勞文艷，畢婷婷，周艷麗，陳世杰，趙曉紅,?，刁 屹

（1.北京聯(lián)合大學(xué)功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，北京 100191；2. 北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

阿魏酸拮抗PM2.5對(duì)A549細(xì)胞線粒體的損傷作用

勞文艷1,2，畢婷婷1，周艷麗1，陳世杰1，趙曉紅1,2,?，刁 屹1

（1.北京聯(lián)合大學(xué)功能食品科學(xué)技術(shù)研究院，北京 100191；2. 北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

研究阿魏酸是否具有拮抗PM2.5致線粒體損傷作用及拮抗機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、PM2.5（240 μg/mL（損傷組和阿魏酸（80 mmol/L）保護(hù)組。通過MitoSOX Red特異性探針和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞線粒體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的含量；Annexin-V/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；JC-1染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化；活體細(xì)胞線粒體膜通道孔熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜通道孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的開放情況；Western blot法檢測(cè)caspase-3、caspase-9、含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）和過氧化物酶增殖體激活受體γ共激活因子-1α（subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α，PGC-1α）相關(guān)蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，PM2.5損傷組的細(xì)胞ROS含量、caspase-3和caspase-9表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率升高，線粒體膜電位和mPTP活性及PGC-1α、MnSOD的表達(dá)量降低；阿魏酸預(yù)處理后，顯著降低了PM2.5造成的A549細(xì)胞ROS的含量、細(xì)胞凋亡率及caspase-3和caspase-9表達(dá)量的升高，顯著升高了PM2.5致A549細(xì)胞線粒體的膜電位、mPTP的活性及PGC-1α和MnSOD表達(dá)量的降低。阿魏酸對(duì)PM2.5致A549細(xì)胞線粒體損傷具有明顯的保護(hù)作用。

阿魏酸；PM2.5；A549細(xì)胞；線粒體；損傷；保護(hù)作用

PM2.5引起心血管和呼吸系統(tǒng)疾病與其細(xì)胞毒性相關(guān)[1-2]。PM2.5能夠引起細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）等自由基大量生成、DNA損傷繼而擾亂細(xì)胞周期，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）等炎性信號(hào)通路引起炎癥因子大量生成，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者壞死[3]。已有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡與線粒體損傷有關(guān)[4]。PM2.5對(duì)心腦系統(tǒng)損傷過程中也發(fā)現(xiàn)有線粒體異常的現(xiàn)象[5]。由于線粒體特殊的結(jié)構(gòu)和功能，使其成為外界毒物刺激的敏感靶點(diǎn)。當(dāng)受到有害物質(zhì)的刺激后，線粒體結(jié)構(gòu)易發(fā)生損傷與功能障礙，進(jìn)而可能會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[5-6]，因而成為細(xì)胞毒性研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1與PM2.5共同作用于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）48 h，可以拮抗PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的下降[7]。Zhang Zhiguo等[8]分析了細(xì)顆粒物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBEC）的毒性，并對(duì)已知的姜黃素在人體內(nèi)的作用目標(biāo)蛋白進(jìn)行分析，建立兩個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用IPA（ingenuity pathways analysis）軟件進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)細(xì)顆粒物引起的健康危害具有潛在的拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)室前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PM2.5能夠造成中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞、人肺腺癌細(xì)胞株A549的氧化損傷、炎性損傷和DNA鏈斷裂[9-11]，而植物活性物質(zhì)阿魏酸可通過抗氧化、抗炎、抗DNA損傷作用發(fā)揮拮抗PM2.5對(duì)CHO細(xì)胞的保護(hù)作用[9,12]。但有關(guān)對(duì)A549細(xì)胞線粒體損傷作用的研究還少有報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)將從氧化應(yīng)激、線粒體內(nèi)途徑凋亡以及線粒體結(jié)構(gòu)和功能影響方面來研究阿魏酸拮抗PM2.5線粒體損傷作用及其機(jī)制，為生物活性物質(zhì)拮抗PM2.5致健康影響的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細(xì)胞株A549 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心；阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)GIBCO公司；10×胰蛋白酶（蛋白酶含量為2.5%）、線粒體超氧化物紅色熒光探針（MitoSOX red mitochondrial superoxide indicator ，MitoSOX Red） 美國(guó)Invitrogen公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 北京鼎國(guó)昌盛生物研究所；聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）日本DOJINDO公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Genview公司；活體細(xì)胞線粒體膜通道孔熒光檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Genmed公司；caspase-3及caspase-9多克隆抗體 美國(guó)CST公司；含錳金屬輔基的超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）、過氧化物酶增殖體激活受體γ共激活因子-1α（subunit of peroxisome proliferators- activated receptor-γ-coactivator-1α，PGC-1α）多克隆抗體 美國(guó)Abcam公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體 美國(guó)Santa公司；彩色預(yù)染Marker 美國(guó)Fermentas公司。

