姚瑤 馮偉紅 王嵐 易紅 梁日欣 何愛萍 殷曉杰 杜茂波 劉淑芝

摘要：目的 研究微乳/醇質(zhì)體對活血止痛凝膠貼膏的經(jīng)皮滲透特性及對藥效的影響。方法 采用改進(jìn)的Franz擴(kuò)散池法進(jìn)行體外透皮試驗，以離體小鼠皮膚為透過屏障，采用超高效液相色譜法測定指標(biāo)成分丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯的含量，評價活血止痛凝膠貼膏的經(jīng)皮滲透效果。并采用小鼠醋酸扭體實驗比較其抗炎鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果 凝膠貼膏、微乳凝膠貼膏和醇質(zhì)體凝膠貼膏丹皮酚24 h累計透過率分別為65.30%、61.30%、60.20%，丁香酚24 h累計透過率分別為51.08%、54.71%、55.66%，水楊酸甲酯24 h累計透過率分別為49.20%、65.17%、72.15%。微乳凝膠貼膏大劑量組、醇質(zhì)體凝膠貼膏中劑量組對減少模型動物腹腔內(nèi)毛細(xì)血管的炎性滲出、降低毛細(xì)血管通透性有較好的作用（P<0.05）。結(jié)論 基于微乳/醇質(zhì)體技術(shù)的復(fù)合型納米載體可使活血止痛凝膠貼膏中有效成分透過皮膚屏障的能力更優(yōu)，從而提高藥效。

關(guān)鍵詞：活血止痛凝膠貼膏；微乳；醇質(zhì)體；透皮試驗；抗炎；鎮(zhèn)痛

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.018

中圖分類號：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0070-06

活血止痛膏由干姜、陳皮、丁香、胡椒、荊芥、牡丹皮、水楊酸甲酯等28味中藥組成，具有活血止痛、舒筋活絡(luò)功效，主治筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核流注、關(guān)節(jié)酸痛[1]。原劑型為橡膠膏劑，上市多年，療效確切，被廣泛使用。由于橡膠膏劑透氣性差、易致敏[2]，故將其改為凝膠貼膏?；钛雇锤嗵幏骄袚]發(fā)油等脂溶性成分，而凝膠貼膏是以水溶性高分子材料為基質(zhì)的外用貼劑，為保證處方藥與基質(zhì)的高度融合，提高制劑穩(wěn)定性，本研究以凝膠貼膏為載體，微乳/醇質(zhì)體[3-5]為釋藥系統(tǒng)，制備復(fù)合型納米經(jīng)皮給藥制劑，在解決脂溶性成分與水溶性基質(zhì)相容性的同時，利用微乳、醇質(zhì)體納米化的優(yōu)勢，促進(jìn)藥物經(jīng)皮滲透。以方中脂溶性成分丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯為定量指標(biāo)，考察體外經(jīng)皮滲透特性和對藥效的影響，評價微乳、醇質(zhì)體在中藥復(fù)方經(jīng)皮給藥制劑中應(yīng)用的可行性。

1 儀器、試藥與動物

Waters Acquity HPLC H-Class Core System超高效液相色譜儀，BSA224S CW型電子分析天平（德國賽多利斯公司），TK-20B型Franz擴(kuò)散池（上海鍇凱有限公司），透析袋（截留相對分子質(zhì)量7000，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司），Z92-BD多功能攪拌器（天津利華儀器廠）。

活血止痛凝膠貼膏（自制，批號160615），微乳活血止痛凝膠貼膏（自制，批號160626），醇質(zhì)體活血止痛凝膠貼膏（自制，批號160626）；丹皮酚對照品（批號D-002-140728）、丁香酚對照品（批號D-064-140728）、水楊酸甲酯對照品（批號S-018-150728），成都瑞芬生物科技有限公司；甲醇、乙腈為HPLC級（美國，F(xiàn)isher公司），水為屈臣氏蒸餾水，冰醋酸（北京化工廠，批號20150704），伊文思藍(lán)（上?；瘜W(xué)試劑廠，批號030712），其余試劑均為分析純。

昆明種小鼠，雄性，透皮試驗小鼠體質(zhì)量14～16 g、4～5周齡，藥效學(xué)試驗小鼠體質(zhì)量20～22 g、6～7周齡，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于SPF級動物房，動物許可證號SCXK（軍）2012-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成濃度分別為1.48、8.92、18.2 mg/L的混合對照品儲備液。精密量取該儲備液1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取活血止痛凝膠貼膏體外透皮接收液，過0.20 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取凝膠貼膏空白基質(zhì)體外透皮接收液，過0.20 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Acquity UPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～4 min，10%～90%A）；檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，流速：0.6 mL/min。在上述色譜條件下，對照品溶液、供試品溶液中丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯均分離良好，陰性對照溶液無干擾。

2.1.5 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液3 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣1 ?L，再將混合對照品儲備液分別進(jìn)樣0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 ?L，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣，測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯的峰面積，并以各成分的進(jìn)樣質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。結(jié)果顯示，3種待測成分在確定的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

