張鶴，李敬達(dá)，陳阿梅，劉慶平

1 遼寧省糖脂代謝研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116000

2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000

血漿糖蛋白β2-GPI分子結(jié)構(gòu)域與ox-LDL結(jié)合機(jī)制

張鶴1，李敬達(dá)1，陳阿梅2，劉慶平1

1 遼寧省糖脂代謝研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116000

2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000

通過(guò)酵母重組P.rβ2-GPI-DV (β2糖蛋白I第5結(jié)構(gòu)域) 蛋白的熒光、圓二色譜及分子對(duì)接模擬，分析血漿糖蛋白 β2-GPI-DV分子結(jié)構(gòu)域與 ox-LDL的結(jié)合機(jī)制。SDS-PAGE、Western blotting驗(yàn)證重組蛋白P.rβ2-GPI-DV表達(dá)正確性及純度；熒光、圓二色光譜、分子對(duì)接模擬解析重組蛋白與oxLDL、oxLDL配體oxLig-1可能存在的結(jié)合機(jī)制和位點(diǎn)。SDS-PAGE、Western blotting顯示，在12 kDa大小處有目的蛋白存在且與特異性抗體結(jié)合；熒光、圓二色譜的發(fā)色基團(tuán)、二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)及分子對(duì)接模擬結(jié)果揭示，P.rβ2-GPI-DV 的Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287和Leu313-Ala-Phe-Trp316區(qū)域組成的活性口袋與oxLig-1的ω-COOH羧基是實(shí)現(xiàn)二者結(jié)合的關(guān)鍵。以上結(jié)果表明，β2-GPI通過(guò)其第 5結(jié)構(gòu)域 (DV) 的賴(lài)氨酸陽(yáng)性區(qū)域與 ox-LDL的ω-COOH基團(tuán)識(shí)別結(jié)合，為血清中β2-GPI特異性結(jié)合ox-LDL的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

β2-糖蛋白Ⅰ，重組β2-GPI第五結(jié)構(gòu)域，氧化低密度脂蛋白，oxLig-1配體，結(jié)合機(jī)制

β2糖蛋白Ⅰ (β2-glycoproteinⅠ，β2-GPI) 是一種血漿中的單糖鏈蛋白，由 326個(gè)氨基酸殘基組成，包含4個(gè)短的重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (SCR) 和在C端的第5個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中第5結(jié)構(gòu)域由86個(gè)氨基酸殘基組成，4個(gè)反向平行的β折疊和2個(gè)短的 α螺旋形成一個(gè)中心，在該區(qū)末端形成一個(gè)約20個(gè)氨基酸殘基組成的疏水袢[1]。在功能上β2-GPI能與多種帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合，如磷脂(Phospholipids，PL)、心磷脂 (Cardiolipin，CL)、氧化低密度脂蛋白 (Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)、肝素、活化血小板的膜和凝血酶原等，在與陰性電荷物質(zhì)相互結(jié)合的過(guò)程中，其第5結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Hunt、蔡國(guó)平以及Haider等分別應(yīng)用基因突變手段，證實(shí)了第5功能域中發(fā)揮結(jié)合活性的片段，也證實(shí)了 DV 就是其與陰性離子如心磷脂(Cardiolinpin，CL) 結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域[2-4]。2011年，Kolyada等成功應(yīng)用原核體系表達(dá)并結(jié)晶了重組β2-GPI-DV蛋白，并提出284、286和287位的賴(lài)氨酸殘基是與肝素形成氫鍵結(jié)合的關(guān)鍵位置[5]。2014年，Li等用酵母重組表達(dá)β2-GPI第 5結(jié)構(gòu)域 (P.rβ2-GPI-DV)，研究發(fā)現(xiàn)其特異性結(jié)合系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE) 和抗磷脂綜合征 (APS) 患者血清 ox-LDL，進(jìn)一步顯示了β2-GPI第5結(jié)構(gòu)域DV特異性結(jié)合ox-LDL的結(jié)構(gòu)特征，但其結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)以及具體結(jié)合位點(diǎn)并未詳盡地研究分析[6]。2001年，Kobayashi等在劃分ox-LDL脂類(lèi)成分時(shí)，分離出一種能與β2-GPI結(jié)合的特異配體，分析其成分為7-酮基膽固醇-9-羧基壬酸酯 (7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，oxLig-1)，并證實(shí)了該配體在連接β2-GPI和ox-LDL的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用[7]。Huang等首次在國(guó)內(nèi)合成 oxLig-1，并揭示 oxLig-1作為 ox-LDL的表位結(jié)構(gòu)，在ox-LDL與血液中 β2-GPI形成復(fù)合物參與動(dòng)脈粥樣硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血栓進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[8]。