1.2 儀器與設(shè)備

大氣流量采樣器TH1000C型 中國(guó)武漢天虹儀表有限公司；瑞典Munktell超純石英纖維濾膜 北京賽福萊博科技有限公司；LYOVAC GT2-3真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)SRK公司；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；微板分光光度計(jì)MQX200 美國(guó)Bio-Tek公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、蛋白電泳轉(zhuǎn)移裝置 美國(guó)Bio-Rad公司；ImageQuant RT ECL凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 PM2.5采集與處理

采樣地點(diǎn)位于北京城區(qū)西四環(huán)內(nèi)的交通主干道旁的北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院教學(xué)樓6層頂，采用PM2.5大流量采樣器連續(xù)采樣22 h，采樣流量為1.05 m3/min，停機(jī)2 h為1 個(gè)采樣循環(huán)。采樣后的濾膜稱質(zhì)量后，放入潔凈的自封袋中，4 ℃避光保存。

將采樣后的濾膜剪成1 cm×1 cm大小，浸泡在去離子水中，用超聲振蕩器振蕩3 次，每次30 min，洗脫顆粒物。洗提液用6層紗布過濾，將濾液真空冷凍干燥使其成為干粉，－20 ℃冰箱中避光保存。使用時(shí)紫外照射30 min后，用滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配成5 mg/mL的PM2.5懸液，為保證懸液均勻，用前經(jīng)超聲振蕩10 min。

將繼續(xù)盤問制度界定為行政強(qiáng)制措施的觀點(diǎn)，最大的問題即是相對(duì)人有可能涉嫌的是犯罪行為，對(duì)于犯罪行為應(yīng)當(dāng)采取的是刑事強(qiáng)制措施，這是其無法包含在內(nèi)的情形。將繼續(xù)盤問制度界定為刑事強(qiáng)制措施也不符合法理，刑事強(qiáng)制措施必須要有法理明確的規(guī)定，在《刑事訴訟法》中并沒有規(guī)定繼續(xù)盤問。因此，無論是將繼續(xù)盤問制度界定為行政強(qiáng)制措施還是刑事強(qiáng)制措施都是不全面的。

1.3.2 分組及細(xì)胞處理

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、PM2.5損傷組和阿魏酸保護(hù)組。用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取PM2.5對(duì)細(xì)胞存活率大于80%的劑量（240 μg/mL）作為損傷劑量、阿魏酸具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的80 μmol/L作為拮抗損傷的實(shí)驗(yàn)劑量。取生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化成均勻的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/ mL，接種于6 孔培養(yǎng)板中，1 500 μL/孔，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。阿魏酸保護(hù)組加入80 μmol/L的阿魏酸預(yù)保護(hù)6 h，棄上清液，加入240 μg/mL PM2.5繼續(xù)作用20 h；PM2.5損傷組只加入240 μg/mL；空白對(duì)照組只加入等量的PBS。

1.3.3 ROS含量測(cè)定

細(xì)胞中加入2.5 μmol/L MitoSOX Red工作液1 mL，37 ℃避光孵育15 min，用37 ℃預(yù)熱的PBS洗去胞外的熒光探針，經(jīng)胰蛋白酶消化、PBS清洗、離心，用PBS重懸制成0.5 mL單細(xì)胞懸液，用200 目的篩網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞管內(nèi)，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體ROS含量。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS清洗離心后用500 μL的結(jié)合緩沖液（binding buffer）重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，用200 目濾網(wǎng)過濾，并轉(zhuǎn)移到流式管中，置冰上，然后加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），混勻。室溫避光孵育15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)流式圖計(jì)算出凋亡細(xì)胞占檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分率，即為細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

1.3.6 線粒體膜通道孔開放活性檢測(cè)

