吳微 楊柳 徐翊

摘要：目的 觀察槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）-12內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討其作用機(jī)制。方法 CCK-8法檢測(cè)不同濃度槲皮素和/或TGF-β1干預(yù)HUVEC-12 72 h后細(xì) 摘要：目的 觀察槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）-12內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討其作用機(jī)制。方法 CCK-8法檢測(cè)不同濃度槲皮素和/或TGF-β1干預(yù)HUVEC-12 72 h后細(xì)胞活力；RT-PCR和免疫熒光雙染檢測(cè)內(nèi)皮及間質(zhì)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)變；Western blot檢測(cè)信號(hào)通路；RT-PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果 RT-PCR和免疫熒光雙染結(jié)果均提示，TGF-β1（10 ng/mL）連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高，內(nèi)皮標(biāo)記物降低；Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，槲皮素呈濃度依賴性抑制smad2/3的磷酸化；TGF-β1刺激后，下游調(diào)控內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均明顯升高，而100 μmol/L槲皮素則可顯著下調(diào)下游的5種轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)論 槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗纖維化的作用。

關(guān)鍵詞：槲皮素；內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；纖維化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）02-0065-05

胞活力；RT-PCR和免疫熒光雙染檢測(cè)內(nèi)皮及間質(zhì)標(biāo)記物的轉(zhuǎn)變；Western blot檢測(cè)信號(hào)通路；RT-PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果 RT-PCR和免疫熒光雙染結(jié)果均提示，TGF-β1（10 ng/mL）連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高，內(nèi)皮標(biāo)記物降低；Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，槲皮素呈濃度依賴性抑制smad2/3的磷酸化；TGF-β1刺激后，下游調(diào)控內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均明顯升高，而100 μmol/L槲皮素則可顯著下調(diào)下游的5種轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)論 槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗纖維化的作用。

關(guān)鍵詞：槲皮素；內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；纖維化

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）02-0065-05

心室重構(gòu)過(guò)程中會(huì)發(fā)生心肌間質(zhì)纖維化，而間質(zhì)纖維化的主要特點(diǎn)為細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積和間質(zhì)細(xì)胞如肌成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而導(dǎo)致心肌組織毛細(xì)血管密度降低，心室順應(yīng)性也降低，最終心肌順應(yīng)性下降，導(dǎo)致心力衰竭。研究顯示，抗纖維化治療可明顯改善心力衰竭患者預(yù)后，在心肌纖維化進(jìn)程中，除固有的成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生活化增殖外，內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、循環(huán)纖維細(xì)胞等均可通過(guò)一定機(jī)制轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可顯著改善心室重構(gòu)及心功能[1-2]。

槲皮素及其衍生物分布廣泛，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集、保護(hù)心血管功能以及抗病毒的作用[3]，具有抑制成纖維細(xì)胞增殖、抑制膠原合成、阻止氧化損傷、抑制血管生成等抗纖維化作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)觀察槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）-12內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物

槲皮素，購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度≥99%，貨號(hào)117-39-5。

1.2 細(xì)胞

HUVEC-12，YRGene（NC006）。37 ℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度鋪滿80%培養(yǎng)皿底時(shí)，采用0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代。對(duì)細(xì)胞采取刺激前，將培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM basic（1×）培養(yǎng)基、新生小牛血清（NBS）、胰酶，Gibco； CCK-8檢測(cè)試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；RT-PCR試劑盒，Roche；TGF-β1，PEPROTECH公司；ECGS，ScienCell公司；CD31、vimentin抗體，ABCAM公司；p-smad2、p-smad3、GAPDH，Cell Signaling Technology公司；smad2、smad3，Santa Curz公司；引物由上海生工合成。多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)Synergy HT（美國(guó)BioTek），恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO），紫外分光光度計(jì)NANODROP 2000c（Thermo scientific），RT反轉(zhuǎn)錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler（Applied Biosystems），實(shí)時(shí)定量PCR儀Light Lycler 480（美國(guó)Roche），倒置相差顯微鏡DP72（日本OLYMPUS）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞處理及分組

待HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，4 h后置換為含TGF-β1（10 ng/mL）無(wú)血清培養(yǎng)基，置于溫箱培養(yǎng)，12 h換液1次，72 h后收取蛋白質(zhì)和RNA樣本。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+槲皮素10 μmol/L組、TGF-β1+槲皮素50 μmol/L組、TGF-β1+槲皮素100 μmol/L組、槲皮素100 μmol/L組。

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

細(xì)胞被接種至96孔板中，每孔100 μL，密度為2×105個(gè)/mL，置于溫箱培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓6 h，干預(yù)72 h，將96孔板中培養(yǎng)基換為含有10 μL CCK-8無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)孵育2～2.5 h，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定光密度（OD）值。

2.3 RT-PCR檢測(cè)

細(xì)胞以不同因素處理后，棄去培養(yǎng)基，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定其含量與純度。取大約5 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃、2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃、40 s，25～35個(gè)循環(huán)；50～65 ℃、40 s，72 ℃、1 min，72℃、5 min，1個(gè)循環(huán)。

2.4 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，手機(jī)并提取蛋白。校正GAPDH后，每組以校正后體積進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，后將蛋白以100 V、90 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用一抗封閉液（1∶1000）進(jìn)行封閉，然后用TBST洗膜，一抗孵育過(guò)夜后加入相對(duì)應(yīng)的二抗（1∶5000）行顯色反應(yīng)。應(yīng)用Odyssey圖像分析軟件檢測(cè)各組蛋白的相對(duì)密度值作為蛋白表達(dá)水平，均以GAPDH作為內(nèi)參。

2.5 免疫熒光雙染檢測(cè)