以往研究揭示，血液中高濃度的β2-GPI與ox-LDL的復(fù)合物嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康[9-11]。由于ox-LDL復(fù)合物的特性，國(guó)內(nèi)很少關(guān)于β2-GPI與ox-LDL結(jié)合機(jī)制分析的研究報(bào)道。因此，本文將應(yīng)用熒光光譜 (Fluorescence spectrum)、圓二色 (Circular dichroism) 及分子模擬 (Molecular docking) 對(duì)接技術(shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室酵母重組表達(dá)的 P.rβ2-GPI-DV蛋白和實(shí)驗(yàn)室自主合成的特異性配體oxLig-1對(duì)β2-GPI與ox-LDL的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行分析，為研究血液中β2-GPI/ox-LDL復(fù)合物的形成機(jī)制及以該復(fù)合物為靶點(diǎn)的研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P.rβ2-GPI-DV蛋白的 Pich酵母表達(dá)菌株X-33由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；Cu2+-ox-LDL由本實(shí)驗(yàn)室使用銅離子自行氧化獲得；LDL購(gòu)于北京協(xié)生生物科技有限公司；心磷脂 (CL) 購(gòu)于德國(guó) Sigma公司；氧化低密度脂蛋白的脂類(lèi)成分oxLig-1由本實(shí)驗(yàn)室化學(xué)合成獲得。重組蛋白的緩沖稀釋液PB (0.05 nmol/L，pH 7.4) 及溶解脂類(lèi)物質(zhì)的無(wú)水乙醇 (分子級(jí)別) 均購(gòu)于上海生工。分子模擬軟件AutoDock 4.2.6，圓二色光譜儀J-810為日本Jasco公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 P.rβ2-GPI-DV重組蛋白的表達(dá)純化

P.rβ2-GPI-DV的表達(dá)純化按照實(shí)驗(yàn)室前期建立的表達(dá)進(jìn)行[6]。取X-33酵母表達(dá)菌株接種于BMGY生長(zhǎng)培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)24 h；將過(guò)夜培養(yǎng)酵母菌以1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L BMGY中，30 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)24 h；將菌液1∶50的比例濃縮至200 mL的BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每天補(bǔ)加 1.5%甲醇誘導(dǎo)劑，30 ℃、220 r/min連續(xù)培養(yǎng)96 h。之后，4 ℃、6 000 r/min離心20 min，取菌液上清，經(jīng)鎳柱親和層析的方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。

1.2.2 SDS-PAGE和Western blotting

取15 μg純化后的蛋白，加適量的上樣緩沖液，沸水煮5 min，離心1 min。按照常規(guī)方法進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳，一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，一塊電轉(zhuǎn)于醋酸纖維素膜上進(jìn)行免疫雜交。加鼠抗的抗His抗體 (1∶1 000) 進(jìn)行孵育，洗膜后再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶3 000) 二抗孵育，最后加顯色液顯色，拍照。

1.2.3 熒光光譜檢測(cè)

