郭蕊，傅鈺，龍鴻

高等植物生長發(fā)育是一個(gè)持續(xù)的過程，其胚后發(fā)育主要經(jīng)歷了營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段。營養(yǎng)生長是促成高等植物早期形態(tài)的必經(jīng)階段，由幼齡期和成熟期構(gòu)成[1]。從幼齡期過渡到成熟期就發(fā)生了營養(yǎng)生長時(shí)相轉(zhuǎn)變（vegetative phase change,VPC），經(jīng)歷這個(gè)轉(zhuǎn)變后，植物才具有開花能力，從而進(jìn)入生殖生長時(shí)期，完成整個(gè)生活史[2]。

高等植物VPC過程會伴隨著營養(yǎng)生長狀態(tài)的變化。模式植物擬南芥的研究表明，幼齡期的葉片邊緣光滑，葉片近圓形，葉基角較小，只有近軸面表皮毛；而成熟期的葉片邊緣出現(xiàn)鋸齒，葉片近匙形，葉片基角增大，近軸面和遠(yuǎn)軸面均具有表皮毛[2]。對VPC的相關(guān)分子研究表明，MicroRNA（miRNA） precursormiR156在VPC中發(fā)揮重要作用，幼齡期表達(dá)量高，成熟期表達(dá)量低[3-5]。

植物通過內(nèi)在的“鐘”來應(yīng)答夜長及其調(diào)控，以保證其在24 h的節(jié)律中生長發(fā)育，即所謂的生物鐘[6]。LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）、CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1（CCA1）和TIMING OF CABEXPRESSION1（TOC1）3個(gè)基因構(gòu)成了生物鐘的一個(gè)反饋環(huán)，其中LHY結(jié)合CCA1負(fù)調(diào)控TOC1表達(dá)，TOC1則正向調(diào)控LHY和CCA1表達(dá)[7]。VPC與植物自身的生物節(jié)律聯(lián)系緊密，但是生物鐘相關(guān)基因?qū)PC的影響還不清楚。本研究通過觀察研究擬南芥lhy、cca1突變體的VPC過程，探討LHY、CCA1基因?qū)PC的影響，為生物節(jié)律與VPC之間的關(guān)聯(lián)提供試驗(yàn)依據(jù)。解析VPC的分子機(jī)制，對于果樹生產(chǎn)上盡早結(jié)束幼齡期（童期）而進(jìn)入成熟期，開花結(jié)果，使得果農(nóng)及早受益，具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥Col-0生態(tài)型的種子由作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室須健教授課題組惠贈，WT-Col背景下的lhy（CS811112）、cca1（SALK_067780）突變體的種子購自美國俄亥俄州立大學(xué)的Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 種植

種子在4℃條件下處理2～3 d，打破休眠并春化，然后點(diǎn)種至塑料盆中，并貼好標(biāo)簽，蓋上保鮮膜，7d后揭膜。培養(yǎng)條件為V營養(yǎng)土∶V蛭石＝1∶1，并高溫滅菌，用蒸餾水充分浸泡，每3 d澆水一次。培養(yǎng)條件為：22℃，光照培養(yǎng)16 h，暗培養(yǎng)8 h，相對濕度 60%，光照強(qiáng)度 180 μmol/（m2·s）。

1.2.2 形態(tài)觀察

待種子長出子葉后，開始觀察野生型Col-0及突變體lhy、cca1的表型。抽薹前，每天統(tǒng)計(jì)其蓮座葉總數(shù)，最早出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛時(shí)的葉序數(shù)及蓮座葉數(shù)，并觀察其葉片形態(tài)變化；抽薹后，將所有蓮座葉片摘下，拍照并使用DWRuler測量其葉片近軸面右側(cè)與葉柄之間形成的葉片基角。

1.2.3 制作石蠟切片

待擬南芥長出真葉時(shí)，開始取材，按照李和平等[8]的方法進(jìn)行操作，材料置于FAA固定液中固定至少24 h；梯度乙醇脫水，石蠟包埋，愛氏蘇木精染色，LEICA2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，厚度為8μm，LEICA DM4000B顯微鏡觀察，LEICA DFC450相機(jī)拍照保存。

1.2.4 熒光定量PCR

利用熒光定量PCR做基因miR156表達(dá)分析，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin-2。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）和北京全式金熒光定量試劑盒（TransStartTM Top Green qPCR SuperMix）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。miR156擴(kuò)增采用頸環(huán)法，引物序列：Actin2-F：5′-GCTGAGAGATTCAGA TGCCCA-3′，Actin2-R：5′-GTGGATTCCAGCAGCTTCCAT ACT-3′；miR156-F:5′-CATCTTGTA GATCTC TGAAGTTGG ACT-3′，miR156-R:5′-GAGATT GAGACATAGA GAACGAAGACA-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的葉形與最早遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)的葉序數(shù)