根據(jù)試劑盒說明書加載熒光探針，通過熒光分光光度計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，散發(fā)波長(zhǎng)505 nm）的熒光變化，檢測(cè)細(xì)胞線線粒體膜通道孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）開放活性的變化情況。

1.3.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

細(xì)胞用裂解液在冰上裂解30 min；刮下底部細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，4 ℃條件下13 000 r/min離心15 min。收集上清液，部分上清液用5×上樣緩沖液按體積比4∶1的比例混合均勻，100 ℃煮5 min，置于－80 ℃冰箱內(nèi)保存。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各樣品的蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)測(cè)得的質(zhì)量濃度計(jì)算各樣品的上樣體積，并做好記錄。蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，按試劑盒提供的方法進(jìn)行一抗、二抗孵育。加上顯色液，利用Image Quant RTECL凝膠成像系統(tǒng)，獲取目標(biāo)蛋白條帶的圖像；用Quantity One軟件分析得到蛋白條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果計(jì)算時(shí)，蛋白相對(duì)表達(dá)量按照目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白β-肌動(dòng)蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸對(duì)PM2.5引起A549細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

表1 阿魏酸對(duì)PM2.5引起A549細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用（n=3）Table1 Protective effect of FA on PM2.5-induced oxidative stress in A549 cellllss (n=3) %

由表1可見，PM2.5作用A549細(xì)胞后能引起線粒體ROS的含量明顯增高，與空白對(duì)照組比較具有極顯著差異（P＜0.01）；而阿魏酸可明顯拮抗PM2.5造成的A549細(xì)胞線粒體ROS含量的上升，與PM2.5損傷組比較具有極顯著差異（P＜0.01）；與空白對(duì)照組相比，PM2.5可顯著降低PGC-1α的表達(dá)量（P＜0.05），阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549細(xì)胞PGC-1α表達(dá)量的降低，與PM2.5損傷組比較具有顯著差異（P＜0.05）；與空白對(duì)照組相比，PM2.5作用可顯著降低MnSOD的表達(dá)量（P＜0.05），阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549細(xì)胞MnSOD表達(dá)量的降低，與PM2.5損傷組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。以上結(jié)果說明，阿魏酸可以對(duì)PM2.5引起的細(xì)胞線粒體氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，ROS水平的降低與細(xì)胞PGC-1α通路活性的降低及線粒體抗氧化蛋白MnSOD表達(dá)的增加有關(guān)。

2.2 阿魏酸抑制PM2.5誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

表2 阿魏酸拮抗PM2.5引起A549細(xì)胞的凋亡（n=3）Table2 Protective effect of FA on PM2.5-induced apoptosis and related protein expression in A549 cells (n=3)%

由表2可見，PM2.5處理A549細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，與空白對(duì)照組比較具有極顯著差異（P＜0.01）；阿魏酸可拮抗PM2.5誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡，與PM2.5損傷組比較細(xì)胞凋亡率降低，具有極顯著差異（P＜0.01）；與空白對(duì)照組相比，PM2.5處理的A549細(xì)胞caspase-3和caspase-9的表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），而阿魏酸可拮抗PM2.5造成的A549細(xì)胞caspase-3和caspase-9的表達(dá)量增加，與PM2.5損傷組比較具有極顯著的降低作用（P＜0.01）。

以上結(jié)果說明，阿魏酸可以抑制PM2.5誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡率增加，其作用機(jī)制與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。

2.3 阿魏酸對(duì)PM2.5引起A549細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)功能改變的保護(hù)作用

表3 阿魏酸對(duì)PM2.5引起A549細(xì)胞線粒體膜電位和mPTP開放活性改變的保護(hù)作用（n==33）Table3 Protective effect of FA on PM2.5-induced changes in mitochondrial membrane potential and mPTP activity in A549 celllss ((n == 33))

由表3結(jié)果顯示，PM2.5處理可明顯降低A549細(xì)胞線粒體mPTP活性和線粒體膜電位，與空白對(duì)照組比較均具有極顯著性差異（P＜0.01）；而阿魏酸可拮抗PM2.5造成的mPTP開放活性和由此引起的線粒體膜電位下降，與PM2.5損傷組比較具有顯著（P＜0.05）和極顯著差異（P＜0.01）。