熒光光譜檢測(cè)條件：狹縫寬度3 mm、5 mm，激發(fā)光波長(zhǎng)280 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)290–500 nm，掃描速度為500 nm/min；響應(yīng)時(shí)間2 s；檢測(cè)靈敏度為中等。將純化好的P.rβ2-GPI-DV蛋白溶劑換成0.2 mol/L的PBS緩沖溶液，蛋白濃度確定為1 mg/mL；取1.2 mL配制好的蛋白溶液置于1 cm的石英比色皿中，置于UV-Vis吸收光譜儀中測(cè)定；將比色皿中的溶液取出加入 10 μL的oxLig-1，37 ℃孵育30 min，再次置于UV-Vis吸收光譜儀中測(cè)定；在此基礎(chǔ)上在溶液中加入10 μL的心磷脂，37 ℃孵育30 min，置于UV-Vis吸收光譜儀中測(cè)定。

1.2.4 圓二色譜檢測(cè)

圓二色可以靈敏地反映出蛋白的構(gòu)象變化，已廣泛用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中。本文運(yùn)用圓二色譜對(duì)分子模擬軟件分析 P.rβ2-GPI-DV重組蛋白結(jié)構(gòu)及結(jié)合功能進(jìn)行驗(yàn)證，分析其結(jié)構(gòu)功能特征。

實(shí)驗(yàn)中的圓二色光譜檢測(cè)條件：狹縫寬度0.5 mm；掃描波長(zhǎng)范圍190–250 nm；掃描速度50 nm/min；響應(yīng)時(shí)間1 s，累計(jì)掃描3次。

將稀釋好的P.rβ2-GPI-DV重組蛋白 (900 μg/mL)加入 0.5 mm石英比色池中檢測(cè)，得到蛋白的CD光譜；向蛋白質(zhì)溶液中加入oxLig-1后37 ℃孵育30 min，再次測(cè)定；向比色皿中的溶液中繼續(xù)加入CL，37 ℃孵育30 min，再次測(cè)定；比較3次CD光譜的波譜變化。

改變加入oxLig-1與CL試劑的順序后，按照上述方法重新測(cè)定，比較結(jié)果變化。

1.2.5 ELISA檢測(cè)P.rβ2-GPI-DV與ox-LDL結(jié)合特性

將ox-LDL、LDL、oxLig-1、me-oxLig-1各2.5 μg包被于ELISA板，每個(gè)物質(zhì)設(shè)3個(gè)復(fù)孔；按照常規(guī)ELISA方法，封閉后加入P.rβ2-GPI-DV孵育1 h，以抗His抗體為一抗加入孵育1 h，洗板后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，OPD顯色，492 nm下觀察結(jié)果。

1.2.6 分子模擬分析β2-GPI-DV蛋白與ox-LDL結(jié)合機(jī)制

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) (Protein data bank) 中獲得含配體的 P.rβ2-GPI-DV 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)分別為3OP8)。首先將配體從復(fù)合物中剝離抽出，將受體導(dǎo)入到AUTODOCK 4.2.6軟件包中進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)修改，包括去除水分子、加入氫原子以及加入Gasteiger-Marsili電荷等。之后分別將 P.rβ2-GPI-DV 和 oxLig-1、me-oxLig-1分子保存為PDBQT格式 (包含原子類(lèi)型和電荷) 的文件，利用 AutoDock 4.2.6軟件包對(duì)受體β2-GPI-DV和oxLig-1、me-oxLig-1分子進(jìn)行半柔性對(duì)接。分子對(duì)接中P.rβ2-GPI-DV與oxLig-1、me-oxLig-1分子按1∶1比例結(jié)合。在進(jìn)行半柔性對(duì)接模擬前，使用AUTOGRID 計(jì)算網(wǎng)格，每一次對(duì)接所用的網(wǎng)格長(zhǎng)、寬和高均為100個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，網(wǎng)格包含oxLig-1分子可能作用的所有活性氨基酸殘基。模擬對(duì)接過(guò)程中β2-GPI-DV結(jié)構(gòu)視為剛性，oxLig-1、me-oxLig-1分子為柔性，oxLig-1、me-oxLig-1分子內(nèi)的旋轉(zhuǎn)鍵由AUTODOCK程序識(shí)別并可以在搜索過(guò)程中任意旋轉(zhuǎn)，分子對(duì)接在AutoDock軟件包中進(jìn)行，對(duì)接使用Lamarchian遺傳算法與局部能量搜索相結(jié)合 (GALS) 對(duì)β2-GPI-DV-oxLig-1、β2-GPI-DV-me-oxLig-1復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行搜索。每一次均進(jìn)行了 100次對(duì)接計(jì)算，最終的計(jì)算結(jié)果從軟件生成的輸出文件中抽提出來(lái)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.rβ2-GPI-DV重組蛋白的表達(dá)純化結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期建立的表達(dá)純化方法，成功表達(dá)純化了P.rβ2-GPI-DV重組蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，P.rβ2-GPI-DV在SDS-PAGE中的顯示位置與設(shè)計(jì)大小一致 (圖 1A)；Western blotting結(jié)果表明，P.rβ2-GPI-DV蛋白可被抗His抗體特異性地識(shí)別，在12 kDa大小處出現(xiàn)了特異性反應(yīng)條帶，經(jīng)鎳柱純化后純度達(dá) 90%以上(圖1B)。

