張茴燕，殷小平

·綜述·

一氧化碳對TLR4/NF-κB信號通路影響的研究進展

張茴燕，殷小平

在炎性反應(yīng)中Toll樣受體4（TLR4）觸發(fā)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB），調(diào)控大量炎性因子釋放。一氧化碳（CO）是一種新型遞質(zhì)，在多種炎性反應(yīng)動物模型中，低濃度CO具有抗炎作用，而其發(fā)揮抗炎作用的機制十分復(fù)雜。本文就CO對TLR4/NF-κB信號通路影響的研究進展做一綜述，闡述CO的抗炎作用。

一氧化碳；TLR4/NF-κB信號通路；炎癥；抗炎作用

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）與臨床上許多炎癥疾病有密切的關(guān)系。TLRs家族中的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）受體可與病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）結(jié)合，通過信號傳導(dǎo)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB），對其下游炎性基因進行調(diào)控，促進炎性因子的表達，參與多種器官炎癥疾病的發(fā)病過程。目前研究發(fā)現(xiàn)低濃度的一氧化碳（carbon monoxide，CO）在體內(nèi)具有抗炎性損傷的作用，能抑制TLR4/NF-κB信號通路。進一步深入研究CO與TLR4/NF-κB信號通路之間的內(nèi)在聯(lián)系，有助于明確CO發(fā)揮抗炎性損傷的作用機制。

1 CO的基本特性

內(nèi)源性CO產(chǎn)生的主要途徑為血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）催化血紅素降解為CO、膽紅素/膽綠素和亞鐵離子。HO有3種類型：HO-1、HO-2及HO-3（存在于大鼠腦內(nèi)，而人腦內(nèi)未發(fā)現(xiàn)）。HO-1是可誘導(dǎo)的血紅素降解的起始酶和限速酶，生理水平下在組織中低表達，在缺氧、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、血紅素、細菌內(nèi)毒素、重金屬等外界刺激下可誘導(dǎo)表達增加。有研究表明HO-1發(fā)揮抗炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激及抗細胞凋亡等細胞保護作用與其代謝產(chǎn)物CO有著密切的關(guān)系。

過去認為CO對人體是一種毒性物質(zhì)，CO與血液中的血紅蛋白具有較高的親和力，與之結(jié)合產(chǎn)生碳氧血紅蛋白，導(dǎo)致血紅蛋白不能與氧氣結(jié)合，從而引起機體組織出現(xiàn)缺氧，人體窒息死亡。1988年Harbin等通過研究發(fā)現(xiàn)低濃度CO對人體并沒有神經(jīng)毒性[1]。隨后大量實驗研究發(fā)現(xiàn)低濃度CO在體內(nèi)有著重要的生物學(xué)效應(yīng)，CO通過抑制T型Ca2+通道抑制細胞增殖[2]。在氧化應(yīng)激下，細胞內(nèi)的CO抑制DNA突變和凋亡反應(yīng)，直接參與DNA修復(fù)過程[3]。CO可升高細胞內(nèi)環(huán)磷鳥嘌呤核苷（cyclophosphate guanosine，cGMP）的濃度，抑制胞質(zhì)中Ca2+促進K+進入細胞內(nèi)，抑制血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生，舒張血管及抑制血小板聚集[4]。CO也可抑制炎性因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，iNOS）、細胞間粘附因子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）[5]和巨噬細胞炎癥蛋白1β（macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β）的表達，抑制炎性損傷[6]。最新研究表明CO可以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-2）的第1175和1214位點酪氨酸殘基、纖維母細胞生長因子2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）及絲/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）發(fā)生磷酸化，抗血管生成[7]?？傊?，CO是一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)，具有抗細胞增殖、抗氧化應(yīng)激、舒張血管、抑制血小板聚集、抗細胞凋亡及抗炎等細胞保護作用。CO具有良好的脂溶性，能迅速自由地彌散進入胞漿和細胞器內(nèi)，因此應(yīng)用外源性CO可發(fā)揮類似內(nèi)源性CO的功能。新型CO供體CORMs（carbon monoxide releasing molecules)能夠模擬內(nèi)源性CO在體內(nèi)產(chǎn)生的病理生理過程，可不經(jīng)機體代謝而直接作用于靶點組織釋放CO發(fā)揮生理作用。CORMs發(fā)展至今有5代，分別是CORM-1、CORM-2、CORM-3、CORM-F和CORM-A1及其衍生物。CORMs具有廣泛的生物活性，并在體內(nèi)的多個系統(tǒng)包括心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等發(fā)揮重要的生理功能。

