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        “滋水涵木”針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管內皮生長因子、突觸素表達的影響

        2017-03-07 04:18:14夏文廣鄭嬋娟張璇王娟
        神經(jīng)損傷與功能重建 2017年1期
        關鍵詞:針刺手術模型

        夏文廣,鄭嬋娟,張璇,王娟

        “滋水涵木”針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管內皮生長因子、突觸素表達的影響

        夏文廣,鄭嬋娟,張璇,王娟

        目的:探討“滋水涵木”針刺對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)血管單元相關蛋白血管內皮生長因子(VEGF)、突觸素(SYN)表達的影響。方法:健康成年雄性SD大鼠144只隨機分為假手術組(n=30)、模型組(n=42)、針刺組(n=42)和針刺對照組(n=30)。采用線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型(MCAO),針刺組和針刺對照組取太溪穴、太沖穴,針刺30 min,1次/日,6次/周,連續(xù)2周;假手術組、模型組術后不給予干預。術后第3、7、14天采用mNSS量表對大鼠進行神經(jīng)行為學評分、TTC染色測腦梗死體積以及免疫組化SP法觀察腦梗死周圍皮質VEGF、SYN的表達。結果:針刺對照組和假手術組大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀,TTC染色未見明顯腦梗死灶,VEGF及SYN表達較弱;在術后第7、14天針刺組大鼠神經(jīng)功能恢復明顯優(yōu)于模型組,術后第3天,針刺組與模型組比較腦梗死面積差異無統(tǒng)計學意義,在第7和14天針刺組腦梗死面積小于模型組(P<0.05);術后第3天,模型組VEGF明顯高于假手術組和針刺對照組,在第7天達到高峰,第14天仍表達顯著,針刺組在第7和14天VEGF的表達明顯高于模型組(P<0.05);在各時間點模型組SYN表達均高于針刺對照組和假手組(P<0.05),第14天表達最顯著,針刺組則在第7和14天高于模型組(P<0.05)。結論:“滋水涵木”針刺能促進大鼠腦梗死后神經(jīng)血管單元的相關蛋白VEGF、SYN的表達,減少腦梗死體積,促進神經(jīng)功能的恢復。

        針刺;腦缺血再灌注;血管內皮生長因子;突觸素

        腦卒中具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率和高復發(fā)率的特點,即使早期給予規(guī)范的藥物和康復治療,仍有50%~60%的患者遺留不同程度的功能障礙[1]。針對如何增加缺血性腦損傷局部的血液供應、挽救可逆性神經(jīng)細胞、減輕神經(jīng)細胞的毒性,減少神經(jīng)細胞凋亡、使被抑制的神經(jīng)細胞覺醒等,研究者提出了神經(jīng)干細胞移植、炎癥阻斷劑、腦保護劑及凋亡抑制劑等新的治療理念[2-4],但以上方法均在實驗階段,是否會對人體造成潛在或長期的傷害還是未知的。針刺是傳統(tǒng)醫(yī)學的瑰寶,針刺治療缺血性腦中風的臨床報道也較多[5],但其具體作用機制尚不完全清楚。本研究旨在觀察針刺對局灶性缺血性腦損傷后神經(jīng)血管保護機制,從神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)的角度為針刺治療缺血性腦損傷提供理論依據(jù)和證據(jù)支持。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑與材料

        1.1.1 主要試劑及設備 MCAO線栓購于北京沙東生物技術有限公司,水合氯醛購于北京化學試劑公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)購于Sigma公司;突觸素(Synaptophysin,SYN)兔抗多克隆抗體、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)小鼠抗單克隆抗體及SP試劑盒購于武漢博士德生物技術公司;石蠟組織切片攤片機購于武漢俊杰電子有限公司;倒置熒光顯微鏡購于OLYMPUS公司;成像系統(tǒng)購于Q-IMAGING公司。

        1.1.2 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠144只,體質量(220±20)g,購自武漢大學動物實驗中心。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫(22±1)℃,濕度55%~75%,12 h晝夜交替,自由飲水進食。SPSS19.0統(tǒng)計軟件生成的隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為假手術組30只、模型組42只、針刺組42只及針刺對照組30只。本實驗得到湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院動物倫理委員會批準。

