關(guān)曉宇，徐志超，王永強(qiáng)，李曉齊，曹紅，鄭世軍

中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

抗雞白細(xì)胞介素4單克隆抗體的制備及鑒定

關(guān)曉宇，徐志超，王永強(qiáng)，李曉齊，曹紅，鄭世軍

中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

為了制備雞白細(xì)胞介素4 (chIL-4) 單克隆抗體，將成熟的chIL-4基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-6P-1上，然后在大腸桿菌中分別誘導(dǎo)重組蛋白His-chIL-4和GST-chIL-4的表達(dá)，并純化。將純化后的His-chIL-4作為免疫原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)4次免疫后，取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞 (SP2/0) 融合。將純化后的GST-chIL-4作為篩選抗原，利用間接ELISA篩選陽性克隆。陽性細(xì)胞株經(jīng)3次亞克隆后，獲得3株穩(wěn)定分泌抗chIL-4蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H。經(jīng)ELISA檢測(cè)，3株單克隆抗體的亞型均為IgG1，親和力解離常數(shù) (Kd) 分別為1.79×10–9、1.61×10–9和2.36×10–9。經(jīng)Western blotting及間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定，3株單克隆抗體均能特異性識(shí)別原核和真核表達(dá)的chIL-4蛋白。Western blotting試驗(yàn)證明1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H識(shí)別的抗原表位區(qū)域分別為chIL-4蛋白N端的第1–40、80–112和40–80位氨基酸。該單克隆抗體的制備為chIL-4的檢測(cè)和生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

雞白細(xì)胞介素4，原核表達(dá)，單克隆抗體

白細(xì)胞介素4 (Interleukin 4，IL-4) 是20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)的，具有多種免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，對(duì) B細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及造血細(xì)胞等非免疫細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，可通過與多種類型細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答[1]。

由于IL-4重要的生物學(xué)活性，近年來關(guān)于雞白細(xì)胞介素 4 (chIL-4) 的體外表達(dá)及生物學(xué)功能的研究變得越來越熱。2004年 Avery等[2]在克隆雞T2細(xì)胞因子基因簇時(shí)發(fā)現(xiàn)單拷貝的功能性 IL-4 基因，發(fā)表了雞 Gallus gallus (AJ621249) IL-4 mRNA基因序列，其全長(zhǎng)為411 bp，chIL-4前體是137肽，信號(hào)肽為25個(gè)氨基酸，分泌的成熟的chIL-4有112個(gè)氨基酸殘基，含3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵和2個(gè)可能的N端糖基化位點(diǎn)。日本學(xué)者 Kubota等[3]從外周血和胸腺中提取 mRNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后插入pFastBac1，通過昆蟲表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)入AcNPV桿狀病毒表達(dá)，獲取的成熟的chIL-4蛋白分子量大約為12.4 kDa。戴華等[4]利用RT-PCR從被誘導(dǎo)的雞脾臟淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出 chIL-4基因的cDNA，并構(gòu)建出原核表達(dá)載體pGEX-6P-chIL-4和pET-chIL-4，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，chIL-4基因在上述載體中均獲得表達(dá)，融合蛋白大小分別為38 kDa和18 kDa。

目前，已有在蛋白水平上檢測(cè)人和小鼠IL-4的商品化試劑盒，但是由于chIL-4與人和小鼠IL-4的同源性僅分別為22.48%和21.23%，所以在學(xué)術(shù)研究和臨床疾病分析中主要還是以RT-PCR檢測(cè)chIL-4的相對(duì)含量。因此，建立針對(duì)chIL-4在蛋白水平上的檢測(cè)方法，將有助于評(píng)價(jià)chIL-4在機(jī)體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化水平，對(duì)于了解禽類傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸情況及機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)規(guī)律具有重要意義。

單克隆抗體制備技術(shù)為建立蛋白質(zhì)檢測(cè)方法提供了有利的條件。翁凌等[5]利用抗雞白細(xì)胞介素 2 (chIL-2) 單克隆抗體作包被抗體、生物素標(biāo)記的抗chIL-2多克隆抗體作檢測(cè)抗體建立了雙抗體夾心 ELISA 測(cè)定方法，該方法對(duì)chIL-2的檢測(cè)靈敏度為 50 pg/mL。王肖祎[6]利用抗雞白細(xì)胞介素 18 (chIL-18) 單克隆抗體為包被抗體、HRP標(biāo)記的抗chIL-18單克隆抗體為檢測(cè)抗體建立的雙抗體夾心ELISA方法，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)31.5 pg/mL。鄭玉姝[7]利用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)建立的雙抗體夾心 ELISA方法，以鼠抗雞IFN-γ單克隆抗體為包被抗體，以針對(duì)不同抗原表位的生物素化單克隆抗體為檢測(cè)抗體對(duì)IFN-γ進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果顯示，在10-1 000 pg/mL的濃度范圍內(nèi)，IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r=0.992 1。