通過對野生型Col-0和lhy、cca1突變體的葉形變化的觀察比較了解其VPC特征。結(jié)果顯示，野生型Col-0蓮座葉葉片總數(shù)近為10片，前4片葉近圓形，后期葉片則呈漸長的匙形，遠(yuǎn)軸面表皮毛為第6片（第15天時(shí)）（圖1-A）；突變體lhy的蓮座葉總數(shù)近為12片，前4片蓮座葉接近圓形，后期的葉片呈漸長的匙形，遠(yuǎn)軸面表皮毛最早出現(xiàn)在第7片蓮座葉上（第16天時(shí)）（圖1-B）；突變體cca1的蓮座葉葉片總數(shù)近為13片，前4片蓮座葉接近圓形，后期的葉片呈漸長的匙形，出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛也為第7片（第16天時(shí)）（圖1-C），表明野生型Col-0和突變體lhy、cca1分別在第6、第7、7片葉時(shí)發(fā)生VPC，且突變體出現(xiàn)的遠(yuǎn)軸面表皮毛的時(shí)間都晚于野生型，說明lhy、cca1突變體的VPC被延遲。

圖1 野生型Col-0與lhy、cca1突變體的生長發(fā)育情況及葉形圖

2.2 突變體的葉片基角

在植物營養(yǎng)生長時(shí)期，葉片基角隨著VPC的發(fā)生而產(chǎn)生變化。通過測量野生型Col-0和lhy、cca1突變體蓮座葉的葉片基角，分別選取蓮座葉的第3、6、9片的葉片基角來比較野生型和突變體的差異。結(jié)果表明，野生型Col-0和lhy、cca1突變體蓮座葉的葉片基角都呈增大趨勢，但是lhy、cca1突變體的葉片基角總體變化不大。在第6片蓮座葉時(shí)，野生型Col-0的葉片基角為127.12°，而lhy、cca1突變體葉片基角分別為121.4°、123.52°，突變體的葉片基角都比野生型的要小，說明突變體VPC的發(fā)生時(shí)間要比野生型晚，延遲了VPC（表1）。

表1 野生型與突變體葉片基角的比較

2.3 莖頂端分生組織的結(jié)構(gòu)特征

伴隨著VPC的發(fā)生，莖頂端分生組織（shoot apical meristem,SAM）也會呈現(xiàn)不同的變化。結(jié)果顯示，Col-0在生長第5 d時(shí)，SAM生長錐縱切面呈平坦?fàn)?，?xì)胞尚未分化（圖2A），在生長第10 d時(shí)，生長錐縱切面稍有凸起，SAM的原套細(xì)胞為單層（圖2B），在生長第15天時(shí)，生長錐明顯凸起，原體和髓分生組織細(xì)胞分裂，數(shù)目增多（圖2C），在第19天，生長錐繼續(xù)生長、發(fā)育，凸起增高（圖2D），在第23天時(shí)，花原基出現(xiàn)（圖2E）；lhy、cca1突變體在生長第5天時(shí)，SAM縱切面也為平坦?fàn)睿?xì)胞無分化（圖2F和圖2K），在生長第10天和第15天時(shí)，生長錐縱切面也開始凸起，但莖尖分生組織原套細(xì)胞為單層或雙層，細(xì)胞分裂數(shù)目增多但比野生型的少（圖2G、圖2H和圖2L、圖2M），在生長第19天時(shí)，生長錐縱切面凸起較為明顯，原套、原體和髓分生組織均分化、發(fā)育（圖2I和圖2N），在生長第25天時(shí)，植株分化出12、13片葉，花芽發(fā)育（圖2J和圖2O）。根據(jù)野生型和突變體莖頂端生長錐明顯凸起且分化的時(shí)間，判定突變體VPC延遲，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

圖2 野生型Col-0和lhy、cca1突變體莖頂端分生組織結(jié)構(gòu)

2.4 熒光定量PCR

miR156的檢測結(jié)果顯示，隨著植株生長發(fā)育的進(jìn)程，野生型和突變體植株中的miR156表達(dá)均呈下降趨勢（圖3）。在第11天時(shí)，miR156在突變體lhy、cca1中的表達(dá)量均比野生型的低；Col-0植株在生長第15天時(shí)，miR156的表達(dá)量下降最快，比第11天時(shí)測定的量下降1倍多，在此時(shí)發(fā)生VPC；而在第15天時(shí)，突變體植株降低的少，說明突變體VPC發(fā)生時(shí)間在第15天和第19天之間。這些結(jié)果表明突變體相對于野生型Col-0延遲了VPC，與本研究中的其他試驗(yàn)（包括表型及莖尖解剖觀察）結(jié)果相符。

圖3 Col-0與lhy、cca1不同發(fā)育過程中Q-PCR檢測miR156表達(dá)

3 討論

植物在生長發(fā)育過程中，不同的時(shí)期表現(xiàn)出不同的表型特征。植物生長發(fā)育過程中離不開VPC的關(guān)鍵作用，但是生物鐘相關(guān)基因是如何影響VPC的，目前還尚未知曉。