2 TLR4/NF-κB信號通路

2.1 TLR4的分布及功能

TLR4受體普遍存在于人體的T細胞、B細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、腸上皮細胞等細胞內(nèi)，TLR4受體可與PAMPs結(jié)合，通過信號傳導(dǎo)激活NF-κB，NF-κB對其下游炎性基因進行調(diào)控，促進炎性因子的表達，在腦出血后炎性反應(yīng)、神經(jīng)退行性疾病、抗感染的宿主先天免疫反應(yīng)、自身免疫性疾病及多種急、慢性炎癥性疾病的發(fā)病機理中起重要作用。

2.2 TLR4的結(jié)構(gòu)及信號傳導(dǎo)通路

TLR4的結(jié)構(gòu)包括3個區(qū)域：胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域。胞外域為一段重復(fù)的亮氨酸序列，可與MD2/CD14復(fù)合體結(jié)合，識別PAMPs，激活下游信號通路并將識別的抗原信息向細胞內(nèi)傳遞,引發(fā)炎癥反應(yīng)。胞內(nèi)域為一段高度保守的序列，該序列與白介素1受體（IL-1R）胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)具有同源性，故又稱Toll/IL-1受體（Toll/Interleukin-I receptor domain，TIR）結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)域的轉(zhuǎn)接蛋白在細胞信號傳遞中發(fā)揮重要作用。TLR4受體的激活接受4種接頭蛋白的調(diào)節(jié)，即髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation factor 88，MyD 88）、MyD 88接頭蛋白（myD 88-adaptor like，MAL）、TLRS相關(guān)的干擾素活化因子（toll-interleukin-1R domain-containing adapter inducing IFN-β，TRIF）和TRIF的接頭分子（TRIF-related adaptormolecule，TRAM）。TLR4/NF-κB信號通路的傳導(dǎo)有2條途徑：MyD88依賴性途徑和MyD 88非依賴性途徑。TLR4受體的4種接頭蛋白均能夠?qū)⑿盘杺鬟f到TIR的結(jié)構(gòu)域，進而激活MYD 88非賴途徑和MYD 88依賴途徑。

MyD 88非依賴性途徑是通過TLR4受體的TIR結(jié)構(gòu)域與MAL結(jié)合，使NF-κB p65亞基發(fā)生磷酸化，從而使游離狀態(tài)下的NF-κB進入細胞核。MyD 88依賴性途徑通過TLR4受體的TIR結(jié)構(gòu)域與MyD 88蛋白結(jié)構(gòu)中的羧基端結(jié)合后激活MyD 88，使與IL-1受體相關(guān)激酶（interleukin-I receptor-associated kinase，IRAK）的氨基端發(fā)生磷酸化的反應(yīng)，從而激活細胞質(zhì)內(nèi)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF-receptor association factor 6，TRAF-6），TRAF-6與抑制蛋白κB（inhibitor of κB，IκB）激酶復(fù)合物（inhibitor of IκB kinases，Iκκ）結(jié)合并激活I(lǐng)κκ，使IκBα的第32、36位點絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化的IκB被泛素結(jié)合酶識別發(fā)生快速泛素化，在26s的蛋白酶的作用下被降解，致使NF-κB與IκB解離；解離狀態(tài)下的NF-κBp65亞基進一步轉(zhuǎn)錄后修飾，由細胞漿入細胞核。進入細胞核的NF-κB與靶基因的結(jié)合位點相結(jié)合，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，從而增加下游環(huán)氧酶2（cyclooxygenase，COX-2）、iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達[8,9]。而炎性因子IL-1β和TNF-α作為NF-κB下游產(chǎn)物亦可誘導(dǎo)NF-κ B的激活，可能是通過促進Iκκ激活及磷酸化、IκB磷酸化降解、p65亞基磷酸化，上調(diào)更多炎性因子的表達，形成炎性環(huán)路[10]。