本研究旨在利用重組chIL-4蛋白制備識(shí)別不同抗原表位的抗chIL-4單克隆抗體，為建立chIL-4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，為監(jiān)測(cè)雞體免疫狀態(tài)和研究雞體免疫機(jī)制提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌Escherichia coli DH5α和BL21，骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0和雞胚成纖維細(xì)胞 DF-1，pGEX-6p-1、pET-28a和pRK5-flag質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T-chIL-4由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛教授惠贈(zèng)；BALB/c小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2 主要試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶、LA Taq酶和DNA連接酶購自TaKaRa公司；dNTPs購自CNS公司；DNA膠回收試劑盒購自ZYMO RESEARCH公司；高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自北京艾德萊公司；鼠源 His-tag、GST-tag單克隆抗體購自Abmart公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、馬抗山羊IgG和FITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG購自北京鼎國公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、flag-tag單克隆抗體以及Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents購自Sigma公司；PEG4000購自MERCK公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、非必需氨基酸購自 Gibco公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自Hyclone公司；Vigofect轉(zhuǎn)染試劑購自威格拉斯生物技術(shù) (北京) 有限公司；壓力攪拌式濃縮杯購自默克化工技術(shù) (上海) 有限公司；Centrifuge5810R型低溫冷凍高速離心機(jī)購自Eppendorf公司；Alpha ImagerTM2200型凝膠成像分析儀購自美國 Alpha公司；Kodak醫(yī)學(xué) X光顯影機(jī)102型購自美國Kodak公司；Sunrise型96孔酶標(biāo)儀購自TECAN公司。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化

以 pMD19-T-chIL-4為模板，設(shè)計(jì)引物 F1 (5′-GGATCCTTACAGCTCTCAGTGCCG-3′)、R1 (5′-CTCGAGCTTATTTTTAGCTAGTTG-3′)、F2 (5′-GGATCCTTACAGCTCTCAGTGCCG-3′)、R2 (5′-CTCGAGTCACTTATTTTTAGCTAG-3′) 擴(kuò)增不含信號(hào)肽序列的 chIL-4基因，經(jīng)膠回收、雙酶切、連接，分別構(gòu)建到 pET-28a和pGEX-6p-1原核表達(dá)載體上，得到質(zhì)粒pET-28a-chIL-4和pGEX-6p-1-chIL-4，將其轉(zhuǎn)化到E. coli BL21中，在37 ℃、6 h、IPTG濃度為1 mmol/L的條件下誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。通過SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)情況并用 Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證后，提取包涵體，并按照文獻(xiàn)[8]所述方法進(jìn)行稀釋復(fù)性，獲得重組蛋白。

1.4 chIL-4單克隆抗體的制備

以重組蛋白His-chIL-4為抗原，免疫8周齡雌性BALB/c小鼠。首次免疫，抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，頸背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，50 μg/只。3周后進(jìn)行二免，抗原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，50 μg/只。3周后進(jìn)行三免，免疫劑量與途徑同二免[9]。三免1周后，小鼠斷尾采血分離血清，以重組蛋白GST-chIL-4所包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用間接ELISA的方法測(cè)定血清抗體效價(jià)，當(dāng)效價(jià)大于1∶10 000時(shí)，小鼠達(dá)到融合以制備單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)。在細(xì)胞融合前3 d，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，小鼠腹腔注射抗原，50 μg/只。

細(xì)胞融合，陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選參照文獻(xiàn)[10]。篩選時(shí)用重組蛋白 GST-chIL-4包被的酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行間接 ELISA，初次篩選后，間隔2 d進(jìn)行第2次篩選。選取2次篩選陽性值較高的孔按照有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，連續(xù)亞克隆 3次，選擇能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞作為建株細(xì)胞。

腹水的制備和純化采用常規(guī)方法[11]，挑選經(jīng)產(chǎn) BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟1 mL/只，7 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞2.0×106個(gè)/只，收集的腹水經(jīng)離心后收集上清。按照正辛酸飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，透析除鹽，分裝保存于–80 ℃。

