秦彥昌，賈棟，于慶偉

慢病毒介導的Cullin3沉默對人膠質(zhì)瘤細胞的影響

秦彥昌，賈棟，于慶偉

目的：探討慢病毒介導特異性短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾Cullin3表達對人膠質(zhì)瘤細胞的影響。方法：RT-qPCR及Western blot檢測Cullin3在人膠質(zhì)瘤細胞系SW1783，U251及U87MG中的表達；構建靶向Cullin3的shRNA重組慢病毒，轉(zhuǎn)染U251和U87MG細胞并測定轉(zhuǎn)染效率。實驗分為3組：Blank組（陰性對照組）、NC-shRNA組（空載慢病毒組）及Cullin3-shRNA組（慢病毒介導Cullin組）。MTT法和BrdU實驗檢測細胞活力和增殖能力；Transwell實驗檢測細胞遷移能力；流式細胞術檢測細胞周期的變化。結(jié)果：與正常人星形膠質(zhì)細胞相比，Cullin3在人膠質(zhì)瘤細胞系SW1783，U251及U87MG中高表達。Cullin3-shRNA轉(zhuǎn)染U251和U87MG細胞后，與Blank組及NC-shRNA組相比，Cullin3-shRNA組Cullin3表達水平下降（P＜0.05），細胞活力和細胞增殖能力顯著降低，侵襲能力下降，細胞周期被阻滯于G0/G1期。結(jié)論：Cullin3在膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，提示Cullin3有望成為人腦膠質(zhì)瘤基因治療的候選靶點。

腦膠質(zhì)瘤；Cullin3；短發(fā)夾RNA；慢病毒

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，具有增殖能力強，易復發(fā)，預后差等特點[1]。其發(fā)病率約為顱內(nèi)腫瘤的40%左右[2]，中位生存期為15～19個月[3]。由于目前治療方法（包括手術、放療和化療）的局限性，基因治療成為研究熱點[4-6]。既往研究表明Cullin 3參與胚胎發(fā)育、細胞周期調(diào)控和血壓調(diào)節(jié)等生理過程[7]。Cullin3功能失調(diào)后導致原癌蛋白積累或過度降解腫瘤抑制蛋白，與腫瘤密切相關[8]。但Cullin3是否參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展尚不清楚。因而本研究通過構建Cullin3慢病毒載體并轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251及U87MG細胞，探討其對膠質(zhì)瘤細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人膠質(zhì)瘤細胞株SW1783，U251及U87MG購自中國科學院上海細胞生物科學研究所；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；Lipofectamine-2000購自美國Invitrogen公司；慢病毒載體GV248及慢病毒包裝質(zhì)粒由上海吉凱基因化學公司提供。Cullin3，β-actin一抗及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗購自美國Pierce公司。細胞周期檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達載體的構建 參考Gene-bank中人Cullin3核苷酸序列（序列號為：NM_ 001257197.1）設計3個Cullin3不同位點的特異shRNA靶點序列，并篩選出干擾效果最好的靶點序列（5’-ccggtGGTGCTCACGACAGGATATTGttcaagagaCAA TATCCTGTCGTGAGCACCttttttgatcc-3’）；提取U251及U87MG細胞的總RNA，PCR擴增，Age I和BamH I雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，將其連接到GV248慢病毒載體后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，鑒定并測序。最后用293T細胞包裝病毒，滴度測定完成后轉(zhuǎn)染目的細胞。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與分組處理 人膠質(zhì)瘤細胞株SW1783，U251及U87MG均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2。待細胞融合至80%～90%，隨機分組進行試驗。細胞分為3組：Blank組（陰性對照組），不做任何干預處理；NC-shRNA[空載體-短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)]組；Cullin3-shRNA組。

1.2.4 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）檢測mRNA表達 Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，并用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。以cDNA為模板，RT-qPCR測定細胞中Cullin3 mRNA含量。反應體系（20 μl）：SYBR Premix Ex Taq混合液12 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL（2.5 μmol/L），無RNA酶水5 μL。反應條件：94°C預變性10 min；95°C，40 s；61°C，40 s；72°C，45 s，40個循環(huán)；72°C延伸10 min。Cullin3的上游引物為：5’-GCCTTTCCGGTGCGAGAAG-3’，下游引物為5’-TACGACTTCTCCTTTCCGCT-3’。以β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt計算方法計算基因相對表達水平。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達RIPA蛋白裂解液裂解細胞后，4°C，1 000 rpm離心10 min，吸取上清，BCA法測定總蛋白濃度?？偟鞍滓?0 μg/孔上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，用電轉(zhuǎn)移儀進行轉(zhuǎn)膜；PVDF膜經(jīng)PBS封閉液（含5%牛血清白蛋白）37°C封閉1 h后，加入Cullin3（1:1 000稀釋）和β-actin（1:1 500稀釋）一抗，4°C孵育過夜；隨后加入相應的HRP標記的二抗，37°C孵育1 h。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定目的蛋白的光密度值。

