劉 單，蘭光友，鄧述愷

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，四川 瀘州 646000；2.自貢市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 自貢 643000)

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，隨著抗腫瘤藥物不斷更新，找到療效較好、安全性高、不良反應(yīng)輕的抗腫瘤藥物，將為肺癌患者提供新的希望。二甲雙胍過去主要用于2型糖尿病的降糖治療。近年來，相關(guān)基礎(chǔ)研究[1]表明：二甲雙胍可能通過LKB1-AMPK-mTOR通路、降低宿主胰島素水平、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制腫瘤新生血管的生成和炎癥反應(yīng)、抑制氧自由基的生成、抑制腫瘤干細(xì)胞等抑制腫瘤細(xì)胞生長，也可通過增強(qiáng)放化療的敏感性、誘導(dǎo)自噬、激活免疫系統(tǒng)、抑制UPR等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)將初步探討二甲雙胍抗肺癌的可能機(jī)制，為今后的實(shí)驗(yàn)及臨床提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 人肺腺癌A549細(xì)胞(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；二甲雙胍原藥粉劑(美國Sigma公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT試劑盒、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；HyClone胎牛血清(上海拜力生物工程有限公司)；CO2恒溫孵育箱(美國Napco公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞加于體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫孵育箱中生長，貼壁85%時(shí)按13傳代，選取2～4代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度、不同時(shí)間下二甲雙胍作用A549細(xì)胞的增殖抑制率 將A549細(xì)胞接種96孔板，按每孔4×104·mL-1計(jì)數(shù)，待細(xì)胞生長貼壁后，按100 μL二甲雙胍且濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1分別作用A549細(xì)胞(5個實(shí)驗(yàn)組)，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對照組(加無血清培養(yǎng)基100 μL)，分別作用24、48、72 h后每組各孔加入10 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h，棄上清，每組各孔加入100 μL Formanzan溶解液，再培養(yǎng)4 h，在檢測儀490 nm處測定各孔吸光度(OD)值，記錄結(jié)果，根據(jù)公式計(jì)算出細(xì)胞生長抑制率。計(jì)算公式：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值 /對照組OD值)] ×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 ELISA檢測COX-2及VEGF蛋白的表達(dá) 采用100 μL二甲雙胍且濃度依次為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1(實(shí)驗(yàn)組)，干預(yù)已貼壁生長的A549細(xì)胞，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品組(標(biāo)準(zhǔn)品)、空白孔(蒸餾水)；干預(yù)72 h(最佳抑制時(shí)間)后，收集細(xì)胞，濃度約為106·mL-1。分別按照說明加樣，各孔加入50 μL酶標(biāo)試劑，再孵育、洗滌、顯色，最后終止。采用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定每個孔的OD值。測量OD值：波長調(diào)至450 nm，以空白孔凋零，測每孔的吸光度OD值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對A549細(xì)胞生長抑制的影響 不同濃度二甲雙胍(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1)作用A549細(xì)胞24、48及72 h后，OD值隨濃度的增加而降低，而細(xì)胞生長抑制率隨濃度增加而增加，但24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；48 h及72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，72 h抑制率更強(qiáng)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞上清液中COX-2、VEGF水平的比較 二甲雙胍干預(yù)A549細(xì)胞72 h后，各實(shí)驗(yàn)組(濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol·L-1)均可見A549細(xì)胞上清液中COX-2、VEGF的水平下降，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組OD值及抑制率的比較

注：48、72 h時(shí)各組兩兩比較，P均<0.05；5個實(shí)驗(yàn)組中同一組不同時(shí)間點(diǎn)比較，P均<0.05

表2 各組細(xì)胞上清液中COX-2、VEGF水平的比較 ng·mL-1

注：各組兩兩比較，P均<0.05

3 討論

二甲雙胍主要用于2型糖尿病的治療，其機(jī)制一方面通過抑制肝臟糖異生、提高外周組織對胰島素的敏感性及增加對葡萄糖的攝取和利用而降低血糖；另一方面因其不增加體重、改善血脂譜、降低小細(xì)胞聚集、增加纖溶活性等功效用于延緩和改善糖尿病血管并發(fā)癥。近年來，作為“老藥新用”的典范，越來越多研究顯示，二甲雙胍能抑制2型糖尿病患者患食管癌[2]、胃癌[3]、肝癌[4]、胰腺癌[5]、乳腺癌[6]等多種惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)基礎(chǔ)研究[7-8]表明二甲雙胍能通過激活A(yù)MPK途徑、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、降低胰島素及胰島素樣生長因子-1、增加放化療及靶向治療效果等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT檢測不同濃度二甲雙胍分別作用A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h后的增殖抑制率，發(fā)現(xiàn)：除24 h外，二甲雙胍對A549細(xì)胞具有增殖抑制作用，且抑制作用與作用濃度及時(shí)間有關(guān)聯(lián)，這一結(jié)論也與Guo等[9]的研究結(jié)果相吻合。本實(shí)驗(yàn)中24 h各組增值抑制率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能原因與二甲雙胍干預(yù)時(shí)間過短或選擇濃度過低有關(guān)。

COX-2又稱誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，在大多細(xì)胞中不表達(dá)或少量表達(dá)，傳統(tǒng)研究主要集中在炎癥反應(yīng)方面，當(dāng)人體受到外傷或感染等刺激后產(chǎn)生，從而促進(jìn)白三烯、羥基環(huán)氧素等炎性介質(zhì)及大量炎癥細(xì)胞、炎癥因子共同參與炎性反應(yīng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性炎癥與許多包括肺癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這是腫瘤的又一大特征[10]。COX-2在腫瘤發(fā)生、增長及轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用，研究顯示COX-2能夠降低凋亡相關(guān)基因BCL-2的表達(dá)，以促進(jìn)其磷酸化，抑制肺癌細(xì)胞凋亡，且可促進(jìn)survivin蛋白泛素化，促進(jìn)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡耐受[11]。此外，COX-2還能促進(jìn)腫瘤新生血管的形成[12]。相關(guān)研究表明，COX-2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞血管的生存能力、轉(zhuǎn)移能力以及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[13]。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，是目前已知的最強(qiáng)的促血管形成因子之一，腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移離不開新生毛細(xì)血管的形成，VEGF能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞分裂和毛細(xì)血管出芽生長，為腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移提供相對有利的微環(huán)境[14]。徐建平等[15]發(fā)現(xiàn)，VEGF參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，病理分期越晚，分化越低，其陽性率越高，其可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的標(biāo)志物。那么VEGF和COX-2在某些信號通路方面可能存在聯(lián)系，發(fā)揮相互協(xié)同作用，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，選取二甲雙胍對A549細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)72 h為時(shí)間點(diǎn)，并通過ELISA法檢測A549細(xì)胞上清液中COX-2及VEGF的表達(dá)水平，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組COX-2及VEGF的蛋白表達(dá)水平隨細(xì)胞增殖抑制率的下降而降低?？傊?，二甲雙胍可能通過下調(diào)COX-2及VEGF的表達(dá)發(fā)揮抑制A549細(xì)胞生長的作用。

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