付文娟　董桂蘭　孫芳初　王連立　郭靜

[摘要] 目的 探討伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（RECK）與基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性。 方法 選取唐山市人民醫(yī)院2001年1月～2010年12月臨床及病理資料完整存檔的人骨肉瘤組織標(biāo)本34例為觀察組，另取臨床及病理資料完整存檔的骨軟骨瘤組織標(biāo)本34例為對照組，采用免疫組織化學(xué)法檢測RECK和MMP-9，采用定量PCR法檢測RECK和MMP-9的mRNA，并分析指標(biāo)相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組RECK陽性率（58.8%）低于對照組（91.2%），而MMP-9陽性率（64.7%）高于對照組（11.8%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。RECK陽性率、RECK的mRNA表達(dá)、MMP-9陽性率、MMP-9的mRNA表達(dá)在年齡、性別、病發(fā)部位方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。RECK陽性率、RECK的mRNA表達(dá)、MMP-9陽性率、MMP-9的mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及生存時間方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。RECK與人骨肉瘤組織呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.561，P=0.000）。MMP-9與人骨肉瘤組織呈明顯正相關(guān)（r=0.613，P=0.000）。 結(jié)論 RECK可抑制MMP-9表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用，有望成為未來診斷以及治療人骨肉瘤的潛在靶標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶9；人骨肉瘤；相關(guān)性

[中圖分類號] R73-3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0016-05

Expression and correlation analysis of RECK and MMP-9 in human osteosarcoma tissues

FU Wenjuan1 DONG Guilan1 SUN Fangchu1 WANG Lianli1 GUO Jing2

1.The Fifth Department of Radiotherapy and Chemotherapy， People's Hospital of Tangshan City， Hebei Province， Tangshan 063000， China；2.Medical Experimental Research Center， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063000，China

[Abstract] Objective To explore the expression and correlation analysis of RECK and MMP-9 in human osteosarcoma tissues. Methods 34 cases of human osteosarcoma tissues which had complete clinical and pathological data were selected in Tangshan People's Hospital from January 2001 to December 2010 as observation group. 34 cases of osteochondroma tissues which had complete clinical and pathological data were selected as control group. Immunohistochemical method was used to detect RECK and MMP-9. Quantitative PCR method was used to detect mRNA of RECK and MMP-9. Correlation of indexes were analyzed. Results Positive rate of RECK in observation group （58.8%） was lower than that of control group （91.2%）， positive rate of MMP-9 in observation group （64.7%） was higher than that of control group （11.8%）， with statistical difference （P < 0.05）. As RECK positive rate， mRNA expression of RECK， MMP-9 positive rate， mRNA expression of MMP-9 compared in gender， age， disease location， differences were not statistically significant （P > 0.05）. As RECK positive rate， mRNA expression of RECK， MMP-9 positive rate， mRNA expression of MMP-9 compared in survival time， recurrence， metastasis， differences were statistically significant （P < 0.05）. RECK was negatively correlated with human osteosarcoma tissues （r=-0.561， P=0.000）. MMP-9 was positively correlated with human osteosarcoma tissues （r=0.613， P=0.000）. Conclusion RECK can inhibit the expression of MMP-9， and play a role in inhibiting cancer， which can be expected to potential target for future diagnosis and treatment in human osteosarcoma.

[Key words] RECK； MMP-9； Human osteosarcoma； Correlation

人骨肉瘤是青少年兒童時期最為常見的一種惡性腫瘤[1-2]，盡管隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷進(jìn)步，切除手術(shù)與輔助化療法能夠達(dá)到一定治療效果，但腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲對治愈率的影響不容忽視。據(jù)統(tǒng)計，患者5年內(nèi)無瘤存活率僅為65%[3]。因此，對于腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究不僅能夠提高對發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，同時有效利用阻礙腫瘤轉(zhuǎn)移屏障，對提高治療效果及預(yù)后有一定臨床意義。有研究顯示，伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白（RECK）具有干擾腫瘤基因表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用[4-5]。目前有關(guān)人骨肉瘤組織中RECK的表達(dá)與人骨肉瘤臨床病理特征及腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的報道較少。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）基因位于染色體20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13個外顯子和9個內(nèi)含子，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，其主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡。MMP-9在人骨肉瘤組織中發(fā)揮了何種作用，也是此次研究的關(guān)鍵性問題。因而開展此次研究，對人骨肉瘤組織中RECK和MMP-9進(jìn)行檢查，同時對RECK、MMP-9與人骨肉瘤臨床病理表現(xiàn)及轉(zhuǎn)移、侵襲的關(guān)系進(jìn)行探討。具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇唐山市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2001年1月～2010年12月臨床及病理資料完整存檔的人骨肉瘤組織標(biāo)本34例為觀察組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①肢體惡性人骨肉瘤；②首發(fā)患者；③接受根治性或廣泛性切除術(shù)；④接受輔助化療。所有腫瘤樣本的檢驗(yàn)均由我院病理科的兩位以上副高醫(yī)師進(jìn)行確診后進(jìn)行。男20例，女14例，年齡5～51歲，平均（21.6±4.6）歲。本研究所有程序均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

