李 丹，李異玲

非諾貝特在非酒精性脂肪性肝病大鼠中的作用探討

李 丹，李異玲*

目的 高脂飲食構(gòu)建NAFLD大鼠模型，觀察非諾貝特對NFALD大鼠血清學肝功、血脂及肝臟病理的影響。方法 將27只雄性SD大鼠隨機分為正常組(N組)、病理組(B組)及非諾貝特組(F組)，每組9只，分別予正常飲食及高脂飲食建立NAFLD模型。于4、8、12周后，每組各處死大鼠3只，稱體重、肝濕重，計算肝指數(shù)；8周后測定血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)；肝臟病理切片行HE染色，觀察病理改變。F組第5周開始藥物干預(yù)。結(jié)果 8周時B組大鼠體重及肝指數(shù)高于N組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)組肝指數(shù)低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12周時N組與F組大鼠肝指數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，B組大鼠體重和肝指數(shù)大于N組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。血清學指標:8周時N組與F組AST、ALT、TG、TC比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，B組AST、ALT、TG、TC明顯高于N組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。12周時B組AST、ALT、TG、TC明顯高于N組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，B組ALT、TG高于F組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F(xiàn)組與N組AST、ALT、TC、TG差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 改良法高脂飲食誘導SD大鼠非酒精性脂肪性肝病，造模成功；非諾貝特對NAFLD大鼠的肝臟酶學、血脂及病理學均有一定改善。

非酒精性脂肪性肝??；SD大鼠；非諾貝特

0 引言

近年來，非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率逐年上升，包括單純性脂肪肝(NASFL)、脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化以及相關(guān)的肝細胞癌[1-2]。高血脂是NAFLD的危險因素，長期持續(xù)高脂飲食后，肝細胞合成三酰甘油(Triglyceride，TG)增多，肝細胞內(nèi)脂肪沉積，出現(xiàn)脂肪變性，逐漸形成脂肪肝[3]。

目前治療NAFLD的常用藥物主要有抗炎保肝藥、胰島素增敏劑如二甲雙胍、抗氧化劑、降脂藥等。其中降血脂藥逐漸吸引廣大研究者的注意，能否用降脂藥來治療NAFLD逐漸被重視[4-5]。非諾貝特屬于第二代貝特酸類衍生物，通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)、抑制肝臟炎癥反應(yīng)，起到治療NAFLD的作用[5-6]。雖然大量研究提示非諾貝特作為降血脂的重要藥物，治療NAFLD有效，但也有文獻報道對于治療伴有不同程度肝功能異常的NAFLD患者，非諾貝特具有肝損害的潛在危險性[7-8]。本文探討非諾貝特對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝功、血脂及肝臟病理的影響，進一步為非諾貝特對非酒精性脂肪性肝病的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠(SPF級)27只，體重(260±20)g，周齡：8周，由中國醫(yī)科大學動物部提供。飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃，濕度為50%±5%，將大鼠于實驗開始前1周置于實驗環(huán)境中，自由進食進水，自然晝夜節(jié)律周期。分為正常組(N)、病理組(B)及非諾貝特組(F)，每組9只，所有大鼠均在中國醫(yī)科大學動物部飼養(yǎng)。

1.2 NAFLD動物造模的制備 高脂飼料：10%豬油，2%膽固醇，5%蛋黃粉，0.5%膽酸鈉及82.5%基礎(chǔ)飼料，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供。N組予自由進食基礎(chǔ)飼料及飲用水；B組大鼠高脂飼料持續(xù)飼養(yǎng)及自由進食飲用水；F組高脂飲食喂養(yǎng)，于第5周開始灌胃給予非諾貝特，進行藥物干預(yù)。分別于造模第4周、8周、12周處死大鼠，測量肝重、體重，8周時腹主動脈穿刺取血，留取肝臟組織，行病理檢查。