3 CO與TLR4/NF-κB信號通路

3.1 CO與TLR4/MD2

細胞在受到PAMPs的刺激下，TLR4在其附屬蛋白MD2的作用下發(fā)生糖基化，形成TLR4/MD2復(fù)合體并轉(zhuǎn)運至細胞膜[11]，激活下游信號通路并將識別的抗原信息向細胞內(nèi)傳遞,引發(fā)炎癥反應(yīng)。在探討CO-RBC對出血性休克影響的動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)CO-RBC發(fā)揮肝細胞色素P450保護作用是通過2方面來實現(xiàn)的：一是在休克早期（0～1 h）CO抑制Kupffer細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的活性，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用；二是在晚期（6～24 h）CO通過抑制TLR4信號通路來減少炎性因子IL-6及TNF-α的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用[12]。在急性胰腺炎動物模型中，TLR4基因敲除組CORM-2不能發(fā)揮抑制前炎性細胞活素TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-12p40表達的作用。因此CO發(fā)揮抗炎作用可能是通過抑制TLR4受體活性來實現(xiàn)的。有實驗研究進一步發(fā)現(xiàn)CORM-2處理后24h和48h小鼠的巨噬細胞內(nèi)TLR4/MD2復(fù)合體表達顯著減少，而TLR4、MyD 88單體表達無明顯變化，證實CORM-2可有效地抑制單核/巨噬細胞內(nèi)TLR4/MD2受體的活性，從而抑制TLR4誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，減少胰腺損傷和肺損傷。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎性模型中，外源性CO處理后30～60 min，應(yīng)用免疫沉淀反應(yīng)法未檢測到TLR4/MD2復(fù)合體的形成，表明CO可抑制TLR4與MD2結(jié)合，阻止TLR4受體信號的膜轉(zhuǎn)運。有研究中發(fā)現(xiàn)，骨髓樹突細胞內(nèi)HO-1誘導(dǎo)劑和外源性CO治療干預(yù)后21 h，TLR4/ MD2復(fù)合體的表達相對于對照組減少了50%，而TLR4、MD2單體表達無明顯變化。CO可能通過抑制TLR4與MD2之間的相互作用，抑制TLR4發(fā)生糖基化從而減少細胞膜上TLR4/MD2復(fù)合體的形成，也可能是CO使TLR4/MD2復(fù)合體的構(gòu)象發(fā)生改變，以致不能識別LPS[13]。

3.2 CO與TLR4/MyD88

LPS刺激可以誘導(dǎo)TLR4受體與MyD88結(jié)合從而激活下游信號NF-κB的活性，促進炎癥因子COX-2、PEG2的表達。在腦血管內(nèi)皮細胞內(nèi)CORM-2干預(yù)可以抑制TLR4與MyD88之間的相互作用從而抑制NF-κB的活性，減少炎癥因子的表達，因此CO可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB活性抑制炎性因子的表達[14]。也有實驗研究提出在LPS誘導(dǎo)的炎性模型中，CO可以明顯抑制TLR4與MyD88、TLR4與TRIF之間的相關(guān)作用從而發(fā)揮抗炎作用[15]。

