李懿皞，吳炯，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

·專家論壇·

腫瘤細(xì)胞“溫伯格效應(yīng)”及其相關(guān)檢測(cè)的研究進(jìn)展*

李懿皞，吳炯，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

自從Otto Warburg于1920年觀察到腫瘤細(xì)胞傾向于糖酵解的代謝改變現(xiàn)象以來(lái)，腫瘤的代謝重組一直是人們研究的熱點(diǎn)。2011年，腫瘤細(xì)胞的代謝重組(即“溫伯格效應(yīng)”)被認(rèn)為是腫瘤十大特征之一，相關(guān)檢測(cè)技術(shù)和理論也在不斷發(fā)展。該文歸納腫瘤細(xì)胞的“溫伯格效應(yīng)”及其相關(guān)的檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，旨在為今后該領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。

腫瘤；溫伯格效應(yīng)；檢測(cè)技術(shù)；研究進(jìn)展

2000年，美國(guó)學(xué)者Hanahan和Weinberg總結(jié)并提出了惡性腫瘤的6大特點(diǎn)：對(duì)凋亡機(jī)制的逃避、生長(zhǎng)抑制基因的回避、組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、持續(xù)的生長(zhǎng)信號(hào)、無(wú)限增殖的潛能和長(zhǎng)久誘導(dǎo)血管生成[1]；2011年，兩位學(xué)者在之前的基礎(chǔ)上又總結(jié)了惡性腫瘤存在的新的4個(gè)特點(diǎn)，即逃避免疫破壞、促腫瘤炎癥、基因組的不穩(wěn)定和突變以及能量代謝的重組[2]。這些腫瘤特征的發(fā)現(xiàn)和歸納近年來(lái)也受到了學(xué)界的普遍承認(rèn)和接納，針對(duì)腫瘤特征的研究和相關(guān)的治療也廣泛開(kāi)展。本文擬對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的溫伯格效應(yīng)的研究進(jìn)展和檢測(cè)方法進(jìn)行歸納和總結(jié)，旨在為今后相關(guān)研究的開(kāi)展提供理論依據(jù)。

1 溫伯格效應(yīng)

腫瘤疾病的本質(zhì)是一種細(xì)胞增殖的失控，而腫瘤細(xì)胞也會(huì)調(diào)節(jié)自身的代謝以適應(yīng)快速增殖分化的需要。正常細(xì)胞在有氧條件下，葡萄糖首先在胞漿中經(jīng)過(guò)糖酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，隨后通過(guò)線粒體的氧化磷酸化產(chǎn)生CO2和大量的ATP；而在無(wú)氧條件下則更多地會(huì)發(fā)生糖酵解過(guò)程，只有少量的丙酮酸會(huì)在線粒體中發(fā)生氧化磷酸化的過(guò)程。20世紀(jì)20年代，Otto Warburg發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞能量代謝的特異性改變：即便在有氧的條件下，腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝情況也會(huì)更加傾向于糖酵解，從而發(fā)生“有氧糖酵解”現(xiàn)象，即現(xiàn)在所說(shuō)的“溫伯格效應(yīng)”(Warburg-effect)[3]。

從腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要大量的ATP這一角度來(lái)看，傾向于發(fā)生有氧糖酵解這種相比線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能效率低18倍的代謝方式看似有違常理；但從另一個(gè)角度來(lái)說(shuō)，這種“需氧糖酵解”現(xiàn)象產(chǎn)生的同時(shí)，我們也能看到腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取量的提升，這種提升可以滿足腫瘤細(xì)胞生物合成對(duì)碳源的需求。有學(xué)者指出，這種大量增加葡萄糖攝取進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的情況部分是通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT-1)的表達(dá)產(chǎn)生的[4]。后續(xù)的研究證實(shí)，某些癌基因(如ras、myc基因等)的激活或抑癌基因(如TP53等)的失活[5]，均與這種“有氧糖酵解”的腫瘤代謝重組產(chǎn)生相關(guān)。以上基因的激活或失活賦予腫瘤細(xì)胞增殖能力提升、逃避生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)。此外，由于腫瘤組織的內(nèi)部常存在缺氧環(huán)境，這種對(duì)于糖酵解的依賴作用往往還會(huì)增加。例如，腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧條件的反饋調(diào)節(jié)作用可上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平[6]。這些蛋白質(zhì)和酶表達(dá)情況的改變也為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)的檢測(cè)提供了理論的依據(jù)。而ras等的癌基因和細(xì)胞所處的缺氧環(huán)境也會(huì)提高缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和HIF-2α的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)上調(diào)腫瘤細(xì)胞糖酵解的水平[7]。

