王曉寧，焦紅亮，杜 偉，李建斌，楊 波

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院放療科，河南 鄭州 450007；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052；3.河南省紅十字血液中心，河南 鄭州 450003)

臍血間充質干細胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)對膠質瘤細胞具有毒性和抑制增殖的作用。該實驗經(jīng)過將不同人源的UCB-MSCs混合，比較單份(1例孕婦來源的UCB-MSCs)與混合的UCB-MSCs(2例孕婦來源的UCB-MSCs)對C6膠質瘤細胞的抑制增殖和誘導凋亡的作用。采用免疫組化法檢測C6膠質瘤細胞的Caspase-8、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 間接共培養(yǎng)(Transwell小室)檢測UCB-MSCs對EGFP-C6膠質瘤細胞的作用 為了檢測C6膠質瘤細胞與UCB-MSCs之間的間接接觸相互作用，通過C6膠質瘤細胞的熒光強弱來觀察干細胞對膠質瘤細胞毒性作用，T(target，靶細胞即C6膠質瘤細胞)，E(effector，效應細胞即UCB-MSCs)。在Transwell板內，2×104個C6膠質瘤細胞接種于下室，UCB-MSCs接種于上室，中間由孔徑為0.4 μm薄膜將上下室分開，從而檢測UCB-MSCs分泌抑制性蛋白對C6膠質瘤的作用。單份UCB-MSCs和C6膠質瘤細胞數(shù)量比例(E/T)分別為01、11、51、101；混合UCB-MSCs和C6膠質瘤細胞數(shù)量比例(E/T)分別為(0.5 +0.5)1、(2.5+2.5)1、(5+5)1。Transwell板置于體積分數(shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 d后通過共聚焦顯微鏡和計算機圖像分析系統(tǒng)檢測C6膠質瘤細胞表達綠色熒光蛋白強度，所有實驗均重復3次。

1.2 間接共培養(yǎng)細胞免疫組化檢測Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達 固定細胞：吸棄培養(yǎng)基，3次PBS沖洗，每次4 min，質量分數(shù)4%多聚甲醛固定25 min。內源性過氧化物酶消除：3次PBS沖洗，每次4 min，體積分數(shù)3% H2O2去離子水孵育10 min。封閉血清：滴加山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去，不洗。孵育一抗：滴加一抗(適當比例稀釋)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min。孵育二抗：滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，室溫孵育15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。顯色：DAB顯色劑。沖洗：自來水充分沖洗。復染：蘇木素約5 min使細胞核顯色。光鏡下觀察：中性樹膠封片觀察。

2 結果

2.1 UCB-MSCs與C6膠質瘤細胞間接共培養(yǎng)的熒光強度 在Transwell培養(yǎng)板內，按照不同比例UCB-MSCs處理C6膠質瘤細胞后，在熒光顯微鏡下檢測熒光強度，結果顯示，E/T=51組的C6膠質瘤細胞熒光強度與E/T=01組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1作用于的C6膠質瘤細胞后，強度均明顯減弱(P<0.05)。C6膠質瘤細胞的熒光強度隨著E/T比例增高而減低，呈現(xiàn)反比例依賴關系；同比例時，混合組比單份組的細胞強度低，其中E/T=(5+5)1時其強度最低。見圖1。

2.2 免疫細胞化學法檢測 Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3 蛋白 Caspase-8、Bax和Caspase-3蛋白在E/T=01即有表達，染色強度淺，E/T=51時，蛋白表達水平較E/T=01有升高趨勢，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著E/T比例增加，表達水平逐漸升高，染色強度逐漸增強，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1時，Caspase-8蛋白表達陽性率與E/T=01比較顯著升高(P<0.05)，其中E/T=(5+5)1時，其表達陽性率最高。Bcl-2在E/T=01染色強度高，E/T=51時，蛋白表達水平較E/T=01有減低趨勢，但比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨著E/T比例增加，表達水平逐漸減低，染色強度逐漸減弱，E/T=(2.5+2.5)1、101、(5+5)1時，Bcl-2蛋白表達陽性率與E/T=01比較顯著降低(P<0.05)。

圖1 UCB-MSCs與C6膠質瘤細胞間接共培養(yǎng)的熒光強度

1)與E/T=51和E/T=(2.5+2.5)1，比較，P<0.05；2)與E/T=101，P<0.05

3 討論

MSC具有向膠質瘤趨化的特性[1-4]及抑制腫瘤的生長已經(jīng)有相關報道，而且臍血在獲取材料、存儲、移植等方便優(yōu)于骨髓[5]。UCB-MSCs克服了神經(jīng)干細胞存在的倫理等問題，具有向膠質瘤細胞趨化的特性[6]。Bcl-2是細胞凋亡研究中重要的癌基因之一，Bcl-2家族目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20多個成員，例如凋亡蛋白Bax、Bik等，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bfl-1、Bcl-W等。Bcl-2基因主要分布在內質網(wǎng)、核膜上及線粒體外膜的漿膜面，其功能是阻止線粒體釋放細胞色素C、Caspase及活化因子AIF，穩(wěn)定線粒體膜。Bcl-2/Bax比值決定細胞是否凋亡[7]，Bax和Bcl-2具有拮抗作用，可以異源二聚體形式存在，也可形成同源二聚體[8]，Bax和Bcl-2可能是抗腫瘤治療潛在靶點，Bax由6個外顯子組成，產(chǎn)生4種mRNA，分別編碼相對分子質量45 000、21 000和24 000的蛋白質。細胞中的Bax蛋白與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復合物，使Bcl-2失活，也可自身形成同源二聚體。Bax表達增多時，Bax/Bax二聚體增加，使凋亡作用增強。Caspase激活可分為[9-10]：切開小亞基和大亞基；切開大亞基和前導區(qū)；大亞基和小亞基構成活性Caspase。另一種為效應的Caspase，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等，有的不含死亡效應結構域，其與起始型Caspase結合后進一步被激活，凋亡的終結者是效應Caspase。

為了研究其具體機制，本研究應用免疫組化法檢測C6膠質瘤細胞Caspase-8、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白，Caspase-8、Bax和Caspase-3在E/T=51時，蛋白表達較E/T=01有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。隨著E/T比例增加，蛋白表達水平逐漸升高，Caspase-8、Bax和Caspase-3蛋白陽性表達與E/T比例正相關，同比例時，混合組比單份組的陽性表達數(shù)量多，其中E/T=(5+5)1時，數(shù)量最多，但是Bcl-2蛋白陽性表達數(shù)量與上述相反。

綜上所述，混合的UCB-MSCs分泌各種細胞因子，如IL-2 和INF-γ等，作用于C6膠質瘤細胞，抑制細胞的增殖，通過上調Bax表達和下調Bcl-2表達，開放PTP孔，使細胞外膜破壞，線粒體膜電位消失，線粒體膜外的小分子進入到膜內，使得線粒體內外膜之間的細胞色素C等促凋亡因子的釋放，凋亡蛋白活化因子與細胞色素C互相結合后，激活Caspase-8，使Caspase-3活化，進而促進膠質瘤細胞發(fā)生凋亡。

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