張晨曦(上海師范大學，上海 200235)

分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應用

張晨曦(上海師范大學，上海 200235)

微生物多樣性研究是生物多樣性研究中的重要內容，由于微生物與動植物相比，存著這許多不同之處，因此其多樣性研究也存在著許多不同之處，尤其是研究方法仍有待提升。近些年來，越來越多的研究通過分子生物學方法觀察微生物并取得了一定的成效。因此，文章主要針對分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應用價值展開分析。

分子生物學方法；微生物多樣性；遺傳多樣性

微生物主要包括細菌、放線菌、原生動物、真菌、部分藻類和病毒，是構成自然界的重要組成部分，其具有代謝多樣性和遺傳多樣性，使得微生物在許多極端環(huán)境中都能夠生存、繁衍。微生物是生物鏈中的重要成員，對于動植物的生長發(fā)育、生態(tài)循環(huán)以及污染物的自然降解具有重要作用[1]。微生物種類數量僅次于昆蟲，但目前已知微生物種類占其總估計量的比重仍較低，目前生物界中已知的細菌、真菌以及病毒占其總種類的比重僅有6%、11%和5%，微生物多樣性的研究滯后于其他生物群。

1 微生物多樣性研究的重要性

微生物在維持生態(tài)平衡中具有重要作用，但是我們對于維持生態(tài)平衡的微生物系統的結構以及有關參數知之甚少，究其原因是由于傳統微生物培養(yǎng)方法是通過獲得培養(yǎng)菌株才能了解其特征，但是在自然界中能夠培養(yǎng)的微生物數量還不到微生物總量的百分之一。傳統微生物研究主要是通過觀察菌株的表性特征以及細胞的性質（包括細胞形態(tài)學、生理生化反應以及細胞組成成分等方面）[2]。由于實驗室培養(yǎng)是觀察這些微生物特征的重要前提，因此這使得許多無法培養(yǎng)的微生物都不能被具體描述。此外，這種研究方式對于微生物的進化關系沒有有效的作用，因此微生物進化研究受到影響，從而無法對微生物進行準確的分類以及系統關系圖的創(chuàng)建。DNA技術以及微生物分子學的出現為微生物研究提供了新的道路，有助于現代微生物多樣性研究的良好開展。

從理論層面上分析，微生物進化之間的關系主要是由于基因組的結構決定的，通過比較微生物基因序列之間的不同能夠有助于分析微生物之間的進化關系，比較簡單的方法就是比較不同微生物類似基因之間的堿基序列，堿基序列之間的差距越大，說明微生物之間的進化關系也就越小。該方法可以用于分析不同微生物之間的進化距離，從而用于構建進化關系樹或微生物圖譜[3]。在微生物多樣性研究中發(fā)現，16S rRNA以及18S rRNA的變化速率較低慢，常用于微生物進化關系分析的檢驗中。近些年來，隨著微生物DNA技術的不斷發(fā)展，以核酸基因序列為依據的微生物進化研究獲得了有效的進步。現代分子生物學技術的出現突破了傳統研究技術的限制，從遺傳角度上能夠分析出微生物的種類以及遺傳多樣性。

2 分子生物學方法在微生物多樣性研究中的理論基礎

2.1 “三界”理論的提出

生物學界在對古化石標本研究中發(fā)現，早在30億年前地球上就有自養(yǎng)細菌的存在，20多億年前地球上出現了藍細菌，15億年前真核生物首次出現在地球上，也就是說原核生物比真核生物出現的要更早，真核細胞是由原核細胞進化而來也是一種比較科學的結論，這也是生物學界早期生命進化的主流理論[4]。這一學說認為所有的生命都可以劃分為這兩種類型，且如今的真核生物就是由原核生物進化發(fā)展而來。

分子生物學方法的應用對于改正現代微生物種類劃分以及進化關系等方面具有較好的效果。進三十年來，大量的細胞生物學研究和分子生物學的研究證實，原核生物早在數億年前就已經分化為真細菌和古細菌這兩大類。過去在建立微生物進化樹時，主要是根據微生物細胞色素C中氨基酸組成變化的特點，這主要是由于真核生物與大部分原核生物都有細胞色素C。但是在研究中發(fā)現，有些古細菌沒有細胞色素C，而有些細菌雖然有細胞色素C，但是其氨基酸組成之間的差異過大，無法確定其是否有著進化關系[5]。通過rRNA的序列結構確定微生物之間的進化關系為微生物多樣性的研究提供了更廣闊的空間。