2.1.6 日內(nèi)精密度試驗 分別精密吸取2、1、12 h接收液，為高、中、低濃度，于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯峰面積，結(jié)果顯示各成分RSD均在3%以下，表明儀器精密度良好，見表2。

2.1.7 日間精密度試驗 分別精密吸取2、1、12 h接收液，為高、中、低濃度，于3 d內(nèi)每日分別連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯峰面積，結(jié)果顯示各成分RSD均在3%以下，表明儀器精密度良好，見表2。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯峰面積，結(jié)果RSD分別為1.4%、1.2%、0.24%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，見表2。

2.1.9 重復(fù)性試驗 精密吸取6份供試品溶液，注入超高效液相色譜儀中，分別測定丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯含量，RSD分別為1.3%、1.6%、1.2%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的接收液5 mL，按樣品含量∶對照品加入量大致為1∶1比例加入丹皮酚、丁香酚和水楊酸甲酯混合對照品溶液，加甲醇定容至10 mL，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯的平均加樣回收率分別為98.44%、102.33%、101.93%，RSD分別為1.68%、0.65%、1.90%，表明方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

2.2 凝膠貼膏基質(zhì)的制備

2.2.1 活血止痛凝膠貼膏的制備 精密稱取處方量活血止痛浸膏和凝膠貼膏基質(zhì)，混合均勻，制成膏體后均勻涂布于襯布上，加蓋聚乙烯薄膜，即得活血止痛凝膠貼膏樣品?；钛雇唇嘀械てし?、丁香酚、水楊酸甲酯含量分別為1.42、11.19、125.36 mg/g浸膏。

2.2.2 微乳活血止痛凝膠貼膏的制備 按處方比例稱取活血止痛浸膏、樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯與適量中鏈甘油三酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油和丙二醇，按微乳制備工藝混合，使藥物溶解完全，于室溫采用磁力攪拌器邊攪拌邊加入處方量的水至澄清透明，即得O/W型載藥活血止痛微乳，用載藥微乳溶脹輔料混合均勻，制成膏體后均勻涂布于襯布上，加蓋聚乙烯薄膜，即得微乳活血止痛凝膠貼膏樣品。

2.2.3 醇質(zhì)體凝膠貼膏的制備 采用注入法制備活血止痛醇質(zhì)體，稱取處方量冰片、樟腦、薄荷腦、水楊酸甲酯加入膽固醇、磷脂、表面活性劑和維生素E油，注入一定量的乙醇，在密閉、溫度35 ℃、磁力攪拌條件下溶解完全后，將純水緩慢加入乙醇溶液中，持續(xù)攪拌5 min，攪拌結(jié)束后將醇質(zhì)體放至室溫，經(jīng)0.20 μm微孔濾膜過濾，得醇質(zhì)體。將醇質(zhì)體與其他藥材醇提物混合均勻，即得醇質(zhì)體浸膏。稱取處方量醇質(zhì)體浸膏和基質(zhì)，混合均勻，制成膏體后均勻涂布于襯布上，加蓋聚乙烯薄膜，即得醇質(zhì)體活血止痛凝膠貼膏樣品。

2.3 體外經(jīng)皮滲透試驗

2.3.1 離體鼠皮的制備 小鼠斷頸處死，適量脫毛劑脫去鼠毛，生理鹽水沖洗干凈，剝離皮膚，去除脂肪層、筋膜，置于生理鹽水中，選取完整無破損皮膚。

2.3.2 經(jīng)皮滲透試驗 采用Franz擴(kuò)散池，將活血止痛凝膠貼膏、微乳活血止痛凝膠貼膏、醇質(zhì)體活血止痛凝膠貼膏分別設(shè)為A、B、C組，每組精密稱取凝膠貼膏0.500 g/份，平行5份。將鼠皮固定在擴(kuò)散池與接收池之間，擴(kuò)散面積為3.14 cm2，接收液為PEG400-95%乙醇-生理鹽水（1∶3∶6），磁力攪拌轉(zhuǎn)速為350 r/min，控制溫度為（32±0.2）℃，計時，分別于1、2、4、8、12、24 h時間點將接收液全部取出，同時補加同體積的新鮮接收液。將接收液作為供試品溶液，過0.20 μm微孔濾膜，采用超高液相色譜法（UPLC）測定供試品中丹皮酚、丁香酚、水楊酸甲酯的含量，分別按照公式計算其累計透過率（Q）。

Q=[∑_（i=1）^C_i ]×V/W×100。式中，Ci為第i個時間點樣品的質(zhì)量濃度，V為每次取樣的體積，W為所取凝膠貼膏樣品中待測成分的含量。以Q對透皮時間（t）作圖，繪制體外透皮曲線。

