楊俊　曹勇　王東旭　潘迪　張營　鄭長青

[摘要] 目的 探討潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1（ERK-1）、人可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（sRAGE）的表達及意義。 方法 選取90只健康成年雄性BALB/c小鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表分為潰瘍性結(jié)腸炎組（n=30）、細菌性腸炎組（n=30）及對照組（n=30），潰瘍性結(jié)腸炎組給予飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）造模，細菌性腸炎組給予大腸埃希菌菌液灌腸造模，對照組不做處理。造模成功后處死小鼠，觀察各組小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸組織病理學評分（HPS）；取小鼠結(jié)腸標本，應用免疫組化法測定ERK-1、sRAGE表達。 結(jié)果 與對照組、細菌性腸炎組相比，潰瘍性結(jié)腸炎組小鼠DAI、HPS評分顯著升高（P < 0.05），而細菌性腸炎組DAI、HPS評分高于對照組（P < 0.05）。潰瘍性結(jié)腸炎組小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE陽性表達率均高于細菌性腸炎組及對照組（P < 0.05），而細菌性腸炎組小鼠結(jié)腸組織中ERK-1表達高于對照組（P < 0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE與DAI、HPS評分呈正相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE異常表達與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進展有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1；人可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；潰瘍性結(jié)腸炎

[中圖分類號] R574.62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0008-04

The expression of ERK-1， sRAGE in colon tissue of mice with ulcerative colitis

YANG Jun CAO Yong WANG Dongxu PAN Di ZHANG Ying ZHENG Changqing

The Second Department of Digestive Internal Medicine， Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 117004， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of extracellular signal-regulated kinase-1 （ERK-1）， human soluble advanced glycation end product receptor （sRAGE） in colon tissue of mice with ulcerative colitis. Methods 90 healthy adult male BALB/c mice were selected and divided into ulcerative colitis group （n=30）， bacterial enteritis group （n=30） and control group （n=30） according to random number table. The rats in the ulcerative colitis group were given dextran sulfate sodium sulfate （DSS）， and the bacterial enteritis group was given E. coli bacteria liquid enema modeling. The control group had no dispose. The mice disease activity index （DAI）， colonic histopathology score （HPS） of each groups after the modeling were observed. The levels of ERK-1， sRAGE expression in assay colon tissue were determined by immunohistochemistry. Results The DAI， HPS scores of the ulcerative colitis group were higher than those of the bacterial enteritis group and the control group （P < 0.05）， which of the bacterial enteritis group were higher than those of the control group （P < 0.05）. The levels of ERK-1， sRAGE expression in colonic tissues of the ulcerative colitis group were higher than those of the bacterial enteritis group and the control group （P < 0.05）， and ERK-1 expression in the colon tissue of bacterial enteritis group was higher than that of the control group （P < 0.05）. The Pearson analysis showed that the levels of ERK-1， sRAGE expression were positively correlated with DAI， HPS scores （P < 0.05）. Conclusion The abnormal expression of ERK-1 and sRAGE in colon tissue have a close relationship with the occurrence and progression of ulcerative colitis.

[Key words] Extracellular regulated protein kinase-1； Human soluble advanced glycation end product receptor； Ulcerative colitis