另取臨床及病理資料完整存檔的骨軟骨瘤組織標(biāo)本34例為對照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為骨軟骨瘤；②首發(fā)患者；③接受根治性切除術(shù)。所有腫瘤樣本的檢驗(yàn)均由我院病理科的兩位以上副高醫(yī)師進(jìn)行確診后進(jìn)行。男21例，女13例，年齡6～53歲，平均（21.8±5.3）歲。本研究所有程序均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)箱購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Thermo熱電FC酶標(biāo)儀購自北京伯輝生物科技有限公司；iChem-340全自動生化分析儀購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī)購自美國貝克曼庫爾特有限公司；AM5000實(shí)時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)購自上海吉泰生物科技有限公司。

SP染色試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗體購自通派（上海）生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺/DAB染色試劑盒購自南京化學(xué)試劑有限公司；多聚賴氨酸購自美國Sigma公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 采用標(biāo)準(zhǔn)方法制作人骨肉瘤組織石蠟切片[6]，即福爾馬林固定和石蠟包埋，具體如下：對切片進(jìn)行脫蠟水化，用pH=6的枸櫞酸鈉進(jìn)行修復(fù)2 min，用濃度為30 mL/L的雙氧水進(jìn)行常溫封閉10 min，目的是破壞過氧化物酶的生物活性。然后用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，加入濃度為50 mL/L的胚胎牛血清常溫封閉20 min，控制室溫為37℃，依次用一抗、二抗孵育2 h和30 min，每次孵育后都要進(jìn)行3次PBS緩沖液洗滌，用辣根過氧化酶標(biāo)記生物素染色，用二氨基聯(lián)苯胺液顯色，并用蘇木精復(fù)染，而后脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)要根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和顯色比例進(jìn)行判定，具體如下[7]：陽性細(xì)胞數(shù)目>80%計為4分，陽性細(xì)胞數(shù)目在51%～80%之間計為3分，陽性細(xì)胞數(shù)目在11%～50%之間計為2分，染色強(qiáng)計為3分，染色中等計為2分，染色弱計為1分。陽性細(xì)胞數(shù)目不足10%認(rèn)定為陰性（-）。評分3～5分為弱陽性（+），評分6～7分為強(qiáng)陽性（++）。采用相同方法制作骨軟骨瘤組織標(biāo)本，并行RECK檢查。同樣方法檢測MMP-9，于腫瘤侵襲邊緣和腫瘤內(nèi)染色相對密集區(qū)選取4個視野，陰性（-）：無明顯陽性細(xì)胞；弱陽性（+）：陽性細(xì)胞率<25%；陽性（++）：陽性細(xì)胞率為25%～75%；強(qiáng)陽性（+++）：陽性細(xì)胞率>75%。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測

提取人骨肉瘤組織總RNA時，可采用Trizol試劑，將提取出來的RNA置于20 μL反應(yīng)體系中，待其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用AM5000實(shí)時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行測定，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，每個樣本都要進(jìn)行3次重復(fù)測量，然后取平均值。設(shè)定條件如下：在95℃下設(shè)定反應(yīng)時間為5 s，在60℃下設(shè)定反應(yīng)時間為30 s，實(shí)施40個循環(huán)。循環(huán)閾值要以儀器熒光預(yù)設(shè)點(diǎn)為限[8]。同法檢測MMP-9。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者人骨肉瘤組織中RECK的表達(dá)情況

由于RECK存在于細(xì)胞質(zhì)，檢測結(jié)果中組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為棕黃色，且分布模式多為彌漫性分布，少見點(diǎn)狀或灶狀分布。見圖1（封三）。觀察組RECK陽性結(jié)果為20例，陽性率為58.8%；對照組RECK陽性結(jié)果為31例，陽性率為91.2%。兩組患者RECK陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.490，P=0.002）。

2.2 RECK與人骨肉瘤的臨床病理特征分析

RECK陽性率在年齡、性別、病發(fā)部位方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。RECK陽性率在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及生存時間方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 RECK的mRNA表達(dá)與人骨肉瘤組織的臨床病理特征分析

RECK的mRNA表達(dá)在年齡、性別、病發(fā)部位方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。RECK的mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及生存時間方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 兩組患者人骨肉瘤組織中MMP-9的表達(dá)情況

