孫婷婷，李妍妍，周 君，張迪駿，李 曄，張春丹，何 珊，黃忠白，蘇秀榕,?

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.康奈爾大學農業(yè)與生命科學學院，美國 紐約州 伊薩卡 14850）

金槍魚胰臟酶解多肽對db/db糖尿病小鼠腎臟的保護作用

孫婷婷1，李妍妍2，周 君1，張迪駿1，李 曄1，張春丹1，何 珊1，黃忠白1，蘇秀榕1,?

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.康奈爾大學農業(yè)與生命科學學院，美國 紐約州 伊薩卡 14850）

目的：研究金槍魚胰臟酶解多肽對db/db糖尿病小鼠體質量、血清胰島素、糖化血紅蛋白、血脂的影響，為進一步開發(fā)金槍魚胰臟、研制新型保健型食品提供理論依據。方法：雄性Db/m小鼠為空白對照組，雄性db/db小鼠30 只，分為模型對照組、陽性藥組（甲基巴多索隆9.75 mg/（kg·d））、實驗組，實驗組灌胃金槍魚胰臟酶解多肽（50 mg/（kg·d））。10 周后測定各組小鼠體質量、血清胰島素、糖化血紅蛋白、血脂水平等指標。利用基因芯片技術，比較不同組間腎臟基因的表達水平。結果：與模型對照組相比，實驗組能顯著降低糖尿病小鼠的體質量、血清胰島素、糖基化血紅蛋白水平；降低總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平，升高高密度脂蛋白膽固醇水平。并且，與模型對照組的差異表達比較，實驗組基因表達水平有顯著改變，獲得差異基因678 個，其中161 個上調，517 個下調。結論：金槍魚胰臟酶解多肽可以改善db/db糖尿病小鼠的體質量、血清胰島素、糖化血紅蛋白、血脂水平，其作用效應可能與其下調醛固酮合成相關基因CYP11B1的表達水平有關。

金槍魚胰臟；酶解多肽；糖尿?。籨b/db小鼠；CYP11B1

金槍魚（Thunnus thynnus），屬脊索動物門（Chordata），硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），鯖科（Scombridae），魚類中具有胸甲（指胸區(qū)和側線前部明顯擴大的鱗片）的幾個屬魚類的總稱[1]。金槍魚肉質鮮嫩，富含蛋白質、脂肪、維生素和微量元素，是國際健康學會推薦的健康美食。金槍魚一般制成冷凍魚肉、壽司或罐裝食品，附加值非常高，但在加工過程中產生大量廢棄物，如魚頭、魚骨、內臟等[2]。金槍魚的腮肌已退化，若停止游泳會因為缺氧窒息而死。因此金槍魚必須不停地游動，使新鮮水流流過腮部獲得氧氣。為了補充不斷游動及旺盛的新陳代謝所消耗的能量金槍魚不斷進食，其胰腺十分發(fā)達，以加快糖在體內的分解速率，從而滿足其在突發(fā)性運動時對化學能量的需求。胰臟作為金槍魚主要的消化腺，約占內臟比例的27%[3]。胰臟是高等動物體內具有分泌功能的實體性腺體，含有蛋白質、胰酶、激素、多肽、氨基酸、核苷酸、脂類、多糖等活性物質[4-6]。

糖尿病是一組由于胰島素分泌不足或（和）胰島素作用低下而引起的代謝性疾病，高血糖是其特征，而長期的高血糖將導致多種器官的損害、功能紊亂和衰竭，尤其是糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見的慢性并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中20%～40%會發(fā)生。在歐美，DN是引發(fā)終末期腎病的首要原因。其發(fā)病機制雖未完全闡明，但糖代謝紊亂引起多元醇通路、蛋白激酶C、晚期糖基化產物、己糖胺4 種途徑的激活、腎臟血流動力學改變、氧化應激、多種細胞因子以及遺傳背景均起重要作用[7-8]。

本實驗以高血糖、高胰島素、高脂血癥為特點的自發(fā)性Ⅱ型糖尿病db/db小鼠為模型，探究金槍魚胰臟酶解多肽對糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料、小鼠與試劑