1.3 檢測指標及標本留取 ①實驗前及實驗后4周、8周、12周各稱體重1次，觀察大鼠食欲、活動、精神、毛發(fā)情況；測定大鼠肝濕重，肝重/體重。②血清學檢測：腹主動脈取血后，將裝有5～10 mL的全血試管置入離心機中，3 000 r/min、4 ℃離心20 min后，留取上清液，置入EP管中，送至中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，通過生化自動分析儀(Olympus)測定血清學ALT、AST、TG、TC。③肝臟病理：大鼠處死后，將整個肝臟組織游離后，清洗，稱重，取固定部位肝(肝右葉，1 cm×1 cm×1 cm),用10%中性福爾馬林溶液固定48 h，HE染色，石蠟包埋，單盲情況下送病理室，由病理醫(yī)生協(xié)助閱片。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般特征、體重及肝指數(shù)比較 實驗期間N組大鼠活動、飲食正常，皮毛發(fā)亮發(fā)白，整潔，體重持續(xù)增長；B組及F組喂養(yǎng)4周后，逐漸出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，活動減少，食量下降，皮毛凌亂、發(fā)黃，F(xiàn)組經(jīng)非諾貝特藥物干預(yù)后，8周及12周大鼠活動、精神狀態(tài)、食量及皮毛顏色較N組差，較B組好。三組體重及肝指數(shù)見表1。

2.2 血清學指標 見表2。

表1 三組體重及肝指數(shù)比較

注：與N組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。三組間比較，4、8、12周時P體重=0.997、0.026、0.052，P肝指數(shù)=0.578、0.034、0.019

2.3 大體及病理 4～12周時，N組大鼠肝臟外觀均正常，顏色鮮紅，邊緣銳利，光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍成放射狀，細胞呈多邊形；B組大鼠肝臟逐漸增大，光鏡下脂肪變逐漸加重，至12周明顯腫大，黃白色，油膩，邊緣鈍，光鏡下肝索放射狀排列不明顯，大部分細胞腫脹，大小不均，細胞輪廓模糊，胞核消失或被脂肪空泡擠向一側(cè)，肝細胞以氣球樣變?yōu)橹?；F組大鼠肝臟外觀及病理學改變介于二者之間，肝臟增大，色黃，鏡下可見肝索排列，但不清晰，肝細胞體積增大，胞漿內(nèi)充滿脂肪空泡，可見核被擠向一側(cè)，病變以肝小葉交界處明顯。各組病理改變見圖1。

表2 三組血清學指標比較

注：與N組比較，*P<0.05,**P<0.01；與B組比較，#P<0.05,##P<0.01。三組間比較，8、12周時PALT=0.002、0.011，PAST=0.004、0.017，PTG=0.030、0.021，PTC=0.008、0.076

圖1 三組大鼠肝臟HE染色病理圖(×200)

3 討論

NAFLD包含NASFL、NASH、脂肪性肝纖維化及脂肪性肝硬化以及相關(guān)的肝細胞癌。是由環(huán)境-遺傳-代謝應(yīng)激等多種因素共同作用，導致肝臟細胞內(nèi)脂肪過度沉積而發(fā)展起來的[9]。高脂飲食誘導脂肪肝是目前較為常用的模型。外源性攝入的TG形成乳糜微粒，在脂蛋白脂肪酶(Lippoprotein，LPL)調(diào)節(jié)下，生成游離脂肪酸(Free fatty acids，F(xiàn)FA)，過多的攝入高脂食物，脂肪被酯化成TG或FFA，導致FFA水平升高。過多的FFA通過肝細胞吸收，使過量的TG在肝細胞內(nèi)沉積，導致肝臟脂肪變性，形成非酒精性脂肪性肝病[10-15]。本實驗主要通過高脂飲食誘導大鼠非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生,造模4周，肝臟發(fā)生脂肪變性，到12周時，脂肪肝改變已明顯，提示造模成功。本研究顯示，開始喂養(yǎng)到12周結(jié)束，B組大鼠ALT、AST、TC及TG逐漸升高；同一時間點，B組大鼠血清學改變較N組大鼠明顯升高，提示高脂飲食對大鼠肝功及血脂有影響。NAFLD的發(fā)病機制復(fù)雜，且目前的機制學說多數(shù)通過動物實驗，雖然國內(nèi)主要通過高脂飲食大鼠造模，但這些模型可比性較低，結(jié)果不盡一致，與人類NAFLD發(fā)病機制的相符程度仍不十分確定。期待今后能在動物模型穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，進一步研究NAFLD的發(fā)病機制。

