劉瑛，周江堡

(攀枝花市婦幼保健院兒科，四川 攀枝花617000)

八肽膽囊收縮素對缺氧缺血性細胞損傷模型的干預(yù)作用

劉瑛，周江堡

(攀枝花市婦幼保健院兒科，四川 攀枝花617000)

目的 研究八肽膽囊收縮素(CCK-8)對缺氧缺血神經(jīng)細胞凋亡的干預(yù)作用，以及凋亡過程中對神經(jīng)生長因子(NGF)蛋白及NGF mRNA表達的影響。方法 體外培養(yǎng)新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞7d，作為空白對照組(A組)，用50μmol/L谷氨酸浸泡處理后建立缺氧缺血細胞損傷模型(B組/模型組)，將CCK-8分別以濃度1×10-6mol/L (C組)、1×10-7mol/L(D組)、1×10-8mol/L(E組)進行干預(yù)，作用后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h，采用原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測各組細胞凋亡率、免疫細胞化學(xué)檢測NGF蛋白表達，原位雜交技術(shù)檢測NGF mRNA表達。結(jié)果A組細胞有少量凋亡，凋亡率為(8.49±4.54)%，C組和D組細胞凋亡率分別為(3.87±5.64)%、(7.84±4.19)%，較B組的(17.53±6.93)%明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而E組凋亡率為(13.27±3.41)%，與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；A組未檢測出NGF蛋白表達(OD值0)，C組[OD值(0.343 2±0.006 81)]和D組[OD值(0.301 2±0.001 87)]較B組[OD值(0.2 83 7±0.007 69)]NGF蛋白表達明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，E組[OD值(0.275 2±0.003 73)]與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；A組有少量NGF mRNA表達[OD值(0.286 6±0.004 41)]，C組[OD值(0.347 4±0.010 04)]和D組[OD值(0.329 4±0.019 22)]較B組[OD值0.301 2±0.001 87)]NGF mRNA表達明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，E組[OD值(0.296 8±0.003 78)]與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論CCK-8能夠抑制缺氧缺血細胞模型凋亡，減輕神經(jīng)細胞損傷的程度，其神經(jīng)保護機制與促進NGF蛋白及NGF mRNA表達增加有關(guān)。

膽囊收縮素；細胞凋亡；干預(yù)

近年來，有許多國內(nèi)外研究表明，膽囊收縮素(CCK)是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護因子，具有神經(jīng)保護作用[1]。CCK的神經(jīng)保護機制目前尚不明確，學(xué)者們對此說法不一，其研究多數(shù)還在起步階段，目前無統(tǒng)一定論。本實驗通過外源性CCK-8干預(yù)體外培養(yǎng)的缺氧缺血性神經(jīng)細胞損傷模型，探究對神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)生長因子(NGF)表達的影響，探討CCK的神經(jīng)保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 本實驗所用新生SD大鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，主要試劑有：CCK-8(美國Sigma公司)、谷氨酸(上海生物工程有限公司)、DMEM/F12培養(yǎng)基(德國Biochrom公司)、NGF免疫組化試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，NGF原位雜交試劑盒及TUNEL試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.2 原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞 取新生＜24 h的SD大鼠大腦皮層組織，剪碎后放入DMEM/F12培養(yǎng)液中，胰酶反應(yīng)、過濾、離心后，取細胞組織加入含15%胎牛血清的培養(yǎng)液，然后充分吹打均勻成細胞懸液，在培養(yǎng)板中接種培養(yǎng)(密度：1×105細胞/mL)，再置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，孵育48 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天，10 μmol/L的阿糖胞苷加入培養(yǎng)液予以抑制非神經(jīng)細胞增殖，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.3 實驗分組 將細胞隨機分空白對照組(A組)、谷氨酸處理組(B組/模型組)、1×10-6mol/L的CCK-8處理組(C組)、1×10-7mol/L的CCK-8處理組(D組)和1×10-8mol/L的CCK-8處理組(E組)，每組6孔。

1.4 建立缺血缺氧損傷細胞模型 細胞培養(yǎng)7 d后將培養(yǎng)液吸出，細胞爬片用50 μmol/L谷氨酸+ D-Hanks液浸泡處理，30 min后用DMEM洗兩遍，再用1/2DMEM/F12(含15%胎牛血清)加入1/2原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h?？瞻讓φ战M的細胞爬片則用D-Hanks液(未加谷氨酸)浸泡處理30 min，其余步驟相同。

1.5 施加CCK-8藥物處理 實驗C、D、E組加入CCK-8，在加谷氨酸前1 h加入，分組加入1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L的不同濃度CCK-8的培養(yǎng)液，處理1 h后吸出細胞培養(yǎng)液，細胞爬片用DMEM/ F12洗兩遍，再用谷氨酸+D-Hanks液浸泡處理，30 min后取出細胞爬片，用D-Hanks液洗細胞2遍后，再加入含不同濃度CCK-8的原培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h。空白對照組和谷氨酸處理組不予CCK-8處理，僅以D-Hanks洗2遍，其余步驟相同。