金槍魚胰臟取自寧波今日食品有限公司。

db/db小鼠（36±2.0）g，雄性，30 只；Db/m小鼠（25±1.0）g，雄性，10 只，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2007-0005（編號：2007000528007）。

小鼠8*60K表達譜芯片、基因芯片雜交試劑 美國Agilent公司；總RNA提取的Trizol試劑 美國Invitrogen公司；mRNA純化試劑盒 美國Promega公司；小鼠胰島素酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海依科賽生物制品有限公司；小鼠體質量、胰島素、糖化血紅蛋白試劑盒南京建成生物工程研究所；總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterin，LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterin，HDL-C）試劑盒 寧波溢美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

H1650型高速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；7020全自動生化分析儀 日本日立儀器公司；DNA微陣列掃描儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與飼養(yǎng)

10 只雄性Db/m小鼠為空白對照組；雄性db/db小鼠30只，按體質量隨機分成模型對照組、陽性藥組（9.75 mg/（kg·d））、實驗組（50 mg/（kg·d）），每組10 只。陽性藥為甲基巴多索隆（CDDO-Me），已用于Ⅱ型糖尿病4期的治療[9]。實驗組灌胃金槍魚胰臟酶解多肽[6]?？瞻讓φ战M與模型對照組灌以等量去離子水。實驗期間，各組自由進食水，室溫保持25 ℃左右，光照晝夜間隔12 h，給藥時間為10 周。每天觀察動物的精神狀態(tài)、反應、行為活動、排便情況、眼睛及孔道分泌物、毛色及清潔度等。攝食量、體質量變化情況每隔3 d測定1 次，以調整灌胃劑量。

1.3.2 血液生理生化指標檢測

第69天末次給藥后，禁食、禁水24 h，第70天處死，測定體質量后取樣。各組小鼠用質量分數2%戊巴比妥鈉（25 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，其中800 μL全血用乙二胺四乙酸抗凝，3 500 r/min離心15 min，制得血漿，用于檢測糖化血紅蛋白含量。剩余全血，3 000 r/min離心10 min，制得血清，采用全自動生化分析儀測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。采用ELISA測定小鼠血清胰島素。

1.3.3 表達譜基因芯片篩選差異基因

1.3.3.1 RNA的提取和cDNA的制備

取小鼠腎臟100 mg，液氮研磨后用Trizol一步法提取總RNA，定量及質量檢測后純化RNA。反轉錄成cDNA、熒光標記cDNA后純化、檢測濃度和熒光標記量。

1.3.3.2 雜交和芯片掃描

標記的DNA溶于雜交液中，于65 ℃、10 r/min滾動雜交17 h。芯片洗滌、干燥后利用DNA微陣列掃描儀，在分辨率為5 μm，掃描儀自動以100%和10% PMT各掃描1 次，兩次結果利用軟件合并。以特征提取軟件讀取原始數據，并進行背景值修正和分位數標準化處理，將標準化后的數據導入GeneSpring GX v11.5.1軟件，比較兩組樣品間標準化值，計算差異倍數，并對其取對數。篩選差異倍數≥2的基因作為顯著差異基因，即log2（Cy3強度）≥2.0者為表達顯著上調基因，log2（Cy3強度）≤－2.0者為表達顯著下調基因。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 金槍魚胰臟酶解多肽對動物生活狀態(tài)的影響

空白對照組小鼠狀態(tài)良好，活動靈活，反應敏捷，被毛有光澤，飲水量和進食量均正常，體質量逐漸增加。與空白對照組比較，模型對照組小鼠活動量明顯減少，體質量減輕，多尿癥狀明顯，被毛發(fā)黃蓬松稀疏。與模型對照組比較，實驗組小鼠活動量有所增加，體質量減輕緩慢，尿量減少，糖尿病癥狀得到緩解。

2.2 金槍魚胰臟酶解多肽對小鼠體質量、血清胰島素和糖化血紅蛋白的影響

表1 胰臟酶解液對小鼠體質量、血清胰島素及糖化血紅蛋白的作用Table1 Effect of enzymatic hydrolysate derived from tuna pancreas on BW, FINS and HbAlc in mice