1.2.6 MTT檢測細胞活力 將轉(zhuǎn)染24 h的細胞接種到96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL（5 g/L）。37°C條件下培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL,震蕩20 min，570 nm波長下測定各孔吸光光度值。

1.2.7 BrdU實驗檢測細胞增殖活性 將轉(zhuǎn)染24 h的細胞接種到6孔板，每孔加入10 μmol/L的BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再用40 g/L多聚甲醛固定30 min，血清封閉后加入抗BrdU抗體，4°C過夜，室溫復溫后加入羅丹明標記的熒光二抗，DAPI復染后，計數(shù)BrdU陽性細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.8 Transwell實驗檢測細胞的遷移能力 將轉(zhuǎn)染24 h的細胞接種到Transwell上室中，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（500 μL/孔）。37°C孵育24 h后，甲醇室溫固定30 min，進行結(jié)晶紫染色。棉球小心擦去上室未穿膜的細胞，在倒置顯微鏡下隨機取5個視野并計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。

1.2.9 流式細胞術檢測細胞周期 將轉(zhuǎn)染后的細胞以1×106細胞/孔接種于6孔板內(nèi)，用0.25%胰酶消化細胞，待細胞開始濃縮變圓時立即用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。900 rpm離心5 min后，棄去培養(yǎng)基，收集細胞沉淀，用PBS洗滌2次。再次離心（900 rpm離心5 min），棄上清，加入75%乙醇2 mL，4℃過夜。1 200 rpm離心5 min后棄上清，PBS洗滌。加入400 μL的溴化乙錠（PI，50 μg/L）及100 μL RNA酶溶液（500 μg/mL），4℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同膠質(zhì)瘤細胞系中Cullin3表達

RT-qPCR及Western blot結(jié)果表明，與正常人腦星形膠質(zhì)細胞相比，Cullin3在膠質(zhì)瘤細胞系SW1783，U251及U87MG中表達均明顯升高（P＜0.05），且以U87MG中升高最為顯著，其次為U251和SW1783，見圖1。

2.2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤U251及U87MG細胞

RT-qPCR及Western blot結(jié)果表明，與Blank組及NC-shRNA組相比，Cullin3-shRNA組細胞Cullin3 mRNA及蛋白表達顯著降低，表明Cullin3-shRNA慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染至U251和U87MG細胞，見圖2。

2.3 細胞活力及增殖力檢測結(jié)果

與Blank組及NC-shRNA組相比，轉(zhuǎn)染Cullin3-shRNA的U251和U87MG細胞的細胞活力顯著下降，增殖能力顯著降低（P＜0.05），表明沉默Cullin3可顯著抑制膠質(zhì)瘤U251和U87MG細胞的細胞活力和增殖能力，見圖3。

圖1 膠質(zhì)瘤細胞系中Cullin3 mRNA（A）及蛋白（B）表達水平

圖2 U251及U87MG膠質(zhì)瘤細胞中Cullin3 mRNA（A）及蛋白（B和C）表達水平

圖3 U251及U87MG膠質(zhì)瘤細胞細胞活力（A）和增殖能力（B）檢測結(jié)果

2.4 Transwell實驗檢測細胞的遷移能力

與Blank組及NC-shRNA組相比，Cullin3-shRNA組U251和U87MG細胞的遷移能力明顯下降，表明沉默Cullin3可顯著抑制膠質(zhì)瘤U251和U87MG細胞的細胞遷移能力，見圖4。

2.5 Cullin3對U251和U87MG膠質(zhì)瘤細胞周期的影響

以流式細胞術檢測Cullin3沉默對細胞周期的影響，轉(zhuǎn)染后48 h，與Blank組（57.46%）及NC-shRNA組（60.35%）相比，轉(zhuǎn)染Cullin3-shRNA的U251細胞處于G0/G1期的細胞數(shù)明顯增加，為74.54%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染Cullin3-shRNA的U87MG細胞處于G0/G1期的細胞數(shù)為76.28%，顯著高于Blank組（65.32%）及NC-shRNA組（67.89%）。以上結(jié)果表明Cullin3基因沉默顯著引起U251和U87MG膠質(zhì)瘤細胞的周期阻滯于G1期，從而抑制細胞增殖。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，具有增殖能力強，易復發(fā)的特點[1]。然而，因為缺乏有效的分子標志物、藥物靶點及治療手段，其治療一直困擾著人們。本文主要探討了慢病毒介導shRNA干擾Cullin3表達對人膠質(zhì)瘤細胞的影響并揭示出Cullin3在腦膠質(zhì)瘤的增殖和遷移方面發(fā)揮了重要的作用。實驗表明，與正常星形膠質(zhì)細胞相比，Cullin3在腦膠質(zhì)瘤細胞中過表達。沉默Cullin3能有效地抑制細胞的增殖和遷移并使細胞周期阻滯于G1期。