小窩蛋白-1（caveolin-1，cav-1）是細胞膜上的1種轉(zhuǎn)運蛋白，可以將細胞外的生物活性分子向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移并在胞內(nèi)運輸。cav-1與TLR4受體結(jié)合從而抑制TLR4與MyD88、TRIF結(jié)合形成復(fù)合體。Wang XM等[16]發(fā)現(xiàn)，cav-1基因敲除的小鼠腹膜巨噬細胞內(nèi)外源性CO不能發(fā)揮抑制TLR4/MyD88復(fù)合體形成的作用，CO通過促進cav-1與TLR4受體結(jié)合從而抑制TLR4與MyD88結(jié)合，抑制下游信號NF-κB的活性。也有文獻指出在受LPS刺激的巨噬細胞內(nèi)CO通過增加cav-1與TLR4之間的聯(lián)系，抑制TLR4與MyD88結(jié)合從而抑制NF-κB的活性[17]。然而有研究表明在LPS誘導(dǎo)的肺炎動物模型中，LPS誘導(dǎo)cav-1結(jié)構(gòu)上的酪氨酸14發(fā)生磷酸化，使cav-1與TLR4結(jié)合進而激活TLR4/MyD88/NF-κB的活性，誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生[18]。

3.3 CO與NF-κB信號通路

經(jīng)典的NF-κB信號通路是Iκκ的激活及磷酸化使IκB磷酸化降解，NF-κB與IκB解離后進入細胞核內(nèi)。在類風濕性關(guān)節(jié)炎的模型中，LPS可激活TLR4受體，形成TLR4/MyD88/ TRAF6/c-Src復(fù)合體，通過調(diào)節(jié)NIκ/Iκκ/NF-κB和MAPKs/AP-1信號通路來調(diào)節(jié)下游炎性因子VCAM-1的表達和白細胞粘附，CORM-2處理可以有效地抑制NF-κB和AP-1的活性，從而減少VCAM-1的表達和白細胞粘附[19]。在探索類風濕關(guān)節(jié)炎的滑膜成纖維細胞內(nèi)CORM-2是否可以抑制NF-κB下游炎性因子cPLA2表達的研究中發(fā)現(xiàn)，CORM-2可以通過抑制NF-κB p65、Iκκ α/β磷酸化和ROS產(chǎn)生來抑制NF-κB p65進入細胞核內(nèi)與靶基因cPLA2的結(jié)合，從而抑制TNF-a誘導(dǎo)的炎癥因子的表達，而不是通過抑制p38 MAPK和JNK1/2的磷酸化來實現(xiàn)的[20]。有研究表明在單核細胞中CO可以抑制LPS誘導(dǎo)的IκB磷酸化降解，也可以抑制NF-κB p65核移位[21]。合并CO治療可以明顯加強羥基酪醇抑制NF-κB p65和Iκκ α/β的磷酸化及NF-κB核移位的作用[22]。然而在探索樹突細胞內(nèi)CO抑制TLR誘導(dǎo)的免疫原性的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，HO-1誘導(dǎo)劑（CoPP）可以抑制LPS誘導(dǎo)的IκBα磷酸化，而CORM-2不能抑制IκBα的磷酸化[23]。也有研究證實CORM-3可抑制IκBα降解，其抑制炎性因子IL-1β的表達是通過抑制NF-κB p65核內(nèi)移及NF-κB p65、p50的DNA結(jié)合活性實現(xiàn)的[24]。在內(nèi)皮細胞內(nèi)，運用外源性CO可激活核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)，使其與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的相互作用，誘導(dǎo)抗氧化蛋白HO-1的表達，增加NF-κB p65的谷胱甘肽化，減少NF-κB核移位，從而減少炎性因子的表達，但不能抑制IκBα的降解[25]。甲基苯丙胺可增加ROS活性及促炎因子的表達，對小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性，有研究在甲基苯丙胺誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥模型中，發(fā)現(xiàn)給予褪黑素干預(yù)后Nrf2信號通路活性增強并促進HO-1表達，且能抑制IκBα蛋白發(fā)生降解及阻止NF-κBp65亞基核易位，從而改善炎癥損傷[26]。

