

[13]Hsieh WT,Tsai CT,Wu JB,et al. Kinsenoside,a high yielding constituent from Anoectochilus formosanus,inhibits carbon tetrachloride induced Kupffer cells mediated liver damage[J]. J Ethnopharmacol,2011,135(2):440-449.

[14]Hsiao HB,Lin H,Wu JB,et al. Kinsenoside prevents ovariectomy-induced bone loss and suppresses osteoclastogenesis by regulating classical NF-κB pathways[J]. Osteoporos Int,2013,24(5):1663-1676.

[15]Cheng KT,Wang YS,Chou HC,et al. Kinsenoside-mediated lipolysis through an AMPK-dependent pathway in C3H10T1/2 adipocytes:Roles of AMPK and PPARαin the lipolytic effect of kinsenoside[J]. Phytomedicine,2015,22(6):641-647.

[16]張錦文,唐菲,張小瓊,等.高效液相色譜法測(cè)定金線蓮中金線蓮苷的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2011,31(4):261-263.

[17]萬(wàn)婷,熊富良.HPLC-ELSD 法測(cè)定金線蓮提取物中金線蓮苷[J].中成藥,2014,36(7):1484-1488.

Content determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian
from threeAnoectochilusspecies by HPLC-ELSD

ZHANG Chao1,WU Jian-guo1,YI Jun2,WU Jin-zhong1,ZHENG Cheng-jian3,WU Yan-bin1,*

(1.Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China;2.Department of Chemistry and Life Science,Fujian institute of education,Fuzhou 350001,China;3.Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

To establish a HPLC-ELSD method for determination of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from threeAnoectochilusspecies,the HPLC system consisting of phenomenex NH2column(250 mm×4.6 mm,5 μm)and an isocratic elution system of acetonitrile-water(92∶8,V/V)as the mobile phase was adopted. The flow rate was set at 0.8 mL/min,the column temperature was room temperature,ELSD spray chamber temperature was 70 ℃,and the nitrogen flow rate was 1.5 L/min. The results indicated that the liner range of kinsenoside was 76.02～2432.64 μg/mL(r=0.9991);RSD of precision,stability and reproducibility tests were no more than 3%;average recovery rate was 97.55%(RSD=1.50%,n=6). The contents of kinsenoside in Jin-Xian-Lian from threeAnoectochilusspecies were in the range of 6.37%～22.66%,and the average content was 15.00%(RSD=26.29%). This method was quick,simple,accurate and reliable,and could be used to determine the content of kinsenoside in Jin-Xian-Lian.

Jin-Xian-Lian;kinsenoside;HPLC-ELSD

2016-07-05

張超(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分及品質(zhì)評(píng)價(jià)研究，E-mail:zzcc4911@163.com。

*通訊作者:吳巖斌(1982-)，男，碩士，助理研究員，研究方向:中藥資源品質(zhì)評(píng)價(jià)，E-mail:wxsq1@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81603230)；福州市科學(xué)技術(shù)局市校合作項(xiàng)目(2014-G-61)；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管-重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)(X2014138學(xué)科)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)02-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.006