在表型觀察、解剖結(jié)構(gòu)和分子水平上的試驗(yàn)結(jié)果表明，突變體lhy、cca1推遲了VPC發(fā)生的時(shí)間。野生型Col-0和突變體lhy、cca1分別在第6和第7、7片葉時(shí)發(fā)生VPC，突變體的VPC被延遲。此外，盧陽等[9]研究表明，突變體mgo3（CS8324）的蓮座葉數(shù)目減少推遲了VPC的發(fā)生；而突變體amp1-1（SALK_034207）的蓮座葉數(shù)目增多并未提前發(fā)生VPC，切除第1、2片真葉推遲了Col-0的VPC發(fā)生。本研究中，lhy和cca1突變體的蓮座葉葉片總數(shù)都表現(xiàn)為增多，但其VPC延遲；推測突變體幼齡期產(chǎn)生的真葉受LHY、CCA1基因突變影響較大，數(shù)量較少，造成VPC發(fā)生延遲。在植株正常生長發(fā)育過程中伴隨著葉片基角的變化，通過測量生長發(fā)育良好的野生型Col-0和lhy、cca1突變體蓮座葉的葉片基角，結(jié)果也表明，突變體的葉片基角都比野生型的小，說明突變體由于發(fā)生基因突變導(dǎo)致了VPC的發(fā)生時(shí)間要比野生型晚，延遲了VPC。通過對野生型Col-0和生物鐘相關(guān)突變體lhy、cca1的莖頂端分生組織的發(fā)育過程觀察，能夠清楚地了解其VPC的變化特征。結(jié)果表明，野生型Col-0在第15天左右發(fā)生VPC，而突變體lhy、cca1在第16天左右，比野生型發(fā)生的時(shí)間延后，說明突變體的VPC被推遲。通過觀察SAM的發(fā)育變化，可以看到突變體SAM的原套、原體和髓分生組織發(fā)育延遲，且這種變化伴隨著miR156表達(dá)量的改變。miR156檢測結(jié)果也顯示，野生型Col-0在第15天發(fā)生VPC，而突變體很可能在第16天發(fā)生，VPC延后，這也可以說明突變體的VPC被延遲。

研究表明，生物鐘是復(fù)雜的計(jì)時(shí)系統(tǒng)，生成內(nèi)源性周期近為24 h的節(jié)律，控制著動物睡眠或蘇醒和植物的葉片運(yùn)動、開花時(shí)間等活動。單一突變lhy與cca1，生物鐘依然運(yùn)轉(zhuǎn)，說明LHY、CCA1是在生物振蕩組件中發(fā)揮重要作用的必需組件。在LHY和CCA1中的緊密聯(lián)系表明了它們具有功能冗余作用，在缺少CCA1時(shí)，LHY也能保持植物自身的節(jié)律[10]，但同時(shí)缺少LHY和CCA1時(shí)，植物自身生物鐘則不能維持[11]。生物鐘調(diào)控了包括開花在內(nèi)的許多生物學(xué)過程[12]，lhy和cca1突變體VPC延遲的表型可能與其生物鐘屬性相關(guān)聯(lián)。隨著生長發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，基因表達(dá)在24 h之間循環(huán)?？梢酝茰y，生物鐘基因可能參與植物發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)變的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，維持植物正常生長發(fā)育。

[1]Huijser P，Schmid M.The control of developmental phase transitions in plants[J].Development，2011，138（19）：4117－4129.

[2]Poethig R S.The past，present and future of vegetative phase change[J].Plant Physio，2010，154（2）：541－544.

[3]Wu G，Poethig R S.Temporal regulation of shoot development inArabidopsis thalianabymiR156and its targetSPL3[J].Development，2006，133：3539－3547.

[4]Chuck G，Cigan A M，Saeteurn K，et al.The heterochronic maize mutantCorngrass1results from overexpression of a tandem microRNA[J].Nat Genet.，2007，39：544－549.

[5]Wu G，Park M Y，Conway S R，et al.The sequential action ofmiR156andmiR172regulates developmental timing in Arabidopsis[J].Cell，2009，138：750－759.

[6]瞿禮嘉，鄧興旺.植物發(fā)育的機(jī)制[M].北京：高等教育出版社，2006.

[7]Mishra P，Panigrahi K C.GIGANTEA-an emerging story[J].Front Plant Sci，2015，6：8.

[8]李和平，龍鴻.植物顯微技術(shù)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，2009.

[9]盧陽，龍鴻.擬南芥葉片數(shù)目變化突變體對營養(yǎng)生長時(shí)相轉(zhuǎn)變的影響[J].植物學(xué)報(bào)，2015，50（3）：331－337.

[10]Matsushika A，Makino S，Kojima M，et al.The APRR1/TOC1quintet implicated in circadian rhythms of Arabidopsis thaliana：II.Characterization withCCA1-overexpressing plants[J].Plant Cell Physiol，2002，43：118－122.

[11]Rachel M G，Elaine M T.The role ofCCA1andLHYin the plant circadian clock[J].Developmental Cell，2002，2（5）：516－518.

[12]Hara M，Kamada H，Mizoguchi T.CO-EXPRESSED WITH CLOCK GENES LHY AND CCA1 1（CEC1）is regulated byLHYandCCA1and plays a key role in phase setting ofGIinArabidopsis thaliana[J].Plant Biotechnology，2014，31：35－41.