以上結(jié)果說明，阿魏酸可以抑制PM2.5引起的mPTP開放，從而抑制線粒體膜電位下降，具有明顯的細(xì)胞保護(hù)作用。

3 討 論

3.1 PM2.5對(duì)線粒體的損傷作用

細(xì)胞暴露于PM2.5后，ROS的含量顯著增加、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）的濃度升高，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系[13]。PM2.5在刺激ROS、NO含量增加的同時(shí)，還抑制機(jī)體抗氧化反應(yīng)體系，抑制細(xì)胞內(nèi)SOD、MnSOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低細(xì)胞清除ROS的能力，從而使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[13-14]。ROS 可激活受體PGC-1α通路，繼而誘導(dǎo)MnSOD等線粒體抗氧化蛋白的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞與線粒體免于氧化損傷[15]。PGC-1α是外界因素對(duì)線粒體損傷作用的重要的保護(hù)機(jī)制，是一個(gè)輔助轉(zhuǎn)錄因子，控制能量代謝相關(guān)基因[16]。當(dāng)細(xì)胞受到外界因素的刺激，細(xì)胞線粒體能量代謝穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，激活PGC-1α的表達(dá)抵抗外界因素對(duì)細(xì)胞的損傷，當(dāng)刺激達(dá)到一定程度時(shí)就會(huì)抑制PGC-1α的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞和線粒體造成損傷[17]。本研究的結(jié)果也顯示PM2.5處理的A549細(xì)胞ROS含量明顯增加，進(jìn)一步抑制了PGC-1α和MnSOD的表達(dá)。

研究表明，人類呼吸道上皮細(xì)胞暴露于顆粒物后，可以激活一系列磷酸化，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等相關(guān)炎性因子基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[18]。炎性因子TNF-α與線粒體膜電位變化有明顯的相關(guān)性，且可以激活caspase家族，引起細(xì)胞凋亡[19]，本此研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相一致。馮哲偉[20]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡的早期，烹調(diào)油煙可誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換，激活caspase-9和caspase-3，最終引起細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究經(jīng)PM2.5處理的A549細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的表達(dá)量顯著升高。

已有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體外膜上的電位依賴性陰離子通道（potential dependent anion channel，VDAC），在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡過程中扮演重要角色[21-22]。Ca2＋通過VDAC表面存在Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控mPTP的開放[23]。PM2.5可以升高細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度[24]。線粒體內(nèi)高水平的Ca2＋和過度氧化應(yīng)激是導(dǎo)致mPTP大量開放的主要因素[25-26]，mPTP開放會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位迅速降低，引起鈉、鉀、鈣等離子平衡失調(diào)，線粒體腫脹功能紊亂及結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[27-29]。本研究以A549細(xì)胞為研究對(duì)象，得到了相似結(jié)果：經(jīng)PM2.5處理的細(xì)胞，ROS的生成量顯著增加，使mPTP開放，導(dǎo)致膜電位下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

3.2 阿魏酸拮抗PM2.5的損傷作用

有關(guān)植物活性物質(zhì)拮抗PM2.5的損傷作用的研究報(bào)道相對(duì)較少。研究發(fā)現(xiàn)，VE對(duì)由PM2.5引起的大鼠肺組織細(xì)胞的氧化性損傷具有一定的拮抗作用，大鼠口服VE后肺泡灌洗液中的氧化性指標(biāo)乳酸脫氫酶、MDA、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶水平有所下降[30]。N-乙酰半胱氨酸對(duì)PM2.5造成的大鼠肺損傷也具有保護(hù)作用，通過抑制由PM2.5激活的NF-κB信號(hào)通路，提高了大鼠的抗氧化能力，同時(shí)降低了血清和肺組織中炎性因子的表達(dá)[31]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)人肺成纖維細(xì)胞用單細(xì)胞凝膠電泳方法研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素具有很好的拮抗PM2.5 DNA損傷的作用[32]；通過對(duì)CHO細(xì)胞凋亡相關(guān)通路以及遺傳毒性相關(guān)通路的研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸、綠原酸、葒草素具有拮抗PM2.5凋亡和遺傳毒性的保護(hù)作用，其中以阿魏酸的保護(hù)作用最強(qiáng)[9-10]。