1.5 chIL-4單克隆抗體的鑒定

1.5.1 單克隆抗體亞型的鑒定

按照 Sigma公司的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鑒定試劑盒說明書進(jìn)行單克隆抗體亞型的鑒定。1.5.2 單克隆抗體親和力的鑒定

利用間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體的親和力，以1 μg/mL重組蛋白GST-chIL-4包被酶標(biāo)反應(yīng)板，封閉后加入倍比稀釋的單克隆抗體，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，酶標(biāo)儀讀取OD450吸光值。當(dāng)連續(xù)幾個(gè)稀釋度的OD450讀數(shù)不再增大時(shí)視為抗原抗體100%結(jié)合，以抗體濃度 (mol/L) 為橫坐標(biāo)，OD450吸光值為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，生成對(duì)數(shù)趨勢(shì)線和公式。將OD450最大值的一半帶入公式，求出此時(shí)的抗體濃度即為單克隆抗體的親和力解離常數(shù) (Kd)[12]。

1.5.3 單克隆抗體特異性的鑒定

以原核表達(dá)的重組蛋白 His-chIL-4、His-chIL-2、His-chIL-10和His-chIFN-γ為抗原，分別以His-tag單克隆抗體和3株chIL-4單克隆抗體1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H為一抗，以HRP標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG為二抗進(jìn)行 Western blotting，檢測(cè)單克隆抗體的特異性。

1.5.4 間接免疫熒光鑒定單克隆抗體

將DF-1細(xì)胞接種于48孔板，4×104個(gè)細(xì)胞/孔，待細(xì)胞密度達(dá)到 60%左右時(shí)，按照 Vigofect的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染pRK5-flag-chIL-4和pRK5-flag質(zhì)粒，并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24 h后依次用4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透化，1% BSA封閉，然后以制備的單克隆抗體作為一抗，以FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，以鑒定單克隆抗體能否識(shí)別真核表達(dá)的chIL-4。

1.5.5 單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)的確定

成熟chIL-4含有112個(gè)氨基酸 (aa) 殘基，分別以N端第80位和第40位氨基酸為截點(diǎn)，構(gòu)建 chIL-4的截短表達(dá)載體 Δ1 (His-chIL-4 1–80 aa) 和Δ2 (His-chIL-4 40–112 aa)。在E. coliBL21中分別誘導(dǎo)截短蛋白表達(dá)后，以此為抗原，以單克隆抗體為一抗，通過Western blotting分析3株單克隆抗體的抗原識(shí)別區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化

所構(gòu)建的載體經(jīng)菌液PCR鑒定，所得結(jié)果與預(yù)期一致 (圖1A和1B)。構(gòu)建成功的載體在E. coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析及 Western blotting 鑒定，確定重組蛋白His-chIL-4和GST-chIL-4均以包涵體的形式表達(dá)(圖1C和1D)，通過稀釋復(fù)性的方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，獲得較好的純化效果 (圖1E和1F)。

2.2 chIL-4單克隆抗體的制備

圖1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白純化Fig. 1 Construction of prokaryotic expression vectors and purification of the recombinant proteins. (A) Identification of pET-28a-chIL-4 by PCR. (B) Identification of pGEX-6p-1-chIL-4 by PCR. (C) Western blotting analysis of His-chIL-4 protein. 1: uninduced His-chIL-4; 2: induced His-chIL-4; 3: induced pET-28a. (D) Western blotting analysis of GST-chIL-4 protein.1: uninduced GST-chIL-4; 2: induced GST-chIL-4; 3: induced pGEX-6p-1. (E) Purification of His-chIL-4 protein. M: protein marker; 1: induced pET-28a; 2: uninduced His-chIL-4; 3: supernatant of induced His-chIL-4; 4: precipitate of induced His-chIL-4; 5: purified His-chIL-4. (F) Purification of GST-chIL-4 protein. M: protein marker; 1: induced pGEX-6p-1; 2: uninduced GST-chIL-4; 3: supernatant of induced GST-chIL-4; 4: precipitate of induced GST-chIL-4; 5: purified GST-chIL-4.