“三界”理論是由學者沃瑟提出的，其認為原核生物應分為古細菌與真細菌兩界，但兩界彼此之間有著很大的差異，也就是說古細菌、真細菌與真核生物三者是相互平行的，三者都起源于共同的原始細胞。三界學說隨著研究的進步而不斷發(fā)展，大量古標本生物分子研究證實了古核生物遺傳基因與真核生物有相似之處，古細菌與真核生物從進化學角度來看比原核生物更加密切，因此近些年來有越來越多的學者支持真核生物起源于古細菌的學說，認為真細菌是最先從古細菌與真核生物的生物干線中分離出來的?！叭纭崩碚摰奶岢鰹闉樯锒鄻有缘难芯刻峁┝巳碌囊暯?，并提示微生物遺傳多樣性具有普遍性。

2.2 16S rRNA基因序列在分子生物學中的應用

佩斯等人首次通過rRNA基因鑒定樣本中微生物的類別，利用5S rRNA基因序列分析微生物的演變與進化。該方法取得了一定的成效并且很快被用于研究微生物多樣性。但是由于5S rRNA的基因序列相對較小，僅有120個核苷酸，攜帶信息不多，在微生物多樣性研究領域起到的作用有限，而16S rRNA基因序列與5S rRNA基因序列相比，其攜帶信息更多，有1500個核苷酸，在分析微生物多樣性方面的作用與效率更高。16S rRNA是原核生物中的一種RNA，具有種類少且范圍廣的優(yōu)點，約有80%細菌RNA中含有16S rRNA，適用于所有的生物中，從結構和功能上來看具有較強的保守型，被稱為細菌化石。16S rRNA既能夠表現出不同菌屬之間的差異，同時又能夠被分子生物技術所測量，因此得到了生物學家的廣泛支持。細菌16S rRNA中的可變區(qū)序列都是根據細菌的菌屬來確定的，恒定區(qū)序列相對比較穩(wěn)定，因此可以利用恒定區(qū)序列將16S rRNA片段進行擴增處理，利用不同細菌的可變區(qū)序列進行菌屬和菌種的鑒定。通過對16S rRNA基因序列的分析，從而判斷不同菌屬、菌種之間進化關系的密切程度。16S rRNA序列同源性分析是推斷細菌進化和發(fā)展的重要方法。

3 分子生物學技術在微生物多樣性研究中的應用

隨著科學技術的不斷發(fā)展，DNA技術成為遺傳學研究中的重要方法。近些年來，從樣本中采集和提取DNA的方法不斷改進，從而對樣本中的微生物進行聚合酶鏈式反應擴展，推動了微生物多樣性研究的發(fā)展。因此，文章針對分子生物學技術在微生物多樣性研究中的應用展開闡述。

3.1 分子雜交技術

分子雜交技術是出現于1970年的分子生物學技術，其主要利用DNA分子堿基相互配對的原理，利用特異性C DNA探針與樣本中的DNA或RNA形成雜交分子，其具有較高的特異性和敏感度，在微生物多樣性研究中得到了廣泛的應用。目前實驗中主要使用的探針有雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA、寡核苷酸探針這三種，能夠對微生物能否存在于特定環(huán)境、分布特點以及元素豐度等方面進行確定。

對采集到的微生物進行印跡雜交，能夠獲得特定DNA序列的信息，主要原理是利用16S rRNA基因探針與采集的為神武進行雜交，16S rRNA相對豐度能夠通過兩者之間的雜交信號確定，從而間接反應微生物細胞的數量和生理特征。對采集樣本直接進行原位雜交，然后利用具有熒光標記的核酸片段作為探針，與樣本染色體和細胞核進行DNA雜交，就能夠尋找到同源DNA片段所在位置，實現了細胞DNA序列的定位。該技術能夠從未知菌種獲得大量的信息，包括微生物形態(tài)以及生物結構等方面的信息。但是由于是對環(huán)境樣本的檢測，所獲得的理論更加能夠凸顯自然環(huán)境中微生物的特點。這種方法應用的關鍵是前期探究工作的不斷累積，尤其是對已知微生物。全細胞雜交比印跡雜交更加直觀，其主要是通過放射性標記rRNA探針來檢查單個微生物細胞。