潰瘍性結(jié)腸炎是臨床上常見的胃腸疾病，目前發(fā)病機制尚不明確。已有研究表明，炎癥因子、遺傳背景、結(jié)腸內(nèi)微生態(tài)失衡及細胞內(nèi)信號傳導異常等因素均可能與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進展有密切的關(guān)系[1-2]。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1（ERK-1）屬于有絲分裂原激活蛋白激酶信號通路中關(guān)鍵信號蛋白，通過磷酸化發(fā)揮著開啟及閉合信號通路的作用，從而起調(diào)控細胞因子表達的作用[3]。有研究指出，ERK-1在潰瘍性結(jié)腸炎中存在明顯的磷酸化現(xiàn)象，可活化腫瘤細胞壞死因子及轉(zhuǎn)移細胞因子[4]。人可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（sRAGE）屬于跨膜蛋白，是由晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）脫落而成，可作為慢性浸潤性炎癥疾病的標志物[5]。當機體組織或外周血中sRAGE水平升高則提示機體處于炎癥浸潤狀態(tài)。本研究主要探討ERK-1、sRAGE在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的表達及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取90只健康成年雄性BALB/c小鼠，重量20～25 g，購于復旦大學上海醫(yī)學院動物實驗中心，合格證號：SCXK（滬）2014-0001。所有動物于復旦大學上海醫(yī)學院動物實驗中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，動物使用合格證號：SYXK（滬）2014-0008。根據(jù)隨機數(shù)字表分為潰瘍性結(jié)腸炎組（n=30）、細菌性腸炎組（n=30）及對照組（n=30），所有動物均行清潔級實驗室飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS）購于美國Sigma公司，大腸埃希菌菌株購于上海士鋒生物科技有限公司；兔抗鼠ERK-1一抗（艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠sRAGE一抗（上?？道噬锟萍加邢薰荆谎蚩雇枚梗暇┥d生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色劑（北京索萊寶科技有限公司）；多聚甲醛（南京新化原化學有限公司）；辣根過氧化酶[微蒙生物科技（上海）有限公司]。超聲波清洗儀（型號：SKE-5S，寧波科麥儀器有限公司）；微量加樣器（北京華儀三譜儀器有限責任公司）；電子分析天平（型號：BT125D，賽多利斯儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（型號UV2600，杭州康納科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立動物模型 潰瘍性結(jié)腸炎組：將5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶解于純凈水中，讓小鼠自行服用進行造模，當小鼠持續(xù)有輕重不等的腹瀉、間斷血便、腹痛及全身癥狀，持續(xù)數(shù)周，其間可有急性發(fā)作則為建模成功；細菌性腸炎組給予大腸埃希菌菌液灌腸造模，每天灌腸1次，每次200 mL，當小鼠出現(xiàn)大量水樣便，無膿血，無腹痛，伴有嘔吐，容易發(fā)生脫水、出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂及酸中毒癥狀時則為造模成功；對照組不做處理。造模后各組小鼠持續(xù)觀察12 d，第12天后處死，取出結(jié)腸組織用于相關(guān)指標檢測。

1.3.2 癥狀體征觀察及評分 建模過程中，觀察各組小鼠便血、大便性狀、體重變化，并參照Cooper經(jīng)典評分系統(tǒng)[6]，將小鼠每天便血、大便性狀、隱血及體重下降等評分相加，作為疾病活動指數(shù)（DAI）。

1.3.3 組織病理學炎癥損傷評分 在距肛門2、6、10 cm處選取3段長約1 cm的小鼠結(jié)腸組織，石蠟包埋切片，行HE染色，采用盲法閱片，光鏡下觀察腸黏膜損傷情況，并根據(jù)Cooper經(jīng)典組織學損傷評分法進行結(jié)腸組織病理學評分（HPS）。

1.3.4 結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE表達測定 造模成功后12 d隨機從各組中選取10只小鼠，應用免疫組化法測定小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE表達水平。各組小鼠處死前24 h于腹腔內(nèi)注射Brd U，共注射3次，每6小時注射1次，注射完畢12 h后應用1.5%～2.5%異氟烷吸入麻醉，然后應用脊椎脫臼法處死小鼠，取出結(jié)腸組織，應用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，行冠狀位切片，切片后常溫脫蠟加入3%甲醇溶液，常溫下山羊血清封閉20 min，兔抗鼠ERK-1一抗、兔抗鼠sRAGE一抗，置濕盒4℃過夜，生物素標記二抗，室溫下靜置10 min，加入辣根過氧化酶，室溫下靜止10 min，滴入DAB顯色劑，室溫顯色5～10 min，中性樹脂封片。ERK-1陽性反應為細胞漿呈黃色顆粒或深黃色顆粒；sRAGE陽性反應為細胞核呈棕黃色或深黃色染色。染色深度評分：0分為無顯色或顯色不清，1分為淺黃色，2分為深黃色，3分為褐黃色。染色面積：0分為0%～5%，1分為>5%～35%，2分為 >35%～65%；3分為>65%。染色深度與面積之積達1～3分為“+”，4～6分為“++”，7～9分為“+++”。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠造模后表現(xiàn)

結(jié)腸性潰瘍組小鼠成功建模后第1天，大便次數(shù)增多，出現(xiàn)黏液稀便；建模后第3天小鼠大便完全為稀便，部分出現(xiàn)為肉眼血便；造模1周后體重減輕，可見膿性血便，飲食明顯減少，毛發(fā)無光澤，少食賴動。細菌性腸炎組建模后第1天，大便次數(shù)增加，為軟便；建模第3天后大量水樣便，無膿血，小鼠出現(xiàn)脫水癥狀。對照組小鼠無明顯變化。