2.2 熒光光譜結(jié)果

蛋白質(zhì)的熒光來(lái)源于蛋白質(zhì)色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸生色基團(tuán)，其熒光峰分別在348 nm、303 nm、282 nm處。P.rβ2-GPI-DV在280 nm處的紫外吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷引起的[13]。P.rβ2-GPI-DV蛋白質(zhì)的熒光光譜如圖2A所示，在310 nm處存在熒光峰，表明重組蛋白中存在生色氨基酸基團(tuán)；在加入 oxLig-1、CL等陰性物質(zhì)后，P.rβ2-GPI-DV 熒光峰位發(fā)生紅移且強(qiáng)度增加(圖2B、C)。這是因?yàn)樯彼岷屠野彼岬奈h(huán)境變得極性增強(qiáng)，π-π*躍遷能量減小，從而最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移，同時(shí)芳香族生色基團(tuán)處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，在蛋白質(zhì)變性的過(guò)程中芳香族氨基酸分子的側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露于水溶液中，所處環(huán)境的極性逐漸增加，熒光發(fā)射峰 λnm也逐漸增大。

圖1 重組P.rβ2-GPI-DV蛋白的表達(dá)純化Fig. 1 Expression and purification of the P.rβ2-GPI-DV.

2.3 圓二色譜結(jié)果分析

P.rβ2-GPI-DV重組蛋白的 CD光譜結(jié)果顯示 (圖3A)，在208 nm和222 nm處有2個(gè)負(fù)向峰，192 nm處有1個(gè)正向峰，這是一個(gè)典型的蛋白質(zhì)的 α螺旋的 CD譜特征，還有少量的 β折疊。根據(jù)楊氏方程fα=–([θ]208+4 000)/29 000計(jì)算得出 α螺旋占整個(gè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的 84%；在向P.rβ2-GPI-DV蛋白溶液中加入oxLig-1，再加入CL后，隨著蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，CD光譜的α螺旋、β折疊發(fā)生改變 (圖3B)；當(dāng)改變加入oxLig-1、CL的順序后，CD光譜中α螺旋、β折疊也發(fā)生類(lèi)似的改變 (圖3C)。

圖2 重組P.rβ2-GPI-DV蛋白熒光光譜Fig. 2 UV-Vis spectra of the P.rβ2-GPI-DV. (A) Fluorescence spectrum of P.rβ2-GPI-DV. (B) Black solid line: fluorescent spectrum of P.rβ2-GPI-DV. red dotted: fluorescence spectrum of P.rβ2-GPI-DV with oxlig-1. (C) Fluorescent spectrum of P.rβ2-GPI-DV. Red dotted, black line: fluorescence spectrum of P.rβ2-GPI-DV with oxlig-1; blue dotted line: fluorescence spectrum of P.rβ2-GPI-DV with oxLig-1 then CL adding.