        1.2 方法

        1.2.1 大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的制作與篩選 參照Zea Longa法[6]制作MCAO及再灌模型。在室溫21℃~25℃環(huán)境下進行,具體操作如下:10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射,大鼠麻醉后仰臥位固定于超凈工作臺手術板,鈍性分離右側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、迷走神經(jīng)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)和頸內動脈(internal carotid artery,ICA)。微小動脈夾在CCA遠端夾閉,近端剪V形小切口,將線栓沿CCA、ICA順行向上插入至大腦前動脈(anterior cerebral artery,ACA),感微小阻力時即刻停止,從CCA分叉處計算線栓插入深度(1.7±0.2)cm,結扎頸總動脈CCA遠端的絲線,造成大腦中動脈血供阻斷。缺血2 h后,恢復大腦中動脈的血供。假手術組線栓導入深度1 cm后立即拔出。大鼠術后24 h,采用Zea Longa進行大鼠神經(jīng)功能缺損情況評估,將評分為1~3分者納入實驗。

        1.2.2 治療方法 針刺組:造模成功的大鼠在24 h內進行“滋水涵木”針刺治療,先固定大鼠頭部及四肢,參照“動物針灸穴位圖譜”(中國針灸學會實驗針灸研究會制定)選取太溪穴、太沖穴進行針刺(蘇州產“華佗牌”毫針,0.30 mm×25 mm),直剌0.2~0.5寸,進針深度約3 mm,留針30 min,1次/日,6次/周,連續(xù)2周。針刺對照組:不進行任何手術,針刺穴位、方法、頻率和針刺組相同。假手術組和模型組:術后常規(guī)飼養(yǎng)于籠內,不進行任何干預治療。

        1.3 檢測指標

        1.3.1 改良神經(jīng)功能缺損評分[7](modified neurological severity scores,mNSS)評價行為學 分別于手術后第3、7、14天評估其神經(jīng)功能缺損程度。mNSS包括運動功能(主要評估肌肉狀態(tài)、異常運動)、感覺功能(主要評估視覺、觸覺和本體感覺)和反射檢查,綜合評價大鼠神經(jīng)功能損傷的嚴重程度。最終評分為4個項目的總和,其中18~13分表示嚴重損傷,12~7分表示中度損傷,6~1分表示輕度損傷。

        1.3.2 TTC染色檢測腦梗死體積 在設定的時間點每組大鼠隨機取6只,斷頭處死大鼠,低溫以前囟為基點連續(xù)冠狀面切2 mm厚切片;37℃下2%TTC溶液中避光孵育30 min;于4℃、10%甲醛溶液中固定2 h。正常腦組織被染成均勻的紅色而梗塞部分不著色,為白色。腦組織切片拍照,采用圖像處理軟件(USA)對切片進行分析處理。

        1.3.3 免疫組化SP法檢測大鼠腦梗塞區(qū)VEGF、SYN的表達 在第3、7、14針刺治療結束完成mNSS評分后,每組隨機取8只大鼠,10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,50 mL注射器針頭插入左心室,同時剪開右心耳,經(jīng)心臟快速灌注9%氯化鈉溶液100~150 mL,再用4%的多聚甲醛溶液100~150 mL進行心臟灌注,兩肺及肝臟逐漸變白,大鼠四肢劇烈抽動,頸部、四肢及尾巴僵硬,即灌注成功。立即斷頭取腦組織,參考《大鼠腦立體定向圖譜》,冠狀切取視交叉前2 mm~視交叉后2 mm組織塊,4%多聚甲醛固定液浸泡24 h后脫水、浸蠟、石蠟包埋,切成4 μm石蠟切片。采用SP法參照試劑盒進行VEGF和SYN免疫組化染色,即將切片進行常規(guī)脫蠟及梯度酒精脫水,3%H2O2消除內源性過氧化物酶,微波抗原修復,分別一抗、二抗孵育,DAB染色,中性樹脂封片,每只大鼠的相同部位進行連續(xù)5張的切片,200×顯微鏡下對SYN和VEGF的積分光密度值(integral optical density value,IOD)進行檢測。

        1.4 統(tǒng)計學處理

        2 結果

        2.1 神經(jīng)行為學評分

        術后3、7、14 d,針刺對照組和假手術組大鼠mNSS評分為0;術后第3天,模型組和針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損最嚴重,分別為(8.80±1.87)分和(8.30±1.42)分,但差異無統(tǒng)計意義(P>0.05);術后第7、14天,針刺組大鼠mNSS的評分分別為(6.10±1.35)分及(3.80±2.16)分,均低于模型組的(7.20±2.07)分和(5.40±2.24)分(P<0.05或0.01),神經(jīng)功能恢復明顯優(yōu)于模型組。