觀察組MMP-9陽性結(jié)果為22例，陽性率為64.7%；對照組MMP-9陽性結(jié)果為4例，陽性率為11.8%。兩組MMP-9陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.176，P=0.000）。兩組患者人骨肉瘤組織中MMP-9的表達(dá)情況見圖2（封三）。

2.5 MMP-9與人骨肉瘤的臨床病理特征分析

MMP-9陽性率在年齡、性別、病發(fā)部位方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。MMP-9陽性率在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及生存時間方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.6 MMP-9的mRNA表達(dá)與人骨肉瘤組織的臨床病理特征分析

MMP-9的mRNA表達(dá)在年齡、性別、病發(fā)部位方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。MMP-9的mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及生存時間方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

2.7 RECK、MMP-9與人骨肉瘤組織相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析，RECK與人骨肉瘤組織呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.561，P=0.000）；MMP-9與人骨肉瘤組織呈明顯正相關(guān)（r=0.613，P=0.000）。

3 討論

人骨肉瘤通常發(fā)病于患者間葉組織，進(jìn)而生成梭形的骨樣組織基質(zhì)細(xì)胞。該類腫瘤發(fā)病迅速、惡性程度、致殘率及死亡率極高，且預(yù)后較差[9-10]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中基質(zhì)金屬蛋白酶類家族發(fā)揮著重要作用，它不僅能夠?qū)δ[瘤組織的血管生成有一定促進(jìn)作用，同時在血小板-癌細(xì)胞聚集、癌旁組織血纖維蛋白的消化、癌細(xì)胞的黏附等方面均起調(diào)控作用[11]。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶對腫瘤組織基底膜細(xì)胞具有極強(qiáng)的降解作用，因此調(diào)節(jié)腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶水平對于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是目前臨床上有關(guān)腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[12]。

據(jù)報道，RECK定位于染色體9P12-P13上，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，由971個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)編碼形成，結(jié)構(gòu)中羧基端的糖蛋白I和氨基端的半胱氨酸重復(fù)構(gòu)造有助于促使該基因穩(wěn)定結(jié)合于細(xì)胞膜之上[13-14]。目前已知，RECK廣泛存在于人體皮膚、胃腸道、血管內(nèi)皮細(xì)胞等處，并參與了機(jī)體多種生理活動，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等。但RECK與人骨肉瘤的關(guān)系至今尚無明確解釋。有研究顯示，RECK可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌發(fā)揮抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的作用，且該基因通常在正常組織中表達(dá)較高，在腫瘤組織中表現(xiàn)為弱表達(dá)甚至失表達(dá)[15]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法、定量PCR法對不同臨床病理特征患者人骨肉瘤組織中RECK的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)觀察組RECK陽性率（58.8%）低于對照組（91.2%），而MMP-9陽性率（64.7%）高于對照組（11. 8%）。說明34例人骨肉瘤患者組織中RECK呈降低態(tài)勢，而MMP-9有升高態(tài)勢。比較不同臨床病理特征患者人骨肉瘤患者組織中RECK的陽性細(xì)胞率發(fā)現(xiàn)，年齡、性別以及發(fā)病部位不同的患者人骨肉瘤患者組織中RECK的陽性細(xì)胞率差異不顯著。而對患者進(jìn)行隨訪后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)以及60個月內(nèi)死亡的患者人骨肉瘤患者組織中RECK的陽性細(xì)胞率明顯低于未出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)、生存時間≥60個月的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明RECK基因表達(dá)的下調(diào)可能伴隨著腫瘤的生長，RECK的陽性細(xì)胞率低的患者更易出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。

定量PCR結(jié)果顯示，不同年齡、性別以及發(fā)病部位的患者，人骨肉瘤組織中mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。但腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及生存時間短的患者人骨肉瘤組織中mRNA的表達(dá)較低，不同類型患者人骨肉瘤組織中mRNA的表達(dá)差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。據(jù)報道，腫瘤組織中的RECK的表達(dá)水平與MMP-2表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)性，即RECK的高表達(dá)能夠有效抑制MMP-2的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用[16-17]。此外，有學(xué)者報道，RECK通過降低MMP-9和MT1-MMP酶活性發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移效果。轉(zhuǎn)染恢復(fù)RECK表達(dá)的HT1080細(xì)胞中，以上三種基因蛋白表達(dá)水平得到下調(diào)，腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中所需的蛋白水解酶含量下降，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展[18-19]。對比單純接種HT1080細(xì)胞及接種轉(zhuǎn)染RECK后的HT1080細(xì)胞的裸鼠發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的裸鼠組體內(nèi)腫瘤細(xì)胞死亡，且病理切片結(jié)果顯示，腫瘤組織的微血管密度降低，新生血管數(shù)量減少[20]。

綜上所述，RECK與人骨肉瘤的關(guān)系是非常密切的。RECK因子可能為一種抑癌因子，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，有望成為人骨肉瘤未來診斷以及治療的潛在靶標(biāo)。MMP-9也參與其中。但此次研究也存在一定弊端，樣本量較少，仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大再研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yu H，Wu Z，Cui Y，et al. Low-grade extraskeletal osteosarcoma of the mediastinum：report of a case and review of literature [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：3279-3281.