圖3 重組P.rβ2-GPI-DV蛋白CD光譜Fig. 3 CD spectra of P.rβ2-GPI-DV. (A) CD spectrum of P.rβ2-GPI-DV. (B) Black lines: CD spectrum of P.rβ2-GPI-DV. red and blue dotted line: CD spectrum of P.rβ2-GPI-DV with oxLig-1 then CL adding. (C) Black lines: CD spectrum of P.rβ2-GPI-DV. Red and blue line: CD spectra of P.rβ2-GPI-DV with CL then oxLig-1 adding.

2.4 P.rβ2-GPI-DV蛋白與 ox-LDL結(jié)合的ELISA結(jié)果

圓二色譜顯示，P.rβ2-GPI-DV 蛋白可與ox-LDL的特異性表位oxLig-1結(jié)合，為了分析oxLig-1在P.rβ2-GPI-DV與ox-LDL結(jié)合中的作用，我們進(jìn)行了P.rβ2-GPI-DV蛋白的ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖 4所示，P.rβ2-GPI-DV蛋白與 ox-LDL、oxLig-1有明顯的特異結(jié)合活性，但不與甲基化后的 oxLig-1結(jié)合。這一結(jié)果說(shuō)明，oxLig-1參與介導(dǎo)了ox-LDL與P.rβ2-GPI-DV的結(jié)合，且其甲基化對(duì)結(jié)合有關(guān)鍵的影響作用。

2.5 分子模擬分析

圖4 oxLIg-1介導(dǎo)重組P.rβ2-GPI-DV蛋白與ox-LDL結(jié)合機(jī)制Fig. 4 OxLig-1 mediated the combining mechanism of P.rβ2-GPI-DV and ox-LDL. ***P<0.001.

β2-GPI-DV經(jīng)AUTODOCK對(duì)接后，oxLig-1進(jìn)入由 Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287區(qū)域及Leu313-Ala-Phe-Trp316區(qū)域組成的活性口袋 (圖5中紅色區(qū)域) 后，其ω-COOH能夠接近陽(yáng)性氨基酸殘基位點(diǎn)，與 284及 308位點(diǎn)中的賴(lài)氨酸形成氫鍵；另外，我們還發(fā)現(xiàn)其疏水核心母核中兩個(gè)-COOH中的氧原子能夠分別與283及284位Lys形成氫鍵。me-oxLig-1甲基化修飾的關(guān)系，其ω-COOH的活性被甲基所掩蓋，未能如oxLig-1一樣進(jìn)入由Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287區(qū)域及 Leu313-Ala-Phe-Trp316區(qū)域組成的活性口袋中，僅能結(jié)合于活性口袋的邊緣，未能與周邊氨基酸殘基形成氫鍵。結(jié)合能量顯示 (圖 6)，me-oxLig-1整體結(jié)合能量為–4.8 Kcal/mol，明顯大于oxLig-1的結(jié)合能量–5.41 Kcal/mol。因此，其羧基端在結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

圖5 β2-GPI-DV與oxLig-1結(jié)合示意圖Fig. 5 Schematic diagram of binding between β2-GPI-DV and oxLig-1.

圖6 重組P.rβ2-GPI-DV蛋白的分子對(duì)接Fig. 6 The docking of P.rβ2-GPI-DV with oxLig-1 and me-oxLig-1. (A) Docking conformation figure of P.rβ2-GPI-DV and oxLig-1. (B) Clustering results figure of P.rβ2-GPI-DV and the oxlig-1. (C) Docking conformation figure of P.rβ2-GPI-DV and me-oxLig-1. (D) Clustering results figure of P.rβ2-GPI-DV and me-oxLig-1.