        2.2 針刺對腦缺血再灌注后腦梗死面積的影響

        術后3、7、14 d,針刺對照組和假手組未見明顯腦梗死灶。術后第3天,針刺組與模型組比較腦梗死體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在第7、14天,針刺組腦梗死體積小于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)。針刺組與模型組腦梗死體積均在第7天達到高峰,第14天開始減少。見圖1,圖2。

        圖1 各組大鼠不同時間點腦梗死體積

        圖2 2組大鼠術后14 d時腦組織TTC染色

        2.3 針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶周圍皮質VEGF表達的影響

        假手術組和針刺對照組大鼠VEGF表達較弱。在腦梗死周邊皮質區(qū)可見VEGF免疫陽性細胞,陽性細胞胞體成圓形或橢圓形,胞核較大,胞漿呈深棕黃色。各時間點,在大鼠腦梗死周邊皮質部位,假手術組和針刺對照組比較無顯著性差異(P>0.05);術后第3天,模型組VEGF的表達明顯增加,高于假手術組和針刺對照組(P<0.01),在第7天達到高峰,第14天仍表達顯著;針刺組在第7和14天的VEGF的表達均高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或0.05),見圖3,表1。

        圖3 各組大鼠不同時間點VEGF的表達(光學顯微鏡,×200)

        表1 各組大鼠不同時間點的VEGF蛋白表達的IOD值(±s)

        表1 各組大鼠不同時間點的VEGF蛋白表達的IOD值(±s)

        注:與假手術組及針刺對照組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05;③P<0.01

        組別 只數(shù)腦缺血再灌注后時間針刺對照組假手術組模型組針刺組8 8 8 8 3 d 2188.32±770.42 2339.06±679.56 4177.18±516.35①4258.27±532.41①7 d 2201.53±810.61 2435.06±719.34 6158.27±646.59①7726.05±507.84①②14 d 2014.94±691.82 2135.81±704.51 5578.64±679.35①6495.47±662.96①③

        圖3 各組大鼠不同時間點SYN的表達(光學顯微鏡,×200)

        2.4 針刺對腦缺血再灌注大鼠梗死灶周圍皮質SYN表達的影響

        鏡下顯示,針刺對照組和假手術組大鼠腦組織中僅見少量SYN陽性細胞表達;模型組和針刺組大鼠中,在缺血梗死中心區(qū)僅可見組織碎片,未見明顯完整的細胞,而SYN幾乎沒有表達;在梗死灶的周邊皮質區(qū),可見SYN陽性細胞表達,呈棕黃色顆粒狀,主要圍繞在細胞周圍,排列成環(huán)狀、半弧形或者不規(guī)則團塊,胞漿中表達較少。模型組SYN的表達明顯高于假手術組和針刺對照組(P<0.01),從第3天到第14天逐漸增加;針刺組在各時間點SYN的表達均高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或0.05),見圖4,表2。

        表2 各組大鼠不同時間點的SYN蛋白表達的IOD值(±s)

        表2 各組大鼠不同時間點的SYN蛋白表達的IOD值(±s)

        注:與假手術組及針刺對照組比較,①P<0.01;與模型組比較,②P<0.05;③P<0.01

        組別 只數(shù)腦缺血再灌注后時間針刺對照組假手術組模型組針刺組8 8 8 8 3 d 22497.49±12658.35 23549.97±11239.41 34861.17±15562.32①40119.53±16698.59①②7 d 23187.17±13571.84 24191.83±12391.62 41758.34±16131.45①51894.73±15942.36①③14 d 24491.67±12482.51 24953.88±12279.67 49967.83±17836.16①60860.47±16649.24①③