凝膠貼膏、微乳凝膠貼膏和醇質(zhì)體凝膠貼膏丹皮酚24 h累計透過率（Qp）分別為65.30%、61.30%、60.20%，丁香酚24 h累計透過率（Qe）分別為51.08%、54.71%、55.66%，水楊酸甲酯24 h累計透過率（Qm）分別為49.20%、65.17%、72.15%。不同釋藥載體的3種成分中只有水楊酸甲酯24 h累計透過率微乳/醇質(zhì)體凝膠貼膏具有明顯優(yōu)勢，見圖5。

3 討論

凝膠貼膏、微乳凝膠貼膏和醇質(zhì)體凝膠貼膏丹皮酚24 h累計透過率分別為65.30%、61.30%、60.20%，丁香酚24 h累計透過率分別為51.08%、54.71%、55.66%，經(jīng)t檢驗，二者組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；水楊酸甲酯24 h累計透過率分別為49.20%、65.17%、72.15%，凝膠貼膏與醇質(zhì)體凝膠貼膏組間比較P<0.01，微乳凝膠貼膏與醇質(zhì)體凝膠貼膏組間比較P<0.01，凝膠貼膏與微乳凝膠貼膏組間比較P>0.05，三者比較，納米載體對水楊酸甲酯促進(jìn)經(jīng)皮滲透效果明顯。丹皮酚、丁香酚組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與其分子量小且均具有芳香走竄特性，容易經(jīng)皮滲透等因素有關(guān)[7-8]。其透皮特性基本符合Higuchi模型特點。0～4 h經(jīng)皮滲透過程符合零級過程，4 h后透皮速率減慢且非恒速，可能是皮膚表面藥物濃度降低，皮膚遠(yuǎn)端藥物擴(kuò)散緩慢達(dá)不到前4 h制劑中的藥物濃度所致。

從藥效試驗結(jié)果可以看出：不同釋藥載體的活血止痛膏貼均能不同程度降低由化學(xué)刺激引起的腹腔疼痛，減少小鼠扭體次數(shù)，提高扭體反應(yīng)抑制率；且微乳凝膠貼膏大劑量組、醇質(zhì)體凝膠貼膏中劑量組對減少小鼠腹腔內(nèi)毛細(xì)血管的炎性滲出、降低毛細(xì)血管通透性具有較好作用（P<0.05）。說明將藥物納米化可提高某些藥物的累計透過率及透皮速率，從而提高藥效[9-11]。

將活血止痛膏制成納米釋藥載體，增加了藥物在整個體系中的溶解度[12-13]，藥物以分子形式容易透過皮膚。同時，微乳或醇質(zhì)體將脂溶性成分轉(zhuǎn)化為水溶性，在解決水性凝膠與之相容性并提高了制劑穩(wěn)定性的同時，又利用微乳和醇質(zhì)體在經(jīng)皮滲透中的優(yōu)勢使藥物透過皮膚。因此，采用納米復(fù)合載藥釋藥系統(tǒng)，凝膠貼膏中有效成分透過皮膚屏障的能力更優(yōu)[14]，本研究也為中藥復(fù)方外用制劑的開發(fā)提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1294-1295.

[2] 梁秉文，劉淑芝，梁文權(quán).中藥經(jīng)皮給藥制劑技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013：103-106.

[3] 李學(xué)敏，王瓊，蘭頤，等.微乳技術(shù)對止痛凝膠膏劑中成分釋放和含量變化的影響[J].中國中藥雜志，2013，38（16）：2614-2617.

[4] 趙振宇，孫浩.微乳凝膠新制劑的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2014，34（5）：411-415.

[5] 施曉琴，趙繼會，王志東，等.醇質(zhì)體在經(jīng)皮給藥方面的應(yīng)用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（12）：352-355.

[6] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：305- 306，378-379.

[7] 王森，朱衛(wèi)豐，歐水平，等.丹皮酚理化性質(zhì)及體外經(jīng)皮滲透性的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22（2）：215-219.

[8] 孫曉彤，劉善新，蘇酩，等.丁香酚透皮吸收的研究進(jìn)展[J].中國藥房， 2016，27（11）：1579-1581.

[9] 劉繼勇，韓盈，楊明，等.丹皮酚微乳凝膠劑的制備及體外透皮特性研究[J].中國中藥雜志，2009，34（21）：2730-2733.

[10] LUO M， SHEN Q， CHEN J. Transdermal delivery of paeonol using cubic gel and microemulsion gel[J]. International Journal of Nanomedicine，2011，6：1603-1610.

[11] 李理宇，王洪權(quán).新型經(jīng)皮給藥載體——醇質(zhì)體的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2010，19（1）：33-38.

[12] 姜素芳，張雪萍，周學(xué)軍.丹皮酚自微乳的制備和評價[J].中成藥， 2012，34（5）：835-838.

[13] 劉璇，張振海，陳彥，等.秋水仙堿微乳的制備及體外經(jīng)皮滲透研究[J].中草藥，2011，42（10）：1963-1967.

[14] 楊樹俊，王浩.納米載體應(yīng)用于透皮給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（7）：546-553.

（收稿日期：2016-09-23）

（修回日期：2016-10-14；編輯：陳靜）