田小娟 邢 偉 陳 杰 張京剛 查婷婷 林英楠

腎纖維化是慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）終末期的常見結(jié)局[1]，也是腎移植失敗的最常見原因[2]。因此，早期診斷、治療纖維化對(duì)于減緩和逆轉(zhuǎn)慢性腎病的進(jìn)程，改善腎臟功能，提高腎病患者的生活質(zhì)量具有重要意義。目前，多采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行腎纖維化的相關(guān)研究，所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括大鼠、小鼠等[3-4]。兔腎較大，左腎位置低且表淺，較適合進(jìn)行MRI掃描。本研究將探討腎纖維化兔模型的建立，以及采用MRI常規(guī)檢查T2WI評(píng)價(jià)梗阻側(cè)腎臟形態(tài)學(xué)變化，同時(shí)以病理學(xué)作為金標(biāo)準(zhǔn)探討不同時(shí)間段輸尿管梗阻發(fā)生的機(jī)制，為臨床提供客觀依據(jù)。

方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

取健康新西蘭大白兔40只，雌雄不限，4～5月齡，體重2.4～2.7kg，完全隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=8）和手術(shù)組（n=32）。手術(shù)組又以梗阻時(shí)間不同隨機(jī)分為2周、4周、6周及8周組，每組8只。所有兔均單籠放置，全價(jià)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

2.動(dòng)物模型的建立

手術(shù)組：3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)腹腔注射麻醉后，將實(shí)驗(yàn)兔固定于手術(shù)臺(tái)上，左側(cè)臥位，術(shù)區(qū)剃毛、消毒，鋪無菌洞巾。行左側(cè)腹切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露腹腔，找到左側(cè)腎臟和輸尿管，用眼科鑷托起輸尿管上段部位并分離，分別在左側(cè)輸尿管近腎盂處用 4號(hào)絲線結(jié)扎兩處，兩處結(jié)扎間隔0.5cm，不離斷輸尿管。手術(shù)后將腎復(fù)原，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。

假手術(shù)組：不結(jié)扎輸尿管，其余步驟同手術(shù)組。

3.MRI設(shè)備及參數(shù)

采用 Siemens Verio 3.0T 磁共振掃描儀。所有實(shí)驗(yàn)兔分別于建模前及建模后的2、4、6、8周行磁共振掃描，左側(cè)臥位，頭先進(jìn)，6通道腹部線圈，范圍從左腎上極至左腎下極，中心線位于左腎門層面。掃描序列包括冠狀位、軸位T2WI。掃描參數(shù)：冠狀位T2WI：TR1400ms，TE93ms，層厚3.0mm，反轉(zhuǎn)角160°，F(xiàn)OV 154mm×219mm，分辨率126×256，層間距0.9mm，帶寬781 Hz/pixel；軸位T2WI：TR1000ms，TE 108ms，層厚4.0mm，反轉(zhuǎn)角138°，F(xiàn)OV130mm×130mm，分辨率179×256，層間距0.8mm，帶寬199 Hz/pixel。

4.圖像處理

正常腎臟在T2WI表現(xiàn)為內(nèi)髓高信號(hào)，外髓內(nèi)帶明顯低信號(hào)，外髓外帶稍高信號(hào)，皮質(zhì)稍低信號(hào)，各部位分界清楚，以外髓外帶為界以外為腎皮質(zhì)，以內(nèi)為外髓內(nèi)帶和內(nèi)髓。應(yīng)用德國SiemenSyngo后處理站，在“viewing”界面打開軸位T2WI序列，由同1名高年資 MRI診斷醫(yī)師采用盲法閱片，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩次測量取平均值。選取軸位T2WI腎門最大層面作為測量層面，按照腎皮質(zhì)、腎實(shí)質(zhì)走形手工繪制感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，在各ROI內(nèi)測量腎皮質(zhì)面積A1（cm2）、腎實(shí)質(zhì)面積A2（cm2）。

5.病理學(xué)檢查

掃描結(jié)束后采用耳緣靜脈注射空氣法處死實(shí)驗(yàn)兔，立即取出雙腎，用37℃生理鹽水清洗后，觀察記錄腎臟大小、形態(tài)、顏色、積水程度等。于腎蒂層面正中橫剖腎臟，然后將標(biāo)本置入10%的中性福爾馬林溶液中固定24h，行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片處理，并進(jìn)行HE染色，光鏡觀察分析。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)數(shù)資料以± s 表示。采用單因素方差分析比較假手術(shù)組和手術(shù)組腎臟各時(shí)間點(diǎn)A1值、A2值的差異，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 腎臟各時(shí)間點(diǎn)T2WI圖像特點(diǎn)

