肖紅俠，張喜霞，邵世峰，張立，張麗霞(天津醫(yī)科大學(xué)海河臨床學(xué)院，天津 300050)

·臨床實驗研究·

黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌抑菌作用的研究*

肖紅俠，張喜霞，邵世峰，張立，張麗霞
(天津醫(yī)科大學(xué)海河臨床學(xué)院，天津 300050)

目的 探索黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌的體外抑制作用。方法 采用改良羅氏藥敏絕對濃度法對107株結(jié)核分枝桿菌進行黃芩苷的體外抑菌試驗。結(jié)果 107株結(jié)核分枝桿菌的體外抑菌試驗結(jié)果表明，黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌有明確的抑制作用，最低抑菌濃度(MIC)值為0.75～12 mg/mL之間，MIC為12 mg/mL的菌株占8.41%，6 mg/mL的菌株占46.73%，3 mg/mL的菌株占37.38%，1.5 mg/mL的菌株占6.54%，0.75 mg/mL的菌株占0.93%，MIC50和MIC90均為6 mg/mL。結(jié)論 6 mg/mL黃芩苷具有較強的體外抗結(jié)核分枝桿菌作用。

黃芩苷； 結(jié)核分枝桿菌；最小抑菌濃度

黃芩具有抵抗病毒、細菌和真菌等微生物感染、保肝利膽等諸多療效[1]。黃芩苷是從黃芩中提取出來的一種黃酮類化合物，是黃芩發(fā)揮藥效的主要成分之一。 據(jù)文獻報道，黃芩苷對臨床上多種常見的病原菌具有一定的抑制作用,且呈劑量依賴性[2]。在20世紀(jì)60年代就有研究證實以黃芩為主要配方的芩部丹對于耐藥開放性及難治性肺結(jié)核有明顯療效[3]。我們試圖通過體外實驗來驗證黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌的抵抗作用。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 結(jié)核分枝桿菌試驗菌株：收集天津市海河醫(yī)院結(jié)核化驗室2012年5月至2014年3月間臨床分離結(jié)核分枝桿菌107株，包括經(jīng)羅氏培養(yǎng)絕對濃度法藥敏試驗檢測，利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素等4種一線抗結(jié)核藥均敏感的菌株53株，利福平(rifampicin, RFP)低耐菌株6株，異煙肼(isoniazid, INH)低耐菌株9株，乙胺丁醇(ethambutol，EMB)低耐菌株17株，多耐藥及耐多藥菌株22株。以上結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果的判讀均根據(jù)《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[3]中對結(jié)核分枝桿菌羅氏絕對濃度法藥敏試驗的方法學(xué)規(guī)程。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV(編號93009)購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 黃芩苷藥敏培養(yǎng)基制作 將黃芩苷(C21H18O11，純度90.5%，諸城市浩天藥業(yè)公司)藥粉用二甲基亞砜溶解后，用蒸餾水配制成96 mg/mL濃度的黃芩苷原液。分裝羅氏培養(yǎng)基基礎(chǔ)液后加入不同體積黃芩苷原液，配制終濃度分別為48、24、12、6、3、1.5、0.75、0.375、0 mg/mL共9個濃度的黃芩苷藥敏培養(yǎng)基，分裝為每支8 mL的單支培養(yǎng)基。使用培養(yǎng)基制備專用D-720型蒸汽凝固器(中國原子能研究所)85 ℃ 50 min凝固，冷卻后抽取部分(配制培養(yǎng)基總數(shù)的10%)培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫箱48 h進行無菌試驗，測試合格后的培養(yǎng)基放入密封袋置4 ℃冷藏備用。

1.3 最低抑菌濃度(MIC)測定 挑取羅氏初分離培養(yǎng)基上37 ℃恒溫箱培養(yǎng)3周左右的菌落，放入滅菌塑料瓶中加滅菌小玻璃珠震蕩研磨，加蒸餾水配制成1 mg/mL的菌懸液，吸取100 μL加蒸餾水配制成0.01 mg/mL的菌懸液，用加樣器吸取100 μL接種于藥敏培養(yǎng)基上，使之均勻鋪滿整個培養(yǎng)基斜面。每株菌株分別接種至本實驗所選9個不同濃度的黃芩苷藥敏培養(yǎng)基，每株菌每個濃度培養(yǎng)基平行接種2支，同時接種兩支空白對照管，空白對照管為不含任何藥物的結(jié)核分枝桿菌羅氏初分離培養(yǎng)基。接種后置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)4周，每周觀察2次，待對照管斜面的3/4長滿菌落(約4周)后，拿出判讀結(jié)果?？瞻讓φ展芫溟L滿培養(yǎng)基斜面的3/4認為結(jié)果有效，若空白對照管判讀為陰性，則需要重新實驗。以含藥培養(yǎng)基上無菌落生長的最低含藥濃度為此株結(jié)核分枝桿菌的最終MIC值。