3.2 PCR技術

PCR技術也就是聚合酶鏈式反應技術，其主要利用雙鏈DNA變性與復性及分子雜交技術。PCR技術是一種快速擴增特定基因或DNA序列的方法，能夠將少量DNA特異性擴增，通過多次解鏈以及反復循環(huán)，能夠將基因或DNA序列擴增十幾倍，從而對采集DNA樣本進行分析，包括基因分析、序列分析以及進化分析等。目前學界采用最廣的是以16S rRNA基因為基礎的PCR擴增，對微生物基因序列的擴增有助于分析微生物進化的多樣性。

PCR技術僅需要少量DNA即可進行檢測。所選取的擴增模版DNA片段要符合規(guī)范，若擴增不科學，可導致推斷錯誤，一般來說，引物應當出現于分析基因序列的高度保守區(qū)，多在15～30bp區(qū)間。采用雙鏈產物作為PCR擴增模版，通過控制兩種引物的含量，能夠擴增出特定的DNA序列。單鏈構象多態(tài)技術主要是根據不同構象的DNA單鏈在中性物質中的變遷率來觀察DNA基因的多樣性。若單鏈DNA出現單堿基缺失時，遷移率會產生相應的變化，從而在譜帶中出現多樣性變化。該技術所采用的方法主要分為PCR擴增和凝膠分離這兩方面，典型的單鏈構象多態(tài)技術需要在PCR擴增中加入典型ATP標記引物或CTP標記引物才能進行擴增，擴增完畢之后通過放射觀察單鏈構象的多態(tài)變化。但是這種方法花費的時間與經費較大，且操作復雜，隨著近些年的技術改進，采用印染顯色以及溴化乙錠染色能夠直接在中性凝膠中顯示單鏈構象多態(tài)性，并且能夠采用同為標記引物進行測驗，使得該技術更加快捷和有效。單鏈構象多態(tài)技術的優(yōu)點在于：①能夠檢測到單堿基的基因突變；②方便快捷，適用于多樣本篩查中。但是該技術也有一定的缺陷，即其對小片段PCR擴增產物較為敏感，對于大片段PCR擴增產物的檢驗需要采用雙向凝膠電泳進行分析。

4 結語

微生物多樣性的傳統研究方法是提取為環(huán)境樣本中的微生物進行實驗室培養(yǎng)和鑒定，但是自然界中的微生物種類非常多，能夠采集到的微生物有限，且能夠進行實驗室培養(yǎng)的微生物更是少之又少，僅為微生物的1%。近些年來隨著DNA技術的不斷發(fā)展，通過DNA技術來觀察微生物菌屬和種類的研究得到了較大的發(fā)展，這為微生物多樣性的研究提供了新的方向。

[1]楊永華,姚健.分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應用[J].生物多樣性,2014,8(3):337-342.

[2]譚益民,何苑皞,郭文平等.基于分子技術的土壤微生物多樣性研究進展[J].中南林業(yè)科技大學學報,2014,23(10):1-9.

[3]盧莉瓊,徐亞同,梁俊等.分子生物學方法在微生物多樣性及微生物生態(tài)研究中的應用[J].應用與環(huán)境生物學報,2014,10 (6):826-830.

[4]燕艷,陳健,燕昌江等.利用分子生物學技術鑒定土壤微生物的方法[J].東北農業(yè)大學學報,2014,39(3):129-133.

[5]李慧,陳冠雄,張穎等.分子生物學方法在污染土壤微生物多樣性研究中的應用[J].土壤學報,2014,41(4):612-617.

張晨曦男漢族籍貫：河南省周口市 在讀上海師范大學研究生三年級、微生物學專業(yè)、研究方向：分子生物學、郵編：200235