[2] 劉沛宜，張偉濱，王君，等.雷帕霉素對骨肉瘤干細(xì)胞和人骨肉瘤細(xì)胞中雷帕霉素靶蛋白傳導(dǎo)通路的抑制作用及意義[J].中華腫瘤雜志，2013，35（3）：175-180.

[3] Tabatabaei SH，Jahanshahi G，DehghanMarvasti F. Diagnostic challenges of low-grade central osteosarcoma of jaw：a literature review [J]. J Dent （Shiraz），2015，16（2）：62-67.

[4] Mahl C，Egea V，Megens RT，et al. RECK （reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs） regulates migration，differentiation and Wnt/β-catenin signaling in human mesenchymal stem cells [J]. Cell Mol Life Sci，2016， 73（7）：1489-1501.

[5] Trombetta-Lima M，Winnischofer SM，Demasi MA，et al. Isolation and characterization of novel RECK tumor suppressor gene splice variants [J]. Oncotarget，2015，6（32）：33120-33133.

[6] Liu W，Song N，Yao H，et al. miR-221 and miR-222 simultaneously target RECK and regulate growth and invasion of gastric cancer cells [J]. Med Sci Monit，2015，21（13）：2718-2725.

[7] Zhou DN，Deng YF，Li RH，et al. Concurrent alterations of RAGE，RECK，and MMP9 protein expression are relevant to Epstein-Barr virus infection，metastasis，and survival in nasopharyngeal carcinoma [J]. Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：3245-3254.

[8] Isakoff MS，Bielack SS，Meltzer P，et al. Osteosarcoma：current treatment and a collaborative pathway to success [J]. J Clin Oncol，2015，33（27）：3029-3035.

[9] ALQahtani D，AlSheddi M， Al-Sadhan R. Epithelioid Osteosarcoma of the maxilla：a case report and review of the literature [J]. Int J Surg Pathol，2015，23（6）：495-499.

[10] Yan GN，Lv YF，Guo QN. Advances in osteosarcoma stem cell research and opportunities for novel therapeutic targets [J]. Cancer Lett，2016，370（2）：268-274.

[11] Rosenberg GA. Matrix metalloproteinase-mediated neuroinflammation in vascular cognitive impairment of the binswanger type [J]. Cell Mol Neurobiol，2016，36（2）：195-202.

[12] Lanza NL，Valenzuela F，Perez VL，et al. The matrix metalloproteinase 9 point-of-care test in dry eye [J]. Ocul Surf，2016，14（2）：189-195.

[13] Clark JC，Thomas DM，Choong PF，et al. RECK-a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer [J]. Cancer Metastasis Rev，2007，26（3-4）：675-683.

[14] Noda M. Roles of an extracellular matrix regulator RECK in mouse development [J]. Tanpakushitsu Kakusan Koso，2008，53（4 Suppl）：324-330.

[15] Li Q，Wu Y，Zhang J，et al. MicroRNA-130a regulates cell malignancy by targeting RECK in chronic myeloid leukemia [J]. Am J Transl Res，2016，8（2）：955-967.

[16] Zhou Z，Wang Z，Wei H，et al. Promotion of tumour proliferation，migration and invasion by miR-92b in targeting RECK in osteosarcoma [J]. Clin Sci （Lond），2016，130（11）：921-930.

[17] Silva M，Hernandez ME，Rojas F，et al. MicroRNA miR-182 cluster mediated modulation of RECK without changes in cell surface membrane type-1 matrix metalloproteinase （MT1-MMP） [J]. Am J Cancer Res，2015，5（9）：2918-2928.

[18] Trombetta-Lima M，Winnischofer SM，Demasi MA，et al. Isolation and characterization of novel RECK tumor suppressor gene splice variants [J]. Oncotarget，2015，6（32）：33120-33133.

[19] Hong KJ，Hsu MC，Hung WC. RECK impedes DNA repair by inhibiting the erbB/JAB1/Rad51 signaling axis and enhances chemosensitivity of breast cancer cells [J]. Am J Cancer Res，2015，5（8）：2422-2430.

[20] Discacciati MG，Gimenes F，Pennacchi PC，et al. MMP-9/RECK imbalance：a mechanism associated with high-grade cervical lesions and genital infection by human papillomavirus and chlamydia trachomatis [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2015，24（10）：1539-1547.

（收稿日期：2016-08-06 本文編輯：王紅雙）