3 討論

β2-GPI可與血液中的脂質(zhì)結(jié)合，參與脂類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此又稱(chēng)載脂蛋白 H (apoH)。β2-GPI是一種親磷脂糖蛋白，其作為aCL的輔因子，能通過(guò)與帶有負(fù)電荷的磷脂的結(jié)合，抑制依賴(lài)磷脂的凝血過(guò)程，故起抗凝作用，被認(rèn)為是人體內(nèi)的天然抗凝物[14]；另一方面，在ox-LDL的介導(dǎo)的情況下，anti-β2-GPI可以直接造成血管內(nèi)皮免疫損傷，還可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮或單核細(xì)胞表達(dá)促凝物質(zhì)促進(jìn)血栓形成[15-16]；β2-GPI的第 5結(jié)構(gòu)域還可通過(guò)結(jié)合外翻的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)清除凋亡細(xì)胞和體內(nèi)異物[17]。以往研究數(shù)據(jù)顯示，β2-GPI在與磷脂、肝素、細(xì)胞膜、凋亡細(xì)胞及ox-LDL結(jié)合時(shí)，第5結(jié)構(gòu)域發(fā)揮重要作用，但其具體部位部分學(xué)者認(rèn)為發(fā)生在Cys281-Cys288附近[18-19]，也有學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)eu313-Trp316起關(guān)鍵作用[20-21]。而這兩個(gè)區(qū)域都有一個(gè)共同的特征，那就是都因富含賴(lài)氨酸殘基而帶有大量正電荷，因此易于結(jié)合陰性磷脂。同時(shí)，在β2-GPI第5結(jié)構(gòu)域與陰性離子結(jié)合后，暴露出隱藏在第1、4結(jié)構(gòu)域的抗原決定簇，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生β2-GPI抗體，形成β2-GPI/anti-β2-GPI二元復(fù)合物；β2-GPI還可與 ox-LDL特異性結(jié)合形成 ox-LDL/β2-GPI/ anti-β2-GPI三元復(fù)合物。這兩種復(fù)合物可被巨噬細(xì)胞所吞噬，導(dǎo)致泡沫化繼而病變，從而參與動(dòng)脈硬化 (Arteriosclerosis，AS)、APS等一類(lèi)自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，β2-GPI第 5結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)β2-GPI蛋白與ox-LDL的結(jié)合作用，其 Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287Leu313-Ala-Phe-Trp316肽段由于含有大量堿性氨基酸殘基，因此在結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮了活性口袋的作用[22-24]。氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL) 作為伴有高動(dòng)脈粥樣硬化自身免疫性疾病的生物標(biāo)記物，一直都被認(rèn)為是此類(lèi)疾病的危險(xiǎn)信號(hào)，研究表明β2-GPI與ox-LDL組合并通過(guò)共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合體，但不與低密度脂蛋白 (LDL) 結(jié)合，通過(guò)自身 anti-β2-GPI識(shí)別該復(fù)合體然后再被巨噬細(xì)胞所吞噬，最終導(dǎo)致了細(xì)胞的泡沫化并發(fā)生病變。另一方面，本課題組在前期研究中成功分離得到了ox-LDL的表位結(jié)構(gòu)oxLig-1，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定后推測(cè)其可能為 ox-LDL的膽固醇氧化修飾衍生物，并證明了其在 β2-GPI與ox-LDL的結(jié)合過(guò)程中同樣發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8]。為了進(jìn)一步研究β2-GPI與ox-LDL的結(jié)合機(jī)制，確定二者結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，在本研究中，我們成功表達(dá)及純化得到了β2-GPI-DV蛋白[6]，并通過(guò)圓二色及分子對(duì)接模擬等實(shí)驗(yàn)手段，進(jìn)一步研究了二者在相互結(jié)合過(guò)程中的作用機(jī)制。