4 CO與TLR4/NF-κB誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性疾病

TLR4受體在小膠質(zhì)細胞內(nèi)也有表達，且能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化及前炎癥因子釋放，介導(dǎo)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理過程中的神經(jīng)毒性作用[27]。有學(xué)者提出小膠質(zhì)細胞釋放的TNF-α可以通過旁分泌作用調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護功能[28]。在TLR4誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥動物模型中，Nrf2及HO-1基因敲除后葫蘆素干預(yù)不能發(fā)揮神經(jīng)保護作用[29]。腦缺血再灌注后激活TLR4，誘導(dǎo)其胞內(nèi)銜接蛋白MyD88表達量增加，采用TLR4抗體阻斷后，MyD88表達量減少，NF-κB結(jié)合活性明顯降低，從而減輕腦組織神經(jīng)元損傷。Chang CY[30]等研究結(jié)果提示在腦缺血動物模型中，川穹嗪干預(yù)可增加中性粒細胞內(nèi)Nrf2和HO-1表達，抑制TLR4炎性相關(guān)信號分子的表達。也有研究提出烏索酸干預(yù)可通過激活Nrf2信號通路，誘導(dǎo)HO-1表達增加，從而抑制TLR4信號，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激及抗炎作用[31]。內(nèi)源性CO是HO-1催化血紅素的降解產(chǎn)物，HO-1抑制劑（ZnPP）可抑制HO-1活性，從而減少CO的體內(nèi)含量。有研究表明HO-1抑制劑通過介導(dǎo)TLR4信號通路減輕腦缺血后的炎性損傷，改善認知功能[32]。

近年來有研究證實在大鼠腦出血模型中TLR4可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的活化，通過細胞內(nèi)MyD88/TRIF通路激活NF-κB并促進其核易位，與靶基因位點結(jié)合，誘導(dǎo)下游炎性因子的表達，從而介導(dǎo)腦出血炎癥損傷[33]。有研究表明腦出血術(shù)前30 min給予CORM-3干預(yù)可減輕腦出血后炎性反應(yīng)[34]。在腦出血動物實驗發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞內(nèi)HO-1反應(yīng)性升高，可抑制NF-κB及其下游炎性因子的表達，從而抑制腦出血后的炎性反應(yīng)[35]，但HO-1抑制炎性反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用的具體機制尚不明確。CO是HO-1催化血紅素的代謝產(chǎn)物，HO-1的神經(jīng)保護作用可能是通過降解產(chǎn)物CO抑制TLR4/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的。因此，CO能否通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來減輕腦出血后炎性損傷有待下一步研究。然而，有研究提出腦出血后HO-1過度表達具有細胞毒性作用，且通過激活小膠質(zhì)細胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路促進炎性因子的表達，加重腦損傷[33]。

5 小結(jié)

綜上所述，TLR4為NF-κB通路的上游信號受體，TLR4通過信號傳導(dǎo)激活NF-κB，CO可通過干擾TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎性損傷作用，其機制可能為抑制TLR4與MD2結(jié)合，也可能是抑制TLR4與MyD88結(jié)合，還可能是促進cav-1與TLR4受體結(jié)合從而抑制信號傳導(dǎo)激活NF-κB信號通路。然而cav-1與TLR4結(jié)合是抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用還是激活該通路發(fā)揮促炎作用尚存在爭議，有待進一步研究。CO發(fā)揮抗炎作用還可能是直接通過干擾NF-κB信號通路，抑制NF-κB p65亞基、IκB及Iκκ α/β的磷酸化過程或者NF-κB的核易位。

目前國內(nèi)外大量實驗研究表明低濃度CO可作用于TLR4/ NF-κB信號通路的不同靶點，抑制下游炎性因子的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。近年來有研究表明CO也可通過增加無活性的磷酸化的糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3 β）[36]及增加反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）與CBP的結(jié)合抑制NF-κ B p65與CBP的結(jié)合[37]干擾GSK-3β/NF-κB信號通路，從而發(fā)揮抗炎作用。因此，深入了解CO發(fā)揮抗炎作用的具體機制，有助于更好地發(fā)現(xiàn)CO治療的作用靶點。

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（本文編輯：唐穎馨）

R741

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.014

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科南昌 330006

2016-03-09

殷小平xiaopingbuxiao@ 126.com