小鼠經(jīng)3次免疫后，血清中chIL-4抗體效價(jià)達(dá)到1∶64 000。細(xì)胞融合后利用間接ELISA方法進(jìn)行篩選，將篩選到的陽性雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過 3次亞克隆后，得到 3株可穩(wěn)定分泌抗chIL-4蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H。將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔，收獲腹水后利用正辛酸飽和硫酸銨法純化，獲得純度較高的單克隆抗體 (圖2)。

2.3 chIL-4單克隆抗體的鑒定

2.3.1 單克隆抗體亞型的鑒定

根據(jù)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents試劑盒的檢測(cè)方法，確定 3株單克隆抗體的亞型均為IgG1。

2.3.2 單克隆抗體親和力的鑒定

利用間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體的親和力，結(jié)果表明1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H的親和力解離常數(shù) (Kd) 分別為 1.79×10–9、 1.61×10–9和2.36×10–9(圖3)。

2.3.3 單克隆抗體特異性的鑒定

圖2 單克隆抗體的純化Fig. 2 Purification of anti-chIL-4 McAbs. M: protein marker; lanes 1, 3, and 5: 1G11-3B, 2E5-3D, and 1G11-5H before purification, respectively; lanes 2, 4, and 6: 1G11-3B, 2E5-3D, and 1G11-5H after purification, respectively.

圖3 單克隆抗體親和力測(cè)定Fig. 3 Affinity test of anti-chIL-4 McAbs. (A–C) Affinity test of 1G11-3B, 2E5-3D, and 1G11-5H, respectively.

利用Western blotting鑒定單克隆抗體對(duì)原核表達(dá)的細(xì)胞因子的識(shí)別情況，結(jié)果表明3株單克隆抗體均能識(shí)別His-chIL-4，而不識(shí)別帶有His標(biāo)簽的其他細(xì)胞因子，表現(xiàn)出良好的特異性 (圖4)。

2.3.4 間接免疫熒光鑒定單克隆抗體

利用間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定單克隆抗體對(duì)真核細(xì)胞表達(dá)的chIL-4的識(shí)別情況，結(jié)果表明，3株單克隆抗體均能識(shí)別真核細(xì)胞表達(dá)的chIL-4。圖5是其中1株的鑒定結(jié)果，另外2株鑒定結(jié)果與此相同。

2.3.5 單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)的確定

以 chIL-4截短蛋白為抗原，單克隆抗體為一抗，利用Western blotting確定單克隆抗體的抗原識(shí)別區(qū)。結(jié)果表明，1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H的抗原識(shí)別區(qū)分別為chIL-4蛋白N端的第1–40 aa、80–112 aa和40–80 aa (圖6)。

圖4 單克隆抗體特異性鑒定Fig. 4 Identification of specificity of anti-chIL-4 McAbs by Western blotting.

圖5 間接免疫熒光鑒定單克隆抗體Fig. 5 Identification of anti-chIL-4 McAbs by indirect immunofluorescence assay. The scale bar represents 2 mm.

圖6 單克隆抗體抗原識(shí)別區(qū)分析Fig. 6 Mapping of the recognition regions of anti-chIL-4 McAbs. (A) Schematic of the genes encoding the full-length or truncated chIL-4 proteins. (B) Recognition regions analysis of anti-chIL-4 McAbs by Western blotting. (C) Schematic of the possible recognition regions of anti-chIL-4 McAbs.

3 討論

IL-4是Th2細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子，主要由CD4+T細(xì)胞分泌[13]。IL-4在免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用，不僅對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，還對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞也發(fā)揮著不同的作用[14-15]。

IL-4作為B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，能增強(qiáng)B細(xì)胞增殖活性，上調(diào)細(xì)胞表面分子，包括MHCⅡ類分子[16]、低親和力 IgE 受體 CD23[17]和IL-4R[18]。IL-4作為T細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，能誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和抗凋亡[19]。天然T細(xì)胞在抗原刺激后分化為Th2細(xì)胞的過程中需要IL-4，而這些Th2細(xì)胞又能分泌大量的IL-4和其他細(xì)胞因子，如IL-5和IL-13，由此激活正反饋回路，阻斷分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞的發(fā)育，由此穩(wěn)定Th2占主導(dǎo)地位的免疫反應(yīng)[20]。在一些感染性疾病模型中，IL-4對(duì)感染后免疫系統(tǒng)是Th1型還是Th2型免疫反應(yīng)起著決定性作用。IL-4這一重要性已經(jīng)在中和抗IL-4抗體[20]、sIL-4R[21]或者IL-4基因缺失小鼠[22]等許多小鼠模型中得到證實(shí)。此外，IL-4通過上調(diào)單核細(xì)胞MHCⅡ類分子的表達(dá)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗原遞呈作用，同時(shí)下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[23]。IL-4還參與炎癥反應(yīng)，影響血管粘附分子1 (VCAM-1)[24]或內(nèi)皮型選擇素[25]等內(nèi)皮粘附分子的表達(dá)，促進(jìn)趨化因子的產(chǎn)生，因而有利于嗜酸性粒細(xì)胞向感染部位的移行。