1.6 檢測指標(biāo)及方法 各組細胞生長至第9天時用于檢測。

1.6.1 神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)觀察 各組細胞爬片均用0.01%吖啶橙染色，封片處理后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6.2 檢測NGF蛋白表達和NGF mRNA表達 采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測NGF蛋白表達，NGF mRNA表達則采用原位雜交技術(shù)，所有步驟均參照試劑盒說明書進行。

1.6.3 檢測神經(jīng)細胞凋亡 采用原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測細胞凋亡，所有步驟均參照試劑盒說明書進行。陽性細胞：藍紫色顆粒狀物著色于胞核內(nèi)(凋亡細胞)。陰性細胞：細胞核、胞漿不著色。隨機取10個高倍鏡視野計凋亡細胞數(shù)目，并計算各組細胞的凋亡百分率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 在熒光顯微鏡下，A組呈現(xiàn)的細胞形態(tài)基本正常，胞質(zhì)和胞核可見均勻的熒光染色，神經(jīng)細胞之間的網(wǎng)狀連接較為完整，B、E組見部分細胞變形，細胞核及核染色質(zhì)固定、縮小，可見細胞內(nèi)的凋亡小體；C、D組見大部分細胞形態(tài)維持較好，核、質(zhì)無明顯改變，凋亡細胞較少，見圖1。

2.2 細胞凋亡率檢測結(jié)果TUNEL檢測各組細胞凋亡率的結(jié)果見表1。數(shù)據(jù)表明，C組、D組有抑制凋亡的作用，且與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，作用越強，而E組則沒有作用。

2.3 NGF蛋白和mRNA表達檢測結(jié)果NGF蛋白和mRNA表達檢測結(jié)果顯示見表1。數(shù)據(jù)顯示，C組、D組NGF蛋白表達和NGF mRNA表達明顯增高，與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，表達越強。而E組與B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 熒光顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)觀察

表1 各組細胞NGF蛋白及mRNA表達及細胞凋亡率比較(±s)

表1 各組細胞NGF蛋白及mRNA表達及細胞凋亡率比較(±s)

注：與B組比較，aP＜0.05。

組別NGF蛋白(OD值)NGF mRNA(OD值)細胞凋亡率(% A組B組C組D組E組F值P值0 0.283 7±0.007 69 0.343 2±0.006 81a0.301 2±0.001 87a0.275 2±0.003 73 1 150.14＜0.05 0.286 6±0.004 41 0.301 2±0.001 87 0.347 4±0.010 04a0.329 4±0.019 22a0.296 8±0.003 78 58.64＜0.05 8.49±4.54 17.53±6.93 3.87±5.64a7.84±4.19a13.24±3.41 6.45＜0.05

3 討論

CCK是廣泛存在于人體的胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種腦腸肽。CCK的最小活性片段為CCK-8，是CCK在神經(jīng)系統(tǒng)的主要存在形式。綜合近年來多項研究結(jié)果，歸納CCK-8的神經(jīng)保護作用主要為：減輕缺氧性神經(jīng)細胞損傷[2]，抑制癲癇發(fā)作[3]，延緩神經(jīng)細胞老化[4]，提高認(rèn)知、空間、學(xué)習(xí)、記憶功能[5]，減輕局部腦缺血再灌注損傷[6]等等。

有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷引起谷氨酸過度蓄積，與不同類型受體作用，造成神經(jīng)元興奮性損傷甚至死亡[7]。本實驗采用谷氨酸處理的細胞模型來模擬缺氧缺血性細胞損傷，予CCK-8干預(yù)后，細胞形態(tài)接近正常神經(jīng)細胞，細胞凋亡率明顯下降，這證明CCK-8能夠抑制皮層神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)細胞的損傷程度，增強神經(jīng)細胞的保護修復(fù)功能，有拮抗谷氨酸的神經(jīng)興奮性毒性作用。同時，實驗給予外源性CCK-8干預(yù)后，NGF蛋白和mRNA表達明顯增加，且對CCK-8有濃度依賴性，這提示CCK-8可能通過刺激NGF表達增加而達到神經(jīng)保護的作用。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對CCK的神經(jīng)保護機制進行了一些深入的研究，以期在藥理上為腦損傷保護劑的研究提供一些新思路。有學(xué)者綜合研究結(jié)果說明，CCK與NGF在神經(jīng)系統(tǒng)的保護和修復(fù)方面有密切的相關(guān)性[8]。學(xué)者們公認(rèn)的是，NGF對腦的正常發(fā)育和功能維持起著重要作用[9]。已有許多研究發(fā)現(xiàn)，NGF對缺氧缺血性腦損傷有抑制損傷程度、促進損傷修復(fù)的作用，是人們較為熟知的神經(jīng)保護因子。由于NGF不能通過血腦屏障，需采用顱內(nèi)插管或輸注泵的方式腦內(nèi)給藥，此為創(chuàng)傷性操作且副反應(yīng)較大，因此采用CCK-8促進NGF合成和表達，從而達到神經(jīng)保護和修復(fù)的功效，這對缺血缺氧性腦損傷來說是一種新療法的嘗試。目前，CCK和NGF的藥理學(xué)研究都還在試驗階段，人們在細胞水平及器官水平、離體及在體方面對二者的相關(guān)性等進行了大量的臨床研究，人們對CCK神經(jīng)保護作用機制也會有更深入的研究，為CCK在今后的臨床治療和藥理應(yīng)用提供更多的理論和實驗依據(jù)。