2.2 各組小鼠DAI、HPS評分比較

與對照組、細菌性腸炎組相比，潰瘍性結(jié)腸炎組小鼠DAI、HPS評分顯著升高（P < 0.05），細菌性腸炎組DAI、HPS評分顯著高于對照組（P < 0.05）。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE陽性表達情況

潰瘍性結(jié)腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE陽性表達率均顯著高于細菌性腸炎組及對照組（P < 0.05），而細菌性腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1表達顯著高于對照組（P < 0.05）。見表2、圖2。

2.4 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE表達與DAI、HPS評分的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析顯示，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ERK-1陽性表達與DAI、HPS評分呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.332、0.328，P < 0.05）；sRAGE陽性表達與DAI、HPS評分呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.356、0.372，P < 0.05）。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種累及直腸及結(jié)腸黏膜組織的慢性炎癥浸潤性疾病，目前對于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制尚不明確，但普遍認為與環(huán)境因素、易感基因、免疫系統(tǒng)及炎癥因子表達異常等因素有關(guān)[7-8]。腸黏膜免疫系統(tǒng)中相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子、細胞因子可參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進展[9]。ERK-1是一類廣泛分布在細胞內(nèi)的蛋白激酶，是連接決定性基因表達與細胞膜表面受體間的重要信號調(diào)節(jié)酶，ERK-1信號通路在促進結(jié)腸黏膜上皮細胞增生、分化及抑制上皮細胞凋亡中起到重要的生理作用[10-12]。本研究中潰瘍性結(jié)腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1陽性表達率均高于細菌性腸炎組及對照組（P < 0.05），提示ERK-1異常表達與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生有密切關(guān)系，而細菌性腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1表達高于對照組（P < 0.05），這可能與ERK-1可活化及調(diào)控相關(guān)炎癥因子從而參與腸炎的發(fā)生有關(guān)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)腸組織中ERK-1陽性表達與DAI、HPS評分呈正相關(guān)（r=0.332、0.328，P < 0.05），提示在潰瘍性結(jié)腸炎中ERK-1表達水平與腸黏膜炎癥損傷及臨床癥狀有密切的關(guān)系?？紤]可能機制為細胞有絲分裂刺激因子可激活ERK-1途徑主要細胞外信號，被激活的ERK可通過直接、間接或核轉(zhuǎn)位等方式作用于激活劑蛋白1及核因子，從而控制及調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥細胞因子表達[13-14]。

sRAGE屬于內(nèi)源性非酶類多配體受體，在腎系膜細胞、單核巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞中廣泛表達，它可促進多種炎癥分子結(jié)合，并介導機體多種信號轉(zhuǎn)導[16]。sRAGE在機體中主要作用是促進炎癥發(fā)生、促進細胞因子生長、增殖及活化各種細胞因子[17]。Wang等[18]研究指出，炎癥性腸炎患者結(jié)腸組織中sRAGE表達水平顯著升高，其認為sRAGE在潰瘍性腸炎持續(xù)損傷過程中起到重要的促進作用。本研究中潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中sRAGE陽性表達率高于細菌性腸炎及對照組，而細菌性腸炎小鼠結(jié)腸組織sRAGE陽性表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），提示sRAGE可能通過某種途徑參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及進展過程，同時也體現(xiàn)了sRAGE在潰瘍性結(jié)腸炎中的獨特致病機制，可以認為sRAGE只參加潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程，而與普通腸炎的發(fā)生關(guān)系不大[19]。Meijer等[20]指出，sRAGE可激活多種炎癥介質(zhì)表達，并誘導機體過氧化反應，從而促進炎癥因子釋放，介導炎性反應。本研究結(jié)腸組織中sRAGE陽性表達與DAI、HPS評分呈正相關(guān)（r=0.356、0.372，P < 0.05），進一步提示sRAGE表達異?？梢杂绊憹冃越Y(jié)腸炎炎癥因子釋放，并介導腸黏膜潰瘍性損傷。

綜上所述，結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE異常表達與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進展有密切關(guān)系。

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（收稿日期：2016-08-20 本文編輯：程 銘）