目前NAFLD的治療藥物主要包括抗炎保肝藥、胰島素增敏劑、抗氧化劑、減肥藥、調(diào)脂藥等[16-18]。高脂血癥是NAFLD發(fā)生的重要血清學基礎(chǔ)，因此，改善血脂異常成為NAFLD治療的重要課題。目前多數(shù)研究提示，他汀類及貝特類降脂藥在NAFLD中均有治療作用，也有研究者將該兩種藥物進行對比得出，貝特類藥物在治療伴有高脂血癥的NAFLD患者中療效較好。非諾貝特作為貝特類的代表藥，通過激活PPAR-α起到改善胰島素抵抗、抗炎及調(diào)節(jié)脂質(zhì)作用[9，19-21]。脂肪三酰甘油酶(Adipose triglyceride lipase，ATGL)是一種可特異性脂解TG為二酰甘油的脂肪酶。有報道，非諾貝特可能增加ATGL酶活性，并增強TG水解活性，從而起到治療非酒精性脂肪性肝病的作用[19，22]。有研究表明，非諾貝特可抑制CCl4誘導的小鼠肝纖維化程度,其機制可能與上調(diào)肝臟中PPARα表達,抑制炎癥反應(yīng),升高SOD發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)[23]。目前，關(guān)于非諾貝特是否可以影響胰島素敏感性存在爭議。Black等[24]研究發(fā)現(xiàn)，非諾貝特對胰島素敏感性沒有影響，其結(jié)果仍需大量的臨床及模型試驗進一步證實。本研究結(jié)果提示，F(xiàn)組大鼠在大體及肝臟外觀方面較B組改善，而體重、肝指數(shù)、血清學TC及TG較B組好轉(zhuǎn)。但有研究指出，貝特類藥物治療與AST或ALT升高有關(guān)。通過血清學改變推斷，大鼠的轉(zhuǎn)氨酶升高主要與疾病本身相關(guān)。貝特類藥物使氨酶升高可能與藥物應(yīng)用的劑量有關(guān)，目前尚無大量實驗研究得出非諾貝特治療NAFLD的最佳劑量，期待今后在此方面開展更多的研究，為臨床上治療NAFLD提供幫助。

[1]Nanji AA.Animal models of nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis[J].Clin Liver Dis,2004,8(3):559-574.

[2]Dowman JK,Tomlinson JW,Newsome PN.Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease[J].QJM,2010,103(2):71-83.

[3]Jou J,Choi SS,Diehl AM.Mechanisms of disease progression in nonalcoholic fatty liver disease[J].Semin Liver Dis,2008,28:370-379.

[4]Orime K,Shirakawa J,Togashi Y,et al.Lipid-lowering agents inhibit hepatic steatosis in a non-alcoholic steatohepatitis-derived hepatocellular carcinoma mouse model[J].Eur J Pharmacol,2016,772:22-32.

[5]Kostapanos MS,Kei A,Elisaf MS.Current role of fenofibrate in the prevention and management of non-alcoholic fatty liver disease[J].World J Hepatol,2013,5(9):470-478.

[6]Zhang N,Lu Y,Shen X,et al.Fenofibrate treatment attenuated chronic endoplasmic reticulum stress in the liver of nonalcoholic fatty liver disease mice[J].Pharmacology,2015,95(3-4):173-180.

[7]Gandhi N,Lenton R,Bhartia M,et al.Effect of fibrate treatment on liver function tests in patients with the metabolic syndrome[J].Springerplus,2014,3:14.

[8]Kobayashi A,Suzuki Y,Kuno H,et al.Effects of fenofibrate on plasma and hepatic transaminase activities and hepatic transaminase gene expression in rats[J].J Toxicol Sci,2009,34(4):377-387.

[9]朱月永，吳佳蓉，鄭琦，等.非諾貝特對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細胞凋亡的影響[J].中華肝臟病雜志,2015,23(9):688-693.

[10]Bloomgarden ZT.Second world congress on the insulin resistance syndrome:insulin resistance syndrome and nonalcoholic fatty liver disease[J].Diabetes Care,2005,28(6):1518-1523.

[11]Park SH,Kim BI,Kim SK,et al.Body fat distribution and insulin resistance:beyond obesity in nonalcoholic fatty liver disease among overweight men[J].Am Coil Nutr,2007,26(4):321-326.

[12]Mcculloush AJ.Pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis[J].J Clin Gastroenterol,2006,40(3Suppl1):S17-S29.

[13]季光，張莉.非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制進展[J].中國醫(yī)師進修雜志,2010,33(1)：1-3.

[14]梁淑文,王曉英,屈昌民,等.非酒精性脂肪性肝病患者胰島素抵抗與腸道菌群失調(diào)相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)藥,2016,11(1):83-86.