圖4 U251及U87MG膠質(zhì)瘤細胞細胞遷移能力檢測結(jié)果

圖5 流式細胞術檢測細胞周期分布。U251（A）和U87MG（B）細胞周期的分布。U251 Blank組（C）、NC-shRNA組（D）及Cullin3-shRNA組（E）細胞周期分布。U87MG Blank組（F）、NC-shRNA組（G）及Cullin3-shRNA組（H）細胞周期分布。

Cullin蛋白為Cullin-Ring E3類泛素連接酶（CRLs家族）的一員，在人體中包括7個成員，即Cullin1、Cullin2、Cullin3、Cullin4A、Cullin4B、Cullin5及Cullin7，其在DNA復制、細胞周期、腫瘤抑制、生長發(fā)育及信號傳到過程中發(fā)揮著重要的作用[9]。研究表明，過表達Cullin4A能夠促進肺癌及垂體腺瘤的生長[10,11]。Cullin7缺失可誘導胰島素信號途徑異常并出現(xiàn)生長發(fā)育缺陷[12]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)Cullin1在膠質(zhì)瘤組織中高表達，小RNA干擾其表達會抑制細胞的增殖和細胞周期的中斷（G1）[13]。但Cullin3是否參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Cullin3與代謝紊亂、神經(jīng)退變及腫瘤等多種病癥的發(fā)生發(fā)展有關[14]。Cullin3能夠通過上調(diào)VEGF蛋白促進血管生成[15]。在乳腺癌細胞中，Cullin3上調(diào)并通過BRMS1促進細胞增殖及遷移[16]。在海馬神經(jīng)元和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中，Cullin3-KLHL20復合物促進軸突增生和分支[17]。這些研究提示Cullin3也有可能在神經(jīng)相關疾病的發(fā)展進程中發(fā)揮了作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤細胞中Cullin3在mRNA及蛋白水平過表達。慢病毒shRNA載體沉默Cullin3會抑制細胞的增殖和遷移。這與Huo等[16]的研究結(jié)果相似，即Cullin3能夠促進乳腺癌細胞增殖和遷移。進一步研究表明，Cullin3是通過使細胞周期停滯在G0/G1期影響U251及U87MG膠質(zhì)瘤細胞增殖。相關報道表明，Cullin3可以通過RhoA激酶調(diào)節(jié)血管平滑肌功能[18]并調(diào)節(jié)細胞周期[19]，在腦膠質(zhì)瘤中RhoA激酶是否也參與Cullin3對細胞的調(diào)控作用還有待驗證。

綜上所述，本研究表明Cullin3在腦膠質(zhì)瘤細胞中過表達。沉默Cullin3能有效地抑制細胞的增殖和遷移并使細胞周期阻滯于G1期，提示Cullin3有望成為治療腦膠質(zhì)瘤的靶標分子。進一步研究將深入探討及驗證腦膠質(zhì)瘤中Cullin3相關通路的調(diào)控作用機制，以期為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供一個新的候選靶點。

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（本文編輯：唐穎馨）

Effects of Lentivirus-mediated Cullin3 Silencing on Human Glioma Cells

QIN Yan-chang,JIA Dong,YU Qing-wei.Department of Neurosurgery,Tangdu Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi’an 710038,China

Objective:To investigate the effects of Cullin3 gene silencing on the biological characteristics of human glioma cells.Methods:Cullin3 mRNA and protein levels in human glioma cells SW1783,U251 and U87MG were detected by RT-qPCR and Western blot.A lentiviral vector expressing Cullin3 shRNA was constructed and transfected into the U251 and U87MG cells and the transfection efficiency was confirmed.Cells were divided into three groups:the blank(negative control group),NC-shRNA(blank vector group)and the Cullin3-shRNA(Cullin3-shRNA vector group).The cell viability and cell proliferation were determined by MTT assay and BrdU incorporation assay respectively.Meanwhile,the cell migration was analyzed by Transwell assay. Flow cytometry was used to monitor the changes of cell cycle distribution.Results:The Cullin3 protein levels in SW1783，U251 and U87MG glioma cells were significantly higher than that in the normal astrocytes.Transfection of Cullin3-shRNA significantly abolished Cullin3 expression.Compared with the Blank and NC-shRNA groups,Cullin3-shRNA significantly inhibited the growth and proliferation of glioma cells U251and U87MG., In addtion,the migration rate was significantly decreased in Cullin3-shRNA group.Flow cytometry indicated that the cell cycle was arrested at G0/G1 phase in Cullin3-shRNA group.Conclusion:Cullin3 plays a critical role in gliomagenesis and development of glioma and it maybe a potential target for human glioma therapy.

glioma;cullin3;short hairpin RNA;lentivirus

R741;R739.41

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.01.003

第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科西安 710038

2016-03-16

秦彥昌shidasda@163.com