由表1可見，與空白對照組比較，模型對照組小鼠體質量顯著上升（P＜0.01），陽性藥組和實驗組小鼠體質量與模型對照組差異極其顯著（P＜0.01），其中陽性藥組小鼠體質量大于實驗組而小于模型對照組。模型對照組血清胰島素水平顯著高于空白對照組（P＜0.01），陽性藥組和實驗組分別與模型對照組差異極其顯著（P＜0.01）。模型對照組糖化血紅蛋白水平高于空白對照組（P＜0.05），陽性藥組與模型對照組差異極其顯著（P＜0.01），實驗組與模型對照組差異不顯著（P＞0.05），原因可能是胰臟多肽對糖化血紅蛋白的作用不明顯。

2.3 金槍魚胰臟酶解多肽對小鼠血脂的影響

表2 胰臟酶解液對小鼠血脂的影響Table2 Effect of enzymatic hydrolysate derived from tuna pancreas on serum lipid levels in mice

如表2所示，與空白對照組相比，模型對照組血清TC、TG、LDL-C水平極顯著升高（P＜0.01），HDL-C含量極顯著降低（P＜0.01）。相比模型對照組，陽性藥組和實驗組血清中TC含量降低（P＞0.05）；陽性藥組和實驗組血清中TG含量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；陽性藥組和實驗組血清中LDL-C含量降低（P＜0.05，P＞0.05），其中實驗組對LDL-C的作用效果不明顯；陽性藥組和實驗組血清中HDL-C含量顯著升高（P＜0.05）。陽性藥組和實驗組均能顯著降低LDL-C含量與HDL-C含量比值（P＜0.01，P＜0.05）。

2.4 小鼠基因表達的差異

2.4.1 RNA的質量

在瓊脂糖凝膠電泳中的28S是18S的2 倍，且未出現核糖體RNA帶的彌散，無降解現象，比值范圍在1.8～2.1，說明其質量已經能滿足實驗要求，見圖1。

圖1 小鼠腎總RNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis of total RNA derivded from mouse kidney

2.4.2 芯片雜交體系驗證及基因表達譜

利用非監(jiān)督聚類的等階聚類方法做比較分析后，用基因分布的火山圖展示了實驗組小鼠和模型對照組小鼠的RNA表達差異。A區(qū)域為上調基因，B區(qū)域為下調基因，其他區(qū)域為相同基因（表3、圖2）。表3為實驗組和模型對照組部分差異基因。

表3 實驗組和模型對照組部分差異表達基因Table3 Partial differentially expressed genes in the mice from the model control and experimental groups

圖2 小鼠腎基因分布的火山圖Fig.2 Volcano plots of gene distribution in mouse kidney

利用SAM進行分析，模型對照組和實驗組區(qū)分度高，存在顯著的差異。芯片結果顯示，模型組和實驗組比較，獲得差異基因678 個，其中161 個上調，517 個下調。通過基因倍數變化的log2值，可以看出上調基因中有145 個變化值：2＞log2的變化值＞1，即4＞基因上調倍數＞2；下調基因中有357 個變化值：－1＞log2的變化值＞－2，即4＞基因下調倍數＞2（圖3）。

圖3 差異基因分布情況Fig.3 Distribution of differentially expressed genes

2.4.3 差異基因的功能注釋和代謝通路分析

差異基因的GO分析顯示，在生物學過程分析中，實驗組與調控相關的基因31%，與新陳代謝相關的基因17.8%，與信號傳遞有關的基因6.9%；下調基因與調控相關的基因16.2%，與類固醇相關的基因9.9%，與離子運輸有關的基因11.7%。細胞組分分析中，實驗組上調與細胞器相關的基因39.3%，蛋白質等其他大分子復合物為12.1%；下調與細胞器相關的基因40.8%，細胞外基質為51.3%。分子功能過程分析中，實驗組上調有催化活性的基因為44.8%，蛋白質等其他大分子復合物為24.1%；下調有催化活性的基因63.4%，離子運輸相關4%。db/db糖尿病與許多基因表達之間存在廣泛的作用，而這些基因中含有某些關鍵代謝酶的密碼，往往可以控制新陳代謝途徑中關鍵酶的表達，從而對整個新陳代謝產生影響。食用金槍魚胰臟酶解液后，小鼠與催化功能相關的基因變化非常明顯，與調控相關的基因次之（圖4）。