        3 討論

        中醫(yī)治療中風病歷史悠久,缺血性中風以肝腎虧虛為本,風、火、痰、氣、瘀為標,屬本虛標實,雖病位在腦,但與肝腎密切相關;其病機之根本為肝腎陰虧,貫穿于中風病的整個病理過程。根據(jù)中醫(yī)治病必求于本的治療原則,當以“滋水涵木”為治療中風病之大法。肝藏血、腎藏精,肝主筋、腎主骨,精血充足,則腦髓得養(yǎng),神機得復,筋骨得養(yǎng),肢體得復。原穴,是臟腑原氣經(jīng)過和留止于四肢部的腧穴?!鹅`樞·九針十二原》記載:“五臟有疾,應出十二原”,“五臟有疾,當取之十二原”。原穴可以反映臟腑盛衰、氣血盈虧的變化,臨床亦多取原穴來調整臟腑經(jīng)絡的虛實病變。太溪穴,為足少陰腎經(jīng)的原穴、輸穴,為腎之元氣大會處,以補腎之本原,固其根本;太沖穴,屬足厥陰肝經(jīng)之輸穴、原穴,為肝臟原氣輸注之處,具有疏肝解郁、平肝潛陽之功。研究發(fā)現(xiàn)針刺可改善大腦皮質運動功能區(qū)的血液循環(huán);減少凋亡,促進中樞神經(jīng)功能的恢復;改善腦部能量代謝;激活大腦皮質特定運動功能區(qū)域;改善患者的認知及日常生活能力,促進腦功能重塑等[8-10]。最近研究發(fā)現(xiàn)針刺通過對大腦邊緣葉-旁邊緣葉-新皮質環(huán)路起調控作用,可在腦內多級中樞產生廣泛的腦功能調控效應,誘導大腦內在網(wǎng)絡系統(tǒng),產生對邊緣葉系統(tǒng)腦功能活動的廣泛抑制,進而達到全身多系統(tǒng)多器官的調制作用[11]。因此,本研究以“滋水涵木”法為理論基礎,選擇太溪穴施以捻轉補法,太沖穴施以捻轉瀉法,從神經(jīng)血管保護機制入手,探討其作用機理。

        NVU由神經(jīng)元、血腦屏障[(blood brain barrier, BBB),其中包括內皮細胞、基底膜、星形膠質細胞終足和周細胞]、小膠質細胞及細胞外基質(維持腦和神經(jīng)組織完整性)共同組成的一個結構和功能的基本單元。NVU是一個概念性的框架,反應了腦組織各細胞間相互聯(lián)系,相互影響及動態(tài)變化,將NVU作為一個整體來研究缺血性腦卒中的損傷和保護機制具有重要意義。國內近年來開展了部分針對缺血性腦損傷后血管神經(jīng)網(wǎng)絡調控的機制研究以及針刺、中藥促進NVU重建的機理研究[12,13],認為血管新生與神經(jīng)元新生之間存在密切的聯(lián)系[14]。SYN是一種Ca2+結合糖蛋白,位于突觸囊泡膜上,為突觸前傳入神經(jīng)纖維特異性標志物,是突觸發(fā)生和突觸重塑的重要蛋白標記物[15]。SYN的增加可反映神經(jīng)傳遞的增加[16],它的密度和分布可間接反映新生神經(jīng)元的數(shù)量和分布[17],對于神經(jīng)可塑性及其研究具有重要意義。VEGF是一種內皮細胞特異的強效的有絲分裂原,與梗死灶周圍新生血管的數(shù)量密切相關,作為刺激血管新生的核心代表,其表達增加可顯著改善缺血半暗帶的血供,促進側枝循環(huán)的建立,為NVU提供了良好的微環(huán)境,對缺血損傷區(qū)的神經(jīng)元和內皮細胞發(fā)揮直接保護作用[18,19]。因此,本研究以NVU相關核心蛋白VEGF和SYN作為檢測指標,探討針刺對缺血性腦損傷后的神經(jīng)血管保護機制。

        本研究發(fā)現(xiàn)在術后第7、14天針刺組大鼠神經(jīng)功能恢復明顯優(yōu)于模型組,提示針刺治療有助于缺血性腦損傷后運動功能的恢復;在第7和14天針刺組腦梗死體積均小于模型組,且針刺組VEGF、SYN的表達較模型組顯著增加,表明腦缺血對VEGF和SYN的表達有誘導作用,而針刺能促進其在缺血損傷區(qū)的高表達,從而促進神經(jīng)、血管的新生,通過NVU的網(wǎng)絡重構,從多個方面,多角度發(fā)揮腦保護作用。本實驗發(fā)現(xiàn)VEGF在第7天為表達高峰,后逐漸減弱,與腦梗死體積變化曲線一致,可能VEGF能通過恢復梗死區(qū)的血供,挽救缺血半暗帶并促進神經(jīng)功能的修復。Yang JP等[20]研究發(fā)現(xiàn)VEGF的調控是可變的,具有劑量依賴性,通過多種途徑發(fā)揮作用,但其過表達反而對神經(jīng)功能的恢復有害,作用的時間窗在短暫性腦缺血再灌注后3~24 h。SYN從缺血后第3天到第14天仍持續(xù)高表達,與VEGF的表達曲線不一致,可能與缺血性腦損傷后NVU的多因素復雜調節(jié)機制有關。