在圓二色譜實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在加入oxLig-1后，P.rβ2-GPI-DV 的熒光光譜譜峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，說(shuō)明oxLig-1與P.rβ2-GPI-DV發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出了大量的發(fā)色氨基酸；之后我們向體系中加入了CL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)譜峰沒(méi)有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移，但熒光強(qiáng)度增加，因此證明加入CL后DV蛋白結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生明顯改變，確認(rèn)二者結(jié)合DV蛋白上的同一位點(diǎn)，均位于 DV結(jié)構(gòu)中 Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287Leu313-Ala-Phe-Trp316肽段上的陽(yáng)性氨基酸上[25]。另一方面，通過(guò)oxLig-1的結(jié)構(gòu)分析可以發(fā)現(xiàn)其尾部的羧基端具有陰性電荷的性質(zhì)，因此我們推測(cè)，此羧基端為結(jié)合P.rβ2-GPI-DV 的關(guān)鍵位點(diǎn)。為了驗(yàn)證此推測(cè)，我們進(jìn)行了分子對(duì)接模擬實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在oxLig-1與P.rβ2-GPI-DV結(jié)合的過(guò)程中，oxLig-1的羧基端能夠與P.rβ2-GPI-DV的283、284、308位氨基酸殘基形成穩(wěn)定的氫鍵，鍵長(zhǎng)分別為3.2、2.6、2.4，而甲基化修飾后的oxLig-1由于其羧基端被封閉，則不能形成此氫鍵；在結(jié)合能量方面，oxLig-1表現(xiàn)為甲基化oxLig-1需要更少的結(jié)合能量 (oxLig-1結(jié)合能量為–5.41 Kcal/mol，me-oxLig-1整體結(jié)合能量為–4.8 Kcal/mol)。通過(guò)以上圓二色譜及分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，oxLig-1能夠定位于β2-GPI-DV結(jié)構(gòu)域Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287所形成陽(yáng)性電荷凹槽內(nèi)，其羧基端能夠與 283、284、308位賴(lài)氨酸殘基發(fā)生結(jié)合形成穩(wěn)定的氫鍵，在整個(gè)結(jié)合過(guò)程中起到錨定的作用。

綜上所述，本研究證明了β2-GPI的DV功能結(jié)構(gòu)域上的Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287及Leu313-Ala-Phe-Trp316能夠與ox-LDL表面膽固醇氧化衍生物 oxLig-1的羧基端發(fā)生結(jié)合并形成氫鍵，由此介導(dǎo)了β2-GPI與ox-LDL的結(jié)合。本研究為β2-GPI/ox-LDL復(fù)合物的形成、含量測(cè)定及以復(fù)合物為靶點(diǎn)的研究奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Binding of glycoprotein β2-GPI with oxidized low density lipoprotein

He Zhang1, Jingda Li1, Amei Chen2, and Qingping Liu1

1 Key Laboratory of the Glucolipid Metabolism, College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116000, Liaoning, China
2 Department of Histology and Embryology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010000, Inner Mongolia, China

We analyzed the binding of P.rβ2-GPI-DV with ox-LDL by fluorescence, molecular simulation and circular dichroism. We used SDS-PAGE and Western blotting to identify the purity of P.rβ2-GPI-DV, fluorescence, circular dichroism spectroscopy and molecular docking simulation to analyze the binding between P.rβ2-GPI-DV and oxLDL. P.rβ2-GPI-DV was specifically recognized by anti-His antibody at 12 kDa position. The chromophoric groups, the changes of secondary structure and the molecular docking simulations revealed that the active pocket formed by Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287 and Leu313-Ala-Phe-Trp316 of P.rβ2-GPI-DV and the -COOH carboxyl of oxLig-1 were the key for binding. P.rβ2-GPI combined with ox-LDL via the fifth functional domain and the -COOH group. Our findings provide theoretical basis to further study the binding between β2-GPI and ox-LDL in serum.

β2-glycoprotein I, recombinant fifth domain of β2-glycoprotein I, oxidized low density lipoprotein, 7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate ligand, binding mechanism

Qingping Liu. Tel: +86-411-88709369; E-mail:qingpingliu40@126.com國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81270361) 資助。張鶴, 李敬達(dá), 陳阿梅, 等. 血漿糖蛋白β2-GPI分子結(jié)構(gòu)域與ox-LDL結(jié)合機(jī)制. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(1): 122–131. Zhang H, Li JD, Chen AM, et al. Binding of glycoprotein β2-GPI with oxidized low density lipoprotein. Chin J Biotech, 2017, 33(1): 122–131.

10.13345/j.cjb.160178

Received: April 29, 2016; Accepted: November 21, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81270361).