雖然腫瘤細(xì)胞的“需氧糖酵解”過(guò)程產(chǎn)生ATP的量遠(yuǎn)不如通過(guò)線粒體氧化磷酸化的過(guò)程，但有學(xué)者提出了一個(gè)設(shè)想：糖酵解水平的提升使得葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物能更多地進(jìn)入到其他生物合成通路中，生成大量的核苷酸和氨基酸，促進(jìn)新細(xì)胞合成所需的生物大分子及細(xì)胞器的合成[8]，同時(shí)還能規(guī)避氧化磷酸化產(chǎn)生的活性氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。此外，分化期的胚性細(xì)胞中觀察到的類似“溫伯格效應(yīng)”的代謝過(guò)程也暗示了大規(guī)模的生物合成對(duì)于細(xì)胞增殖的必要性。

在某些腫瘤細(xì)胞中常存在處于不同能量代謝狀態(tài)的細(xì)胞亞群。一種是由葡萄糖依賴性的(即“溫

伯格效應(yīng)”型)細(xì)胞，它們可攝取葡萄糖發(fā)生糖酵解反應(yīng)，釋放出乳酸作為代謝產(chǎn)物；另一群細(xì)胞則會(huì)攝取其周圍細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行部分的三羧酸循環(huán)來(lái)產(chǎn)生能量[9]。這兩群細(xì)胞在功能上相互依賴共生：缺氧的細(xì)胞利用葡萄糖產(chǎn)能，代謝產(chǎn)物為乳酸；另一群富氧的細(xì)胞則利用這些乳酸來(lái)更好地產(chǎn)生能量。盡管這種共生關(guān)系在腫瘤組織內(nèi)的普遍性尚有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)，但這種對(duì)于乳酸釋放和利用的生理現(xiàn)象在肌肉組織中普遍存在。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織糖酵解產(chǎn)生的乳酸會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而影響腫瘤組織周圍免疫細(xì)胞的作用，達(dá)到免疫逃逸的目的[10]。

2 溫伯格效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制

腫瘤細(xì)胞代謝重組的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。有學(xué)者提出腫瘤的溫伯格效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制可能與糖酵解代謝酶的表達(dá)異常、腫瘤細(xì)胞線粒體功能受損、抑癌基因失活和原癌基因的激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路紊亂及腫瘤細(xì)胞微環(huán)境改變等有關(guān)[11]。另有學(xué)者提出，腫瘤的產(chǎn)生有氧糖酵解現(xiàn)象的原因可能有3點(diǎn)：其一，相較于腫瘤細(xì)胞供能，其代謝的優(yōu)先級(jí)向增加細(xì)胞分子數(shù)量的方向轉(zhuǎn)換；其二，可能是腫瘤細(xì)胞通過(guò)減少線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的活性氧來(lái)規(guī)避細(xì)胞凋亡的一種方式；其三，可能是其為了腫瘤中處于有氧環(huán)境部分的腫瘤細(xì)胞能更快更好地產(chǎn)生ATP，處于無(wú)氧或微含氧環(huán)境下的部分腫瘤細(xì)胞則轉(zhuǎn)而通過(guò)糖酵解的方式來(lái)產(chǎn)生足夠的乳酸來(lái)供其消耗[12]，這一點(diǎn)最好的證據(jù)是有學(xué)者觀察到了腫瘤組織中分別存在著“溫伯格效應(yīng)”型細(xì)胞“非溫伯格效應(yīng)”型細(xì)胞的存在[13]。

2.1線粒體功能缺陷 腫瘤細(xì)胞的線粒體往往較小，還常常伴有線粒體嵴的缺失、ATP合成酶b-F1亞基的缺少等現(xiàn)象，學(xué)者們也常常用線粒體的功能缺陷來(lái)解釋“溫伯格效應(yīng)”的發(fā)生。隨著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，線粒體DNA(mtDNA)發(fā)生突變的可能性也會(huì)隨之上升，與此同時(shí)，有些mtDNA的突變同樣也會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[14]。研究顯示，mtDNA的突變和許多腫瘤(如甲狀腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等)均存在著相關(guān)性，mtDNA的突變?cè)谄渚幋a區(qū)及非編碼區(qū)能被檢測(cè)到[15]。由于mtDNA的突變存在著閾值效應(yīng)，往往需要一個(gè)細(xì)胞中的突變量達(dá)到60%以上時(shí)才會(huì)對(duì)其線粒體功能產(chǎn)生影響，因此，也有學(xué)者認(rèn)為，mtDNA的突變僅僅是腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞分化的結(jié)果[16]。

2.2缺氧誘導(dǎo)因子(HIF) “溫伯格效應(yīng)”的一個(gè)主要分子機(jī)制在于HIF的活化。HIF是一種通常由于缺氧應(yīng)激而被激活的轉(zhuǎn)錄因子，但它也會(huì)因?yàn)榘┗?、炎癥、代謝和氧化應(yīng)激而激活。HIF-1是一種由基礎(chǔ)穩(wěn)定的β亞基和不穩(wěn)定的α亞基組成的異源二聚體，但這類轉(zhuǎn)錄因子在正常氧含量的條件下會(huì)由于氧氣依賴的脯氨酰羥化酶和泛素連接酶的連續(xù)反應(yīng)而降解。HIF-1能通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUT-1)、己糖激酶(HK，包括HK-I和HK-Ⅱ)、乳酸脫氫酶A(LDH-A)以及乳酸排出酶單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體4(MCT4)來(lái)促進(jìn)葡萄糖向丙酮酸和乳酸的轉(zhuǎn)化作用[17]，通過(guò)丙酮酸脫氫酶(PDH)途徑，HIF能減少丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，從而降低氧化磷酸化反應(yīng)的進(jìn)程；此外，HIF-2可以通過(guò)c-Myc降低腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性[18]。

另一方面，許多學(xué)者認(rèn)為HIF-1α的表達(dá)能使腫瘤細(xì)胞糖酵解通路的相關(guān)酶、蛋白質(zhì)、mRNA的表達(dá)水平存在異常，如磷酸果糖激酶(PFK)[19]、HK-Ⅱ、PKM2、LDH-A、GLUT-1[20-21]等。而這種改變常常和相關(guān)代謝酶/蛋白質(zhì)的一種亞型有關(guān)，最典型的改變是丙酮酸激酶M2型(PKM2)。PKM2是一種表達(dá)于胚胎干細(xì)胞等類型干細(xì)胞中的一種表型，其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量多升高，而這也伴隨著正常細(xì)胞中的PKM1亞型表達(dá)量的降低[22]。

2.3癌基因和抑癌基因異常 除了線粒體損傷和HIF的影響，許多的癌基因、抑癌基因的異常表達(dá)都可能引起葡萄糖糖攝取和糖酵解水平的改變，包括Akt、Ras、Src、p53等[23]。此外，這類基因表達(dá)的改變，還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其他基因的表達(dá)，從而更進(jìn)一步地影響腫瘤細(xì)胞的代謝和腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

總之，溫伯格效應(yīng)的產(chǎn)生與癌基因的表達(dá)改變、線粒體功能和數(shù)量的降低以及HIF的表達(dá)有著密切的關(guān)系，而它的最終表現(xiàn)則是糖酵解相關(guān)酶和蛋白質(zhì)的表達(dá)量的提升。

3 溫伯格效應(yīng)檢測(cè)技術(shù)

一般說(shuō)來(lái)，增生活躍的腫瘤細(xì)胞都會(huì)調(diào)節(jié)其能量代謝以滿足其細(xì)胞不斷生長(zhǎng)巨大的能量和生物合成的需求。而相關(guān)的檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展則能讓我們更好地理解腫瘤的這一特征，同時(shí)也為臨床的診斷提供新的可能性。

3.1葡萄糖攝取 目前的研究多采用不會(huì)被代謝的葡萄糖類似物如熒光脫氧葡萄糖(FDG)、2-脫氧-D-葡萄糖(2DG)、3-O-甲基葡萄糖(3MG)等研究腫瘤細(xì)胞中葡萄糖的攝取效率[24]。在細(xì)胞培養(yǎng)中，熒光標(biāo)記的葡萄糖類似物[如2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑-4-氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)等]的攝取可以通過(guò)流式細(xì)胞儀或是熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)，這需要細(xì)胞培養(yǎng)、收集技術(shù)以及流式細(xì)胞術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用[25]。目前根據(jù)腫瘤對(duì)2-脫氧-2-(18F)-氟-D-葡萄糖(18FDG)攝取的PET-CT技術(shù)已被廣泛地用于腫瘤患者腫瘤發(fā)生及其轉(zhuǎn)移的診斷中。

3.2糖酵解限速酶的活性 酶活性的檢測(cè)主要是將幾種重要的關(guān)鍵酶和NAD+/NADH+依賴的可見(jiàn)的或吸光度上變化的酶促反應(yīng)相結(jié)合的過(guò)程。此外，有學(xué)者指出，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)[26]、western blot技術(shù)[27]和免疫組化技術(shù)[28]分別可以在核酸、蛋白質(zhì)和組織中糖酵解相關(guān)的酶類的表達(dá)和分布情況進(jìn)行檢測(cè)，但這些技術(shù)仍主要應(yīng)用于臨床科研中，其臨床價(jià)值仍待驗(yàn)證。

3.3代謝組學(xué)和無(wú)機(jī)代謝產(chǎn)物 代謝產(chǎn)物的定量分析可以通過(guò)采用碳-13(13C)或氚(3H)標(biāo)記葡萄糖，并采用質(zhì)譜技術(shù)(MS)或核磁共振技術(shù)(NMR)檢測(cè)下游代謝產(chǎn)物的活性來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的糖酵解活性。碳-13(13C)可以用來(lái)置換葡萄糖分子中6個(gè)碳原子中的任意一個(gè)位置的碳；氚(3H)標(biāo)記葡萄糖中的氚(3H)元素最終會(huì)形成H2O，帶有氚(3H)元素的H2O則會(huì)通過(guò)烯醇化酶的轉(zhuǎn)換作用被釋放到培養(yǎng)基中，從而可以通過(guò)液相閃光計(jì)數(shù)來(lái)定量檢測(cè)[29]。

3.4氧氣的消耗 氧氣消耗率(OCR)是線粒體呼吸作用檢測(cè)的一個(gè)常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目，而且細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外OCR都可以用于檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，胞內(nèi)的氧氣消耗水平能更準(zhǔn)確地反應(yīng)一個(gè)細(xì)胞的代謝活躍程度；胞外的氧氣消耗則常用以Clark電極為代表的極譜法或光學(xué)探針進(jìn)行檢測(cè)[30]，而細(xì)胞外流量分析儀則可以實(shí)時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞代謝參數(shù)，如OCR、細(xì)胞外酸化率(ECAR)等。目前專門的代謝研究實(shí)驗(yàn)室中，Seahorse細(xì)胞代謝檢測(cè)儀比較常用，這也為細(xì)胞代謝的研究提供了一個(gè)途徑。

3.5細(xì)胞外酸化情況 伴隨葡萄糖攝取增高的糖酵解增加會(huì)導(dǎo)致額外的乳酸釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。采用商業(yè)化的檢測(cè)試劑通過(guò)比色或熒光反應(yīng)可定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸含量。糖酵解的活性可通過(guò)丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)換來(lái)反應(yīng)，而用細(xì)胞外流量分析儀可以檢測(cè)和確定ECAR的范圍[29]，通過(guò)添加葡萄糖和糖酵解/氧化磷酸化的抑制劑也能反應(yīng)糖酵解能力和糖酵解儲(chǔ)存。

3.6谷胱甘肽(GSH) GSH是一種能夠防止自由基和過(guò)氧化物酶損傷細(xì)胞的組織抗氧化劑。氧化應(yīng)激水平的提升會(huì)生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，最后導(dǎo)致GSSG和GSH比例的改變，而對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性的提升則與腫瘤的發(fā)展有關(guān)[31]。腫瘤細(xì)胞中GSH分子途徑的改變可導(dǎo)致化療藥物的耐藥性，增加腫瘤的生存性。在卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌和肺癌等腫瘤組織中的GSH水平較正常組織中常常呈增加的趨勢(shì)，而在肝和腦部腫瘤中則有著相反的情況[32]。GSH和GSSG的水平一般能通過(guò)分光光度法快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)，這對(duì)于臨床研究的開(kāi)展具有一定的意義。

總之，由于溫伯格效應(yīng)的本質(zhì)是腫瘤細(xì)胞的代謝改變，其檢測(cè)主要也是圍繞著代謝的原料(葡萄糖等)、關(guān)鍵酶和產(chǎn)物(H2O和CO2等)來(lái)展開(kāi)，目前臨床上唯一得以廣泛應(yīng)用的技術(shù)主要是圍繞影像學(xué)展開(kāi)的PET-CT技術(shù)，其他相關(guān)的技術(shù)依舊存在方法學(xué)建立和難以標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題，因此仍需我們后續(xù)更為深入的研究和探索。

4 小結(jié)及展望

目前，腫瘤細(xì)胞的溫伯格效應(yīng)作為腫瘤的一大特征已經(jīng)被廣為接受，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步的解明；在檢測(cè)的角度來(lái)看，目前臨床上除了PET-CT以外，基本沒(méi)有其他利用腫瘤細(xì)胞溫伯格效應(yīng)來(lái)對(duì)腫瘤進(jìn)行檢測(cè)的方法，其原因可能和標(biāo)準(zhǔn)化的困難等有關(guān)。近期的研究顯示，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸對(duì)浸潤(rùn)于組織中的免疫細(xì)胞的殺傷作用有抑制的作用；雖然這其中的機(jī)理仍待我們探索，但是對(duì)發(fā)展腫瘤的靶向治療，尤其是免疫治療提供了一個(gè)重要線索。因此，解明腫瘤細(xì)胞的溫伯格效應(yīng)，對(duì)腫瘤的診斷、治療都有著重大的意義。

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2017-07-21)

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.02

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(81572064)；上海市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)重要薄弱學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2015ZB0201)。

李懿皞，1995年生，男，大學(xué)本科，研究方向：腫瘤學(xué)。

潘柏申，研究員，E-mail：pan.baishen@zs-hospital.sh.cn。

R-1;R730.4

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