在針對(duì)PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的線粒體損傷作用及損傷機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了天然植物活性物質(zhì)阿魏酸拮抗PM2.5線粒體損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，阿魏酸能夠顯著的保護(hù)PM2.5引起的細(xì)胞增殖毒性作用，保護(hù)機(jī)制與清除自由基、抗氧化有關(guān)[9]。由本研究結(jié)果可以看出80 μmol/L的阿魏酸能有效地拮抗PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的增殖毒性作用，在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸不僅可以減少線粒體內(nèi)ROS的含量、激活被抑制的PGC-1α通路、促進(jìn)MnSOD的表達(dá)，還能有效地抑制mPTP的開放和線粒體膜電位的下降，以及通過抑制caspase-9介導(dǎo)的線粒體內(nèi)途徑引起的細(xì)胞凋亡。

目前對(duì)PM2.5的研究多集中于在細(xì)胞毒性水平上的研究，而針對(duì)早期線粒體毒性的研究及植物活性物質(zhì)拮抗作用的研究相對(duì)較少。本研究證實(shí)植物活性單體物質(zhì)具有較好的拮抗PM2.5線粒體毒性的作用，其保護(hù)機(jī)理與抗氧化、保護(hù)mPTP以及抑制線粒體內(nèi)途徑介導(dǎo)的凋亡相關(guān)，而線粒體損傷機(jī)制中關(guān)于線粒體分裂融合的研究比較少，因此在以后的研究中應(yīng)該繼續(xù)在對(duì)PM2.5對(duì)線粒體分裂融合方面進(jìn)行深入研究。并且，除了對(duì)PM2.5的損傷機(jī)理研究外，更應(yīng)該集中于如何治理PM2.5污染和尋找有效的拮抗物質(zhì)來預(yù)防和保護(hù)人類健康等領(lǐng)域。

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Protective Effect of Ferulic Acid on PM2.5-Induced Mitochondrial Damage in A549 Cells

LAO Wenyan1,2, BI Tingting1, ZHOU Yanli1, CHEN Shijie1, ZHAO Xiaohong1,2,?, DIAO Yi1
(1. Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China; 2. Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

In this study, we examined whether ferulic acid (FA) could protect against PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells and explored the underlying mechanism. The cells were treated with PM2.5 (240 μg/mL) with and without the addition of 80 mmol/L FA. The contents of reactive oxygen species (ROS) were determined by fl ow cytometry using MitoSOX Red specific probe. Apoptosis was detected by flow cytometry with Annexin-V/PI method. Mitochondrial membrane potential was detected by fl ow cytometry with JC-1 staining. The activity of mitochondrial membrane channel pore was tested by mitochondrial permeability transition pore (mPTP) kit. The expression of caspase-3, caspase-9, manganese superoxide dismutase (MnSOD), and peroxisome proliferators-activated receptor-γ-coactivator-1α (FGC-1α) were detected by Western blotting. The results showed that, compared with the blank control group, the level of ROS and the expression of caspase-3 and caspase-9 in mitochondria, as well as the apoptosis rate of A549 cells induced by PM2.5 were increased. The membrane potential and the activity of mPTP in mitochondria of A549 cells induced by PM2.5 were decreased as well as the expression of PGC-1α and MnSOD. The pre-treatment of FA could prevent the increased mitochondrial ROS, apoptosis rate and expression of caspase-3 and caspase-9, and the decreased mitochondrial membrane potential, mPTP activity, and expression of PGC-1α and MnSOD caused by PM2.5. Therefore, FA had a signif i cant protective effect on PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells.

ferulic acid; PM2.5; A549 cells; mitochondria; damage; protective effect

10.7506/spkx1002-6630-201703032

R994.6

A

1002-6630（2017）03-0195-06

2016-06-29

中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)營(yíng)養(yǎng)科研基金-帝斯曼專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（2015-030（CNS-DSM））；北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（Zk70201501）

勞文艷（1970—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事功能食品研究。E-mail：laowenyan@buu.edu.cn

?通信作者：趙曉紅（1961—），女，研究員，博士，主要從事環(huán)境與食品毒理學(xué)研究。E-mail：xiaohong@buu.edu.cn

勞文艷, 畢婷婷, 周艷麗, 等. 阿魏酸拮抗PM2.5對(duì)A549細(xì)胞線粒體的損傷作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3)： 195-200. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703032. http：//www.spkx.net.cn

LAO Wenyan, BI Tingting, ZHOU Yanli, et al. Protective effect of ferulic acid on PM2.5-induced mitochondrial damage in A549 cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 195-200. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703032. http：// www.spkx.net.cn