焦?jié)?/p>

摘要：蛋白質(zhì)的存在，會影響到酸堿測定中所用的某些指示劑的顏色變化，從而會改變?nèi)玖系墓馕?。因此在此基礎(chǔ)上發(fā)展了蛋白質(zhì)的染色測定方法，所涉及的指示劑目前最為廣泛使用的染料就是考馬斯亮藍(lán)。該文分析了考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，測定苜蓿中的可溶性蛋白含量。

關(guān)鍵詞：考馬斯亮藍(lán)；苜蓿；蛋白含量

可溶性蛋白是屬于蛋白質(zhì)的一種，由于生物體內(nèi)主要吸收利用的是可溶性蛋白，即可溶性蛋白含量高的植物開發(fā)價值高。苜蓿是一種葉蛋白含量較高的植物，但是，其中可溶性蛋白與總蛋白含量不一定成正比例關(guān)系。目前也沒有相關(guān)苜蓿中可溶性蛋白含量的報道，因此我們在苜蓿葉蛋白含量測定基礎(chǔ)上對其可溶性蛋白進(jìn)行了測定。通過對蛋白質(zhì)含量分析、了解為苜蓿資源評價提供參考依據(jù)。鑒于一般植物體內(nèi)可溶性蛋白含量較低的特點，我們采用具有消耗蛋白質(zhì)量小、靈敏度高、受外界因素影響小等特點的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（CBB）來測定[1，2]。

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合則呈現(xiàn)藍(lán)色。染料的最大吸收從465 nm變?yōu)?95 nm，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測定的靈敏度較高，最低檢出量為1 ug蛋白質(zhì)。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2 min，結(jié)合物的顏色在1 h內(nèi)是穩(wěn)定的（測定須在1 h內(nèi)完成）。一定范圍內(nèi)，溶液在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定。本法試劑配制簡單，操作簡便快捷，靈敏度高，測定范圍1-1000 ug 。

1 儀器、材料及試劑

Cary50紫外分光光度計；牛血清蛋白進(jìn)口分裝；考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)口分裝（上海新型化工試劑研究所）；其他藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。新鮮苜蓿

2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品浸體液制備

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：稱取牛血清蛋白25 mg，加水溶解并定容至100 mL（250 μg/mL），再吸取上述溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL即可（100 μg/mL），所配置標(biāo)準(zhǔn)儲備液須在冰箱中保存。

考馬斯亮藍(lán)G-250溶液制備：準(zhǔn)確稱取100.00 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL90%乙醇中，再加入85%（W/V）磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容至1000 mL。此溶液在常溫下可放置一個月。

樣品浸體液制備 ：稱取苜蓿干樣0.07 g（其他植物樣品按蛋白質(zhì)含量而定大約干樣0.05-0.07 g，新鮮樣0.5 g左右），加少量石英砂用蒸餾水研磨成勻漿定容至100 mL，靜置10-30 min（期間搖動數(shù)次）過濾（含色素可用活性炭脫色），過濾定容至10 mL。

3 檢測結(jié)果及討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取6支試管，按表1，數(shù)據(jù)配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1.0 mL。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1 mL，分別放入10 mL具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置2 min后，在595 nm下比色，所測數(shù)據(jù)以蛋白含量（X）為橫坐標(biāo)以吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，回歸方程為：A=1.13265×C=4.3743，R=0.9927。

3.2 重現(xiàn)性試驗

準(zhǔn)確稱取同一種樣品5份（1號樣），按“樣品浸體液制備”和“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項下操作，測定吸光度，RSD%=1.6，具體測定值如表2。

3.3 加標(biāo)回收率試驗

準(zhǔn)確稱取一支含量的樣品（2號樣），分別加入一定量的牛血清蛋白，按"樣品浸提液制備"和“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項下操作，測定吸光度，平均回收率為97%，RSD%=3.7。具體結(jié)果見表3。

3.4 前處理方法改進(jìn)試驗

我們根據(jù)實驗室儀器設(shè)備以及樣品條件在浸提方法上與傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行對比改進(jìn)，進(jìn)行了一定的改進(jìn)，使得浸提樣品方便快捷，并能達(dá)到浸提完全。 具體處理方法及數(shù)據(jù)見表4。

由表4結(jié)果可見，方法②、③前處理效果比④、⑤、⑥方案浸提更完全，測定樣品可溶性蛋白濃度值根接近經(jīng)典方法，而與①比較方法②是樣品浸提方案中最簡便、快捷、測定準(zhǔn)確的前處理方案。

3.5 顯色穩(wěn)定性試驗

準(zhǔn)確稱?。?號）樣品0.7 g，按“樣品浸提夜制備”及“標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制”項下操作，每隔一定的時間測定一次吸收度，結(jié)果表明，再顯色3 h內(nèi)吸收無變化。

4 討論

本研究通過考馬斯亮藍(lán)G-250染色法對苜蓿中較低濃度的可溶性蛋白含量進(jìn)行測定以了解苜蓿中可溶性蛋白含量的情況，并進(jìn)行處理方法篩選，確定測定低濃度蛋白質(zhì)的最佳條件。結(jié)果表明：

考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（1-1000 μg）蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度于蛋白質(zhì)含量成正比符合朗貝比爾定律，故可用于蛋白質(zhì)含量的測定。

CBB染色法是定量測定低濃度蛋白質(zhì)溶液的快速、靈敏的方法，但在應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)CBB染色法測定的吸收度值與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系明顯，但平行測定的相同濃度的吸收度變化較大，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了驗證考馬斯亮藍(lán)G-250染色法的準(zhǔn)確性，我們進(jìn)行了重復(fù)性試驗對每個樣品測定3次，求得樣品的平均值，其可溶性蛋白18.45-14.42 g/kg的范圍，由RSD=1.6%可知結(jié)果是較穩(wěn)定的，該方法對苜蓿中可溶性蛋白測定結(jié)果較準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

[1] 王愛軍，王鳳山，王友聯(lián)，等. 低濃度蛋白質(zhì)含量測定方法的比較[J]. 中國生化藥物雜志，2003.24（2）：78-80.

[2] 王衛(wèi)國，吳強，胡寶坤，等. 幾種測定灰樹花多糖中蛋白質(zhì)含量方法的比較研究[J]. 2003，22（1）：27-30.

[3] 李建武，余瑞元，等. 生物化學(xué)實驗原理和方法[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，1994.160-176.