干預(yù)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次，再以0.2%Triton通透細(xì)胞5 min，PBS漂洗3次，細(xì)胞爬片滴加25 μL 8%新生胎牛血清，置于濕盒內(nèi)，置于37 ℃溫箱中孵育1 h，濾紙將封閉液吸干，滴加含有CD31/vimentin的一抗稀液（1∶200），置于4 ℃冰箱過(guò)夜，將濕盒取出置于37 ℃溫箱復(fù)溫1 h，將細(xì)胞爬片從24孔中取出，置于防脫切片上，滴加含有2種不同顏色的二抗（1∶2000），室溫下避光孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI封片置于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩均數(shù)比較采用S-N-K法（方差齊）或Dunnett's T3（方差不齊）檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 槲皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-12細(xì)胞活力的影響

干預(yù)72 h后，10、50、100 μmol/L槲皮素及其與TGF-β1的混合液對(duì)HUVEC-12細(xì)胞活力與未加任何處理因素的對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.2 槲皮素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

槲皮素（10、50、100 μmol/L）與TGF-β1協(xié)同刺激HUVEC-12 72 h呈濃度依賴性抑制Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、纖維連接蛋白（fibronectin）的表達(dá)，同時(shí)呈濃度依賴性促進(jìn)CD31的表達(dá)，見(jiàn)表2。光鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組光鏡下表現(xiàn)為鋪路石樣，連接比較緊密，TGF-β1刺激72 h后細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為狹長(zhǎng)形，連接較松散，TGF-β1與槲皮素（100 μmol/L）共同刺激72 h，細(xì)胞形態(tài)又重新變?yōu)殇伮肥瘶?，連接較緊密，單用100 μmol/L槲皮素刺激72 h細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相似，見(jiàn)圖1。

5 討論

內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞在心肌纖維化中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞表型，表現(xiàn)出更多的間質(zhì)標(biāo)記物升高，而內(nèi)皮標(biāo)記物降低。Western blot結(jié)果顯示，槲皮素可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路以及其下游的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用。以上結(jié)果均提示，槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)揮抗纖維化的作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞失去上皮特性獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的一種生物現(xiàn)象，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞E-鈣黏蛋白、角蛋白等上皮標(biāo)記基因表達(dá)降低，vimentin、fibronectin、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)記基因表達(dá)升高。研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型和侵襲性，實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)，在種植部位，癌細(xì)胞通過(guò)間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化最終形成與原發(fā)灶形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的轉(zhuǎn)移灶，內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一種形式，近年來(lái)，隨著對(duì)器官纖維化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究逐步深入，內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化逐漸受到研究者的關(guān)注[6]。在器官纖維化進(jìn)展到一定階段時(shí)，小血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣珊头置诠δ芑钴S的成纖維細(xì)胞，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，完成內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)變。Zeisberg E M等[2]于2007年首次發(fā)現(xiàn)在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化中，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，對(duì)心肌纖維化起到一定的促進(jìn)作用，抑制內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化則可顯著改善心肌功能，表明內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)心肌纖維化具有重要作用。

本研究以TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12建立內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型，明確間質(zhì)微環(huán)境在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，明確內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程與信號(hào)通路之間關(guān)系，采用10 ng/mL TGF-β1連續(xù)刺激HUVEC-12 72 h，細(xì)胞形態(tài)由鋪路石樣轉(zhuǎn)化為狹長(zhǎng)形的成纖維細(xì)胞性狀，細(xì)胞之間的連接也從緊密連接轉(zhuǎn)換為松散連接，細(xì)胞間縫隙增大，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，間質(zhì)標(biāo)記物Collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、fibronectin均表達(dá)上調(diào)，而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31則表達(dá)下調(diào)，由此可以判斷TGF-β1可誘導(dǎo)HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而TGF-β1與槲皮素同時(shí)干預(yù)HUVEC-12 72 h則可呈濃度依賴性逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物，免疫熒光雙染結(jié)果也得到同樣結(jié)果。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞獲得具有遷移和侵襲能力間質(zhì)細(xì)胞的重要生物學(xué)過(guò)程。因而，闡明調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的分子機(jī)制，明確其在心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的病理意義，并探索基于內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子的診斷方法及靶向內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵分子的治療手段是心肌纖維化中內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制研究的關(guān)鍵問(wèn)題。

TGF-β1/Smads信號(hào)通路及其下游的一些轉(zhuǎn)錄因子在心臟內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這些包括snail和twist鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員以及ZEB家族[7-9]。本研究檢測(cè)了TGF-β1/smads信號(hào)通路及其下游的靶分子的表達(dá)，包括snail1、twist1、twist2、

其下游的靶分子snail1、twist1、twist2、ZEB1、ZEB2均表達(dá)上調(diào)，而TGF-β1與槲皮素（100 μmol/L）聯(lián)合作用時(shí)，則可顯著降低smad信號(hào)通路的磷酸化水平以及抑制其下游的靶分子。因此，我們認(rèn)為槲皮素可能通過(guò)抑制TGF-β1/smads信號(hào)通路以及其下游的靶分子表達(dá)抑制HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

槲皮素作用機(jī)制復(fù)雜，幾乎涉及組織器官纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié)：①抑制成纖維細(xì)胞增殖；②抑制膠原合成；③抗氧化損傷；④抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制血管形成；⑤影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，槲皮素可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HUVEC-12發(fā)生內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步探討槲皮素的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，本研究也探討了槲皮素對(duì)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用并鑒定其可能作用的信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子，但未能闡明其具體的作用機(jī)制，也未能在大體動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證，有待進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，明確其作用機(jī)制。

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（收稿日期：2016-03-01）

（修回日期：2016-03-26；編輯：華強(qiáng)）