目前已有大量文獻(xiàn)研究了人、小鼠、大鼠和豬等哺乳動(dòng)物的 IL-4基因及其生物學(xué)活性，但關(guān)于家禽 Th2類細(xì)胞因子了解的較少[26-30]。本研究按照常規(guī)方法將chIL-4基因構(gòu)建在2個(gè)不同的原核表達(dá)載體上，進(jìn)而在大腸桿菌中表達(dá)帶有不同標(biāo)簽的重組蛋白，將它們分別作為免疫蛋白和篩選蛋白?？紤]到 chIL-4全長(zhǎng)基因編碼的蛋白包括 25個(gè)氨基酸大小的信號(hào)肽和112個(gè)氨基酸大小的成熟chIL-4，所以在設(shè)計(jì)引物時(shí)只將編碼成熟chIL-4的堿基序列克隆到原核表達(dá)載體上。在小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合之后，利用間接ELISA對(duì)陽性細(xì)胞株進(jìn)行篩選，然后利用有限稀釋法進(jìn)行 3次亞克隆，最終獲得3株能夠穩(wěn)定分泌抗chIL-4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過鑒定確定這 3株單克隆抗體均有良好的特異性和親和力。由于制備該單克隆抗體的最終目的是建立雙抗體夾心ELISA，因此要求所得到的單克隆抗體至少要有兩個(gè)不同的抗原識(shí)別區(qū)。在本研究中，為了初步確定單克隆抗體的抗原識(shí)別區(qū)，構(gòu)建了chIL-4的截短蛋白，然后利用Western blotting確定了3株單克隆抗體分別識(shí)別 chIL-4不同的抗原表位。另外，免疫小鼠所用是原核細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白，而原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白與真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白是有差異的，因此，本研究利用間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證了所制備的單抗隆抗體同樣能夠識(shí)別真核表達(dá)的 chIL-4。綜上所述，本研究所獲得的 3株抗 chIL-4單克隆抗體為制備chIL-4的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒提供了材料，也為深入研究chIL-4的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Generation and characterization of monoclonal antibodies against chicken interleukin 4

Xiaoyu Guan, Zhichao Xu, Yongqiang Wang, Xiaoqi Li, Hong Cao, and Shijun Zheng

State Key Laboratory of Agrobiotechnology, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China

To develop monoclonal antibodies (McAbs) against chicken interleukin 4 (chIL-4), we subcloned the mature chIL-4 gene into prokaryotic expression vectors pET-28a and pGEX-6P-1, then expressed and purified the recombinant proteins. We immunized BALB/c mice with the purified His-chIL-4 protein and fused the murine splenocytes with SP2/0 after 4 times of immunization. We used the GST-chIL-4 protein as a coating antigen to establish an indirect ELISA to screen positive clones. After screening and 3 rounds of cloning process, we obtained 3 hybridomas that stably secreted McAbs against chIL-4, and named 1G11-3B, 2E5-3D, and 1G11-5H. The isotypes of these McAbs were all IgG1 and the dissociation constant (Kd) of these McAbs were 1.79×10–9, 1.61×10–9, and 2.36×10–9, respectively. These McAbs specifically bound to chIL-4 expressed by either prokaryotic or eukaryotic system as determined by Western blotting and indirect immunofluorescence assay. The binding domains of chIL-4 recognized by 1G11-3B, 2E5-3D, and 1G11-5H were located between aa 1–40, 80–112, and 40–80, respectively, as determined by Western blotting. These McAbs would help to detect chIL-4 and to elucidate the biological roles of chIL-4 in immune responses.

chicken interleukin 4, prokaryotic expression, monoclonal antibody

s: Shijun Zheng. Tel/Fax: +86-10-62734861; E-mail: sjzheng@cau.edu.cn

10.13345/j.cjb.160221

Received: June 6, 2016; Accepted: August 15, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31272543, 31430085), Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (No. NYCYTX-41).

Yongqiang Wang. Tel: +86-10-62732842; E-mail: vetwyq@cau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31272543, 31430085)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金 (No. NYCYTX-41) 資助。

時(shí)間：2016-09-29

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160929.1048.002.html

關(guān)曉宇, 徐志超, 王永強(qiáng), 等. 抗雞白細(xì)胞介素4單克隆抗體的制備及鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(1): 44–54.

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