2 結(jié)果

108株菌株培養(yǎng)4周后，空白對照管菌落生長情況均符合實驗要求，所有接種培養(yǎng)基均未出現(xiàn)污染、干結(jié)、破損等情況。黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV的MIC為3 mg/mL。107株結(jié)核分枝桿菌實驗菌株黃芩苷 MIC值在0.75～12 mg/mL之間，MIC為12 mg/mL的菌株占8.41%，6 mg/mL的菌株占46.73%，3 mg/mL的菌株占37.38%，1.5 mg/mL的菌株占6.54%，0.75 mg/mL的菌株占0.93%。根據(jù)實驗結(jié)果判定黃芩苷對結(jié)核分枝桿菌生長有較明顯的抑制作用，MIC50和MIC90均為6 mg/mL。

3 討論

張喜平等[2]報道黃芩苷對臨床常見病原菌(不包括結(jié)核分枝桿菌)的MIC范圍為0.1～50 mg/mL。Ge等[4]研究顯示，0.5 μg/mL黃芩苷對流感病毒A/FM1/1/47(H1N1)有弱的抑制作用，1 μg/mL和2 μg/mL時則明顯抑制流感病毒復(fù)制，呈劑量依賴性。Dou等[5]實驗表明，1.6 μg/mL黃芩苷可明顯抑制副流感病毒。Wang等[6]報道，100、50、10 mg/L的黃芩苷均可抑制白色念珠菌芽管形成及對口腔上皮及陰道表皮的黏附。本實驗中得到的黃芩苷體外抑制結(jié)核分枝桿菌的MIC結(jié)果與文獻報道的對臨床常見病原菌MIC結(jié)果相符，較部分病原微生物如流感、副流感病毒及白色念珠菌稍高。本實驗選取對現(xiàn)有抗結(jié)核藥物不同敏感度的菌株進行了該中藥的體外抑菌試驗，結(jié)果顯示黃芩苷對不同耐藥程度的分離株均具有較好的抑菌作用，表明黃芩苷在抗結(jié)核分枝桿菌中具有較好的應(yīng)用前景。據(jù)中國藥典所記述， 將干黃芩片3～9 g水煎成200～400 mL，一天內(nèi)分次頻服，用于熱病高熱煩渴，或肺熱咳嗽，或熱盛迫血外溢以及熱毒瘡瘍等。

黃芩苷不但有較強的抑菌作用，而且具備肝臟保護作用[7]，倘若將其與抗結(jié)核西藥聯(lián)合用于治療結(jié)核病，相信將會有很大希望取得一個顯著的肺結(jié)核治療效果。本實驗將會在后期進行黃芩苷與抗結(jié)核藥體外聯(lián)合抑菌試驗，為中西醫(yī)結(jié)合治療結(jié)核病開拓思路，并為進一步的臨床推廣打下基礎(chǔ)，提高黃芩苷用于治療結(jié)核病的可行性。

[1]Li C, Lin G, Zuo Z. Pharmacological effects and pharmacokinetics properties ofRadixScutellariaeand its bioactive flavones[J]. Biopharm Drug Dispos, 2011, 32(8):427-445.

[2]張喜平,周田美,董曉勤,等. 黃芩苷注射液體外抑菌作用實驗研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2006, 35(8):39-41.

[3]趙雁林,逄宇.結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[4]Xu G, Dou J, Zhang L,etal. Inhibitory effects of baicalein on the influenza virus in vivo is determined by baicalin in the serum[J]. Biol Pharm Bull, 2010, 33(2): 238-243.

[5]Dou J, Chen L, Xu G,etal. Effects of baicalein on Sendai virus in vivo are linked to serum baicalin and its inhibition of hemagglutinin-neuraminidase[J]. Arch Virol, 2011, 156(5):793-801.

[6]Wang C, Feng X, Zhang X,etal. Inhibitory effect of baicalin on germ tube formation and adhesion ofCandidaalbicans[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 2010, 35(23): 3216-3218.

[7]薛洪源,侯艷寧,劉會臣,等.黃芩苷對異煙肼和利福平肝損害小鼠的保護作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2003,19(6):414-417.

(本文編輯：劉群)

天津市衛(wèi)生局科技攻關(guān)課題(10KG217)。

肖紅俠，1980年生，女，主管技師，大學(xué)本科，從事生化檢驗工作。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.04.14

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2017-02-22)