[15]Liu Q,Bengmark S,Qu S.The role of hepatic fat accumulation in pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)[J].Lipids Health Dis,2010,9:42.

[16]朱雨霏,黃濱,郭南京,等.艾塞那肽治療2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝臨床療效[J].實用醫(yī)學雜志,2016,32(6):991-993.

[17]劉瑩,項瑩.胰高血糖素樣肽1治療2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的研究進展[J].中國醫(yī)藥,2016,11(8):1260-1264.

[18]Nakajima K.Multidisciplinary pharmacotherapeutic options for nonalcoholic fatty liver disease[J].Int J Hepatol,2012,2012:950693.

[19]沈俊飛，代芳，王長江,等.非諾貝特和TNF對3T3-L1脂肪細胞內(nèi)脂素表達的影響[J].山東醫(yī)藥,2008,48(19)：28-30.

[20]Day CP,James OFW.Steatohepatitis:a tale of two “hits”[J].Gastroenterology,1998,144:842-845.

[21]Kondo K,Sugioka T,Tsukada K,et al.Fenofibrate,a peroxisome proliferator-activated receptor alpha agonist,improves hepatic microcirculatory patency and oxygen availability in a high-fat-diet-induced fatty liver in mice[J].Adv Exp Med Biol,2010,662:77-82.

[22]南京，楊水祥.非他汀類調(diào)脂藥物的研究進展[J].中華老年心腦血管病雜志,2016,18(6)：655-658.

[23]Xie C,Li L,Xu YP,et al.Anti-fibrosis of fenofibrate in mice with hepatic fibrosis[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2013,21(12):914-919.

[24]Black RN,Ennis CN,Young IS,et al.The peroxisome proliferator-activated receptor alpha agonist fenofibrate has no effect on insulin sensitivity compared to atorvastatin in type 2 diabetes mellitus:a randomised,double-blind controlled trial[J].J Diabetes Complications,2014,28(3):323-327.

Mechanism of fenofibrate in rat model of non-alcoholic fatty liver disease

LI Dan,LI Yi-ling*

(Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective To establish a rat model for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and evaluate the effectiveness of fenofibrate treatment on NAFLD,based on liver enzyme tests,blood lipid levels and liver pathology of the NAFLD rats after treatment with fenofibrate.Methods A total of 27 male SD rats were randomly divided into 3 groups,with 9 rats in each group,which were respectively assigned as normal group (group N),pathological group (group B) and fenofibrate group (group F).Group N was given a normal diet,while both group B and group F were fed with a high fat diet to create the NAFLD model.Three rats from each group were sacrificed after 4 weeks,8 weeks and 12 weeks,respectively.The body mass,liver weight and liver index were recorded.The serum levels of aspartate aminotransferase (AST),alanine aminotransferase (ALT),triglycerides (TG) and total cholesterol (TC) were determined after 8 weeks.HE staining was done on liver tissue samples to observe for pathological changes.Group F was treated with fenofibrate on the fifth week.Results After 8 weeks,a significantly higher body mass and liver index were observed in rats of group B compared to group N (P<0.05).The average liver index of rats in group F was lower than group B (P<0.05).At the 12th week,the liver indexes of rats from both group N and group F were similar with no significant difference (P>0.05),while group B had a significantly higher liver index and body mass index compared to group N (P<0.05).Serological indicators:measurements of AST,ALT,TG and TC taken at the 8th week were comparable between group F and group N (P>0.05).After 8 and 12 weeks,group B showed remarkably higher levels of AST,ALT,TG and TC compared to group N (P<0.05).At the 12th week,the levels of ALT and TG in group F were significantly lower than group B (P<0.05).At the same time,there was no statistical difference in levels of AST,ALT,TG and TC between group F and group N (P>0.05).Conclusion An improved rat model of NAFLD is successfully established by administration of high-fat diet to SD rats.Serological indicators,including levels of ALT,AST,TG and TC,as well as pathological findings,show that fenofibrate is an effective treatment for NAFLD.

Non-alcoholic fatty liver disease;SD rats;Fenofibrate

2016-05-29

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，沈陽 110001

遼寧省科技廳基金資助項目(2011225015)；沈陽市科技廳基金資助項目(F13-220-9-61)

10.14053/j.cnki.ppcr.201702006

*通信作者