圖4 差異基因GO分析Fig.4 Gene ontology of differentially expressed genes

圖5 差異基因的KEGG代謝通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

KEGG代謝通路分析顯示，差異基因一共參與了13 個代謝通路，主要涉及了相關蛋白合成相關的通路，包括胰腺分泌、蛋白質的消化吸收、酪氨酸代謝，以及相關大分子物質分泌合成的一系列通路，包括類固醇激素的生物合成、膽汁分泌、維生素的消化吸收（圖5）。

3 討 論

實踐證明生物體內代謝酶的活性和濃度會因為不同的營養(yǎng)條件而存在較大的差異，這主要是由于食物中的營養(yǎng)物質影響了基因的表達[10]。當某種營養(yǎng)素缺失或過多時，在分子水平上表現為某個或某些基因的開放、關閉或表達量的變化，雖然動物的遺傳特征不會因為營養(yǎng)素而改變，但它可以通過啟動或終止一些基因的表達而改變遺傳特征出現的時間框架。胰臟含有蛋白質、胰島素、胰酶、激素、多肽、氨基酸、多糖等多種活性物質，因酶的選擇性作用，在酶解過程中保留部分活性，且便于生命體吸收[11-12]。

3.1 對糖尿病小鼠體質量、胰島素和糖化血紅蛋白的影響

目前認為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結果，而環(huán)境因素中由生活方式導致的肥胖對T2DM的發(fā)生和發(fā)展有很大影響[13-14]。我國糖尿病發(fā)病率連年攀升，與近幾年我國肥胖發(fā)病率連年上升密不可分，T2DM病人中，80%有肥胖史[15]。本實驗以db/db小鼠為模型，給藥10 周后測體質量，探討金槍魚胰臟多肽對糖尿病小鼠體質量的影響，結果發(fā)現胰臟多肽對db/db小鼠體質量有顯著降低作用。

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的主要特征之一，為了調節(jié)血糖在正常水平，機體分泌過多胰島素，即高胰島素血癥，從而導致機體一系列病理變化[16-17]。目前治療IR的藥物多為西藥[18]。本實驗模型對照組出現明顯的胰島素抵抗，血清胰島素水平明顯高于空白對照組。相比模型對照組，實驗組血清胰島素水平顯著降低?？梢姡饦岕~胰臟多肽可明顯緩解db/db小鼠胰島素抵抗。

血液中紅細胞內的血紅蛋白與血糖結合的產物是糖化血紅蛋白，其結合生成糖化血紅蛋白是不可逆過程，并與血糖濃度成正比[19]。2010年1月國際專家委員會發(fā)表聲明將糖化血紅蛋白作為糖尿病診斷指標，確定糖化血紅蛋白水平≥6.5%為診斷切點，這也進一步確定了糖化血紅蛋白在糖尿病診斷史上的地位[20-21]?？崭寡撬脚c糖化血紅蛋白水平呈正相關，糖化血紅蛋白是糖尿病診斷良好的補充，空腹血糖結果易浮動，糖化血紅蛋白結果較穩(wěn)定[22]。本實驗模型組糖化血紅蛋白水平顯著升高，相比模型對照組，實驗組糖化血紅蛋白水平降低（不顯著）?？梢?，金槍魚胰臟酶解肽可降低db/db小鼠糖化血紅蛋白。

3.2 對糖尿病小鼠血脂的影響

糖尿病一般伴隨脂代謝異常，即血清TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低。本實驗模型對照組出現明顯的脂代謝異常，TC、TG、LDL-C含量均明顯高于空白對照組（P＜0.01），HDL-