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)和手術(shù)組建模前T2WI表現(xiàn)為腎臟體積正常，腎盂、腎盞無擴(kuò)張，皮髓質(zhì)分界清楚。手術(shù)組建模后2周T2WI表現(xiàn)為梗阻側(cè)腎臟體積增大，腎盂及上段輸尿管擴(kuò)張，腎實(shí)質(zhì)變薄，腎皮質(zhì)增厚；建模后4周T2WI表現(xiàn)為梗阻側(cè)腎臟腎盂明顯擴(kuò)張，腎小盞擴(kuò)張，腎實(shí)質(zhì)明顯變薄，腎皮質(zhì)較2周時(shí)變??；建模后6～8周T2WI表現(xiàn)為梗阻側(cè)腎臟腎盞明顯擴(kuò)張并融合，腎實(shí)質(zhì)呈“殼”狀，腎皮質(zhì)明顯變?。▓D2）。

圖1 A1為腎皮質(zhì)面積，手術(shù)組于建模后2周時(shí)升高，4～8周時(shí)逐漸降低；假手術(shù)組無明顯變化。A2為腎實(shí)質(zhì)面積，手術(shù)組于建模后2～8周逐漸降低；假手術(shù)組無明顯變化。

2.腎臟各時(shí)間點(diǎn)A1值、A2值特點(diǎn)

假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)的A1值、A2值差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)A2值逐漸減小，A1值2周時(shí)升高，4～8周時(shí)逐漸降低，各時(shí)間點(diǎn)A1值、A2值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1，圖1）。

3.病理學(xué)檢查

圖2 A～D.分別為手術(shù)組建模后各時(shí)間點(diǎn)左腎T2WI圖像。A.建模后2周腎盂擴(kuò)張積水，腎實(shí)質(zhì)變薄，腎皮質(zhì)增厚。B.建模后4周腎盂明顯擴(kuò)張，腎實(shí)質(zhì)明顯變薄，腎皮質(zhì)較2周時(shí)變薄。C、D.建模后6～8周腎盞擴(kuò)張并融合，腎實(shí)質(zhì)呈“殼”狀，腎皮質(zhì)明顯變薄。E～H.分別為手術(shù)組建模后各時(shí)間點(diǎn)左腎中心橫斷面圖。E.建模后2周左腎體積明顯增大，腎盂擴(kuò)張。F～H.建模后4～8周腎盂腎盞明顯擴(kuò)張，皮髓質(zhì)分界不清。I、L.分別為手術(shù)組建模后各時(shí)間點(diǎn)左腎腎皮質(zhì)病理學(xué)觀察（HE染色×200）； I.建模后2周腎皮質(zhì)增厚，J、K.建模后4～8周腎皮質(zhì)逐漸變薄。

表1 各組實(shí)驗(yàn)兔建模前、后各時(shí)間點(diǎn)行MRI-T2WI掃描的A1值、A2值（ x± s ）

3.1 大體表現(xiàn)：假手術(shù)組和手術(shù)組建模前左腎體積正常，顏色鮮紅，腎臟剖面觀可見腎盂腎盞無明顯擴(kuò)張，皮髓質(zhì)分界清楚。手術(shù)組建模后左側(cè)腎臟體積逐漸增大，呈蒼白色，梗阻以上輸尿管明顯擴(kuò)張，腎臟剖面觀可見腎盂腎盞明顯擴(kuò)張，皮髓質(zhì)分界不清，腎實(shí)質(zhì)面積逐漸減小（圖2）。

3.2 顯微鏡下表現(xiàn)：假手術(shù)組和手術(shù)組建模前左腎腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管管腔清晰，腎間質(zhì)無充血、水腫，無炎性細(xì)胞浸潤。手術(shù)組建模后2周左腎腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管明顯擴(kuò)張，管腔增大伴上皮細(xì)胞腫脹；建模后4周腎小球腫脹，可見少量玻璃樣變性，腎小管部分萎縮，結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不清；建模后6周腎小球明顯變性、壞死，腎小管萎縮加重、管腔內(nèi)可見條索狀纖維組織；建模后8周腎小球旁有條索狀纖維組織增生，腎小管幾乎萎縮消失，被纖維樣結(jié)構(gòu)取代。建模后2周時(shí)，腎間質(zhì)增寬，炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞浸潤，后隨時(shí)間推移逐漸加重，纖維化逐漸形成。建模后2周時(shí)腎皮質(zhì)增厚，第4～8周逐漸變薄（圖2）。