        本實驗結果提示“滋水涵木”針刺通過促進VEGF、SYN表達,促進NVU修復,從而改善缺血性腦損傷后大鼠神經(jīng)功能。推測“滋水涵木”針刺主要作用機理是該干預方式能對神經(jīng)元、微循環(huán)及神經(jīng)膠質在內的NVU進行整體調節(jié),彌補以往單一針對神經(jīng)元或血管治療的局限性,維持腦微環(huán)境的穩(wěn)定,促進神經(jīng)血管單元的再生和重構,實現(xiàn)大腦功能的重組,促進神經(jīng)功能的恢復。但在本研究中未觀察針刺對腦梗死區(qū)神經(jīng)元細胞的凋亡及膠質細胞表達的影響,而缺血性腦損傷后神經(jīng)元、腦膠質細胞和少突膠質細胞、微血管,3個方面組成了NVU,因此存在一定的局限性;同時本研究僅觀察了針刺治療14 d對血管新生的影響,尚需觀察更長時間神經(jīng)功能恢復及血管生成的情況,以上均是下一步研究的方向。

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        (本文編輯:唐穎馨)

        Effects of“Nourishing Liver and Kidney”Acupuncture Therapy on Expressions of Vascular En?dothelial Growth Factor and Synaptophysin after Cerebral Ischemia Reperfusion in Rats

        XIA Wen-guang,ZHENG Chan-juan,ZHANG Xuan,WANG Juan.Department of Rehabilitation Medicine,Hubei Province Hospital of the Intergrated Chinese and Western Medicine,Wuhan 430015,China

        Objective:To investigate the effects of acupuncture therapy on expressions of vasular endothelial growth factor(VEGF)and synaptophysin(SYN)after cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods:One hundred and forty-four healthy adult male SD rats were randomly divided into sham operation group(n=30),model group(n=42),acupuncture group(n=42)and acupuncture control group(n=30).The middle cerebral ischemia reperfusion model(MCAO)was established by suture method.Acupunctures were performed in the acupuncture group and acupuncture control group with at main acupoints of Taixi(K103),Taichong(ST09)of both sides,for 30 min.Then acupunctures were followed once daily in every morning,every 7-day for a course(acupuncture 6 days and rest 1 day).The sham operation group,model group were conventionally fed in the cages,without any intervention therapy.The rats of each group were assessed with Modified neurological severity(mNSS)scores, the infarct volume was calculated by TTC staining and the expressions of VEGF and SYN were detected with the method of immunohistochemical SP at the 3thd,the 7thd and 14th d.Results:Rats in acupuncture control group and sham operation group were presented no neurological deficit.The nerve functional recovery of rats in acupuncture group were significantly better than those in model group at the 7thd and 14thd after modeling.Acupuncture control group and sham operation group were presented no the infarct volume.The infarct volumes of acupuncture group were significantly smaller than those in model group at the 7thd and 14thd.At the each time point, the expressions of VEGF and SYN around the cerebral ischemia regions increased significantly in the model group,compared with the sham operation group and the acupuncture control group.In acupuncture group the expressions of VEGF at the 7thd,the 14thd increased more significantly than those in the model group.In acupuncture group the expressions of SYN at the each time point increased more significantly than those in the model group.Conclusion:The acupuncture therapy can promote the recovery of neurological function of focal cerebral ischemia reperfusion in rats which may be associated with increase of VEGF and SYN in the infarct regions.

        acupuncture;cerebral ischemia reperfusion;vasular endothelial growth factor;synaptophysin

        R741;R743

        ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.004

        湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院康復醫(yī)學科武漢 430015

        人事部留學人員科技活動項目擇優(yōu)資助經(jīng)費

        2016-10-06

        夏文廣docxwg@163.com

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