綜上所述，CCK-8能夠抑制缺氧缺血細胞模型凋亡，減輕神經(jīng)細胞損傷的程度，其神經(jīng)保護機制與促進NGF蛋白及NGF mRNA表達增加有關(guān)。

[1]陳宣煌,胡荔斌,李榮議,等.膽囊收縮素與神經(jīng)損傷的修復(fù)[J].中國組織工程研究,2013(41):7323-7328.

[2]梁衛(wèi)蘭,熊暉,母得志,等.八肽膽囊收縮素對神經(jīng)細胞缺氧的作用[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,3(2):120-122.

[3]徐培,陶尚敏.海馬膽囊收縮素對大鼠癲癇發(fā)作的影響及其機制[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2000,38(1):75-78.

[4]陳興旺,孫曉江.膽囊收縮素與神經(jīng)細胞老化[J].中國老年學(xué)雜志, 2005,25(3):356-358.

[5]李明.外源性CCK-8對甲基苯丙胺誘導(dǎo)小鼠記憶及海馬神經(jīng)元損傷的影響[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2015.

[6]胡慶,張山起,楊艷梅.膽囊收縮素在高血壓性腦梗死病程中的作用機制[J].中國老年學(xué)雜志,2013,33(2):257-258.

[7]王平,呂士申,安麗,等.谷氨酸及其受體在缺氧缺血性腦損傷中的作用[J].中國兒童保健雜志,2012,20(1):52-54.

[8]陳宣煌,胡荔斌,李榮議,等.膽囊收縮素與神經(jīng)損傷的修復(fù)[J].中國組織工程研究,2013,17(41):7323-7328.

[9]付小兵.腦損傷后認(rèn)知障礙及神經(jīng)生長因子的腦保護作用[J].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(3):1-3.

Intervention effect of cholecystokinin-8 on hypoxic-ischemic cell damage model.

LIU Ying,ZHOU Jiang-bao. Department of Paediatrics,Panzhihua Maternal and Child Health-Care Hospital of Sichuan Province,Panzhihua 617000, Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the intervention effect of cholecystokinin-8(CCK-8)on hypoxic-ischemic cell damage model,and to explore its effect on expression of nerve growth factor(NGF)protein and NGF mRNA in the neurons during apoptosis.MethodsNeonatal rat cerebral cortical neurons cultured in vitro for 7 d were selected as the blank control group(group A).Hypoxic-ischemic cell damage models(group B)were established by 50 mol/L glutamic acid soaking.The models treated with 1×10-6mol/L,1×10-7mol/L,1×10-8mol/L were enrolled as group C,D,E, respectively,followed by continuous culture for 24 h.The apoptosis rate of the cells of five groups was detected by in situ end labeling technique,and the expression of NGF protein was detected by immunocytochemistry.The expression of NGF mRNA was detected by in situ hybridization technique.ResultsThe apoptosis rate of group A,group C and group D were respectively(8.49±4.54)%,(3.87±5.64)%and(7.84±4.19)%,which were significantly lower than(17.53± 6.93)%in group B(P＜0.05).The apoptosis rate of group E was(13.27±3.41)%,which showed no significant difference with(17.53±6.93)%in group B(P＞0.05).The expression of NGF protein was not detected in the group A(OD value:0). NGF protein expression was significantly increased in group C(OD value:0.343 2±0.006 81)and group D(OD value: 0.301 2±0.001 87)than that in group B(OD value:0.283 7±0.007 69),and the differences were statistically significant (P＜0.05).There were no significant differences between group E(OD value:0.275 2±0.003 73)and group B(P＞0.05). There was a small amount of NGF mRNA expression in the group A(OD value:0.286 6±0.004 41).NGF mRNA expression were significantly increased in group C(OD value:0.347 4±0.010 04)and group D(OD value:0.329 4±0.019 22) than group B(OD value:0.301 2±0.001 87),and the differences were statistically significant(P＜0.05).There were no significant differences in NGF mRNA expression between group E(OD value:0.296 8±0.003 78)and group B(P＞0.05). ConclusionCCK-8 can suppress apoptosis of hypoxic-ischemic cell damage model,which neuroprotective mechanism was related to the increased expression of NGF protein and NGF mRNA.

Cholecystokinin;Apoptosis;Intervention

R-332

A

1003—6350（2017）02—0180—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.003

2016-07-03)

周江堡。E-mail：zhoujb1115@yahoo.com.cn