討 論

腎纖維化是臨床上的常見病，是多種慢性腎臟疾病最終導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病理改變和共同通路[5]。原發(fā)性腎小球疾病、慢性腎盂腎炎等疾病均可導(dǎo)致腎纖維化[6]。目前對(duì)于腎纖維化的診斷方法主要是腎活檢和腎功能血生化檢查。但腎活檢是有創(chuàng)性檢查，血生化檢查對(duì)于分腎功能以及腎纖維化的實(shí)際狀況評(píng)價(jià)價(jià)值有限，而MRI具有高軟組織對(duì)比、高分辨率、無創(chuàng)性等特點(diǎn)，可以清晰顯示輸尿管梗阻后腎臟形態(tài)學(xué)變化，如腎盂、腎盞、輸尿管的擴(kuò)張等。因此本研究將T2WI用于腎纖維化的研究中，在不用對(duì)比劑的情況下評(píng)價(jià)腎纖維化的形態(tài)學(xué)變化。

腎纖維化模型制備方法有：單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）、腎切除動(dòng)物模型、藥物誘導(dǎo)模型等。腎切除動(dòng)物模型死亡率高，藥物誘導(dǎo)模型技術(shù)要求高，且對(duì)用此模型進(jìn)行的相關(guān)研究的評(píng)價(jià)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[7]。目前UUO為較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[8]。常用的腎纖維化動(dòng)物模型多為大鼠和小鼠等，因鼠腎臟體積小，不利于MRI反復(fù)檢查，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們采用了新西蘭兔行左腎UUO模型法。

隨著輸尿管梗阻時(shí)間的延長，腎小球?yàn)V過率進(jìn)行性降低，腎盂內(nèi)壓力持續(xù)上升[9]。本組實(shí)驗(yàn)中腎實(shí)質(zhì)的面積隨著梗阻時(shí)間的延長逐漸減小，與單側(cè)輸尿管梗阻后腎盂內(nèi)壓力逐漸升高有關(guān)。其機(jī)理可分為兩方面：首先由于腎小管內(nèi)壓力升高，通過球-管反饋使腎內(nèi)縮血管物質(zhì)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致腎組織缺血缺氧；其次由于縮血管物質(zhì)對(duì)出球微動(dòng)脈的收縮作用強(qiáng)于入球微動(dòng)脈，導(dǎo)致腎小球內(nèi)壓力升高，血液排入腎小管。以上兩方面原因?qū)е履I小球崩解，腎小囊萎縮變形，腎小管管腔閉合，最終導(dǎo)致整個(gè)腎單位的破壞、消失，因此隨著梗阻時(shí)間的延長，腎單位破壞逐漸增多，腎實(shí)質(zhì)萎縮逐漸加重[10]。同時(shí)國內(nèi)外研究表明單側(cè)輸尿管梗阻后對(duì)梗阻側(cè)腎臟的病理改變主要為腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的腎實(shí)質(zhì)萎縮和纖維化[11]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，手術(shù)組建模后2周時(shí)腎皮質(zhì)增厚，主要因?yàn)樵撾A段梗阻腎處于炎癥反應(yīng)階段，病理上表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張伴上皮細(xì)胞腫脹，腎間質(zhì)增寬、炎癥細(xì)胞浸潤。在該階段患者無不適癥狀，如規(guī)范治療，病情可完全逆轉(zhuǎn)。建模后4～8周時(shí)腎皮質(zhì)逐漸變薄，主要因?yàn)樵撾A段梗阻腎處于纖維化形成階段，病理上表現(xiàn)為腎小球逐漸變性、壞死，腎小管管腔內(nèi)纖維組織增生，腎間質(zhì)內(nèi)纖維細(xì)胞增多、纖維化逐漸形成。在該階段患者腎功能受損，如持續(xù)規(guī)范治療，病情可出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，否則將最終導(dǎo)致腎功能衰竭。相關(guān)研究如韓文文等[12]觀測了犬輸尿管梗阻后1周，梗阻側(cè)腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性，腎間質(zhì)基本正常；梗阻后4周，腎小球出現(xiàn)少量萎縮、退化，腎小管明顯擴(kuò)張，腎間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤；梗阻后8周，腎小球上皮細(xì)胞內(nèi)纖維結(jié)締組織增生。以上研究表明輸尿管梗阻后腎臟經(jīng)歷炎性反應(yīng)階段和纖維化形成階段，炎癥反應(yīng)階段，腎皮質(zhì)增厚，后由于纖維化逐漸形成，腎皮質(zhì)逐漸變薄。

綜上所述，單側(cè)輸尿管梗阻可成功建立腎纖維化兔模型，T2WI能準(zhǔn)確地反映單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化兔模型的形態(tài)學(xué)變化，為臨床觀察和診斷提供一種有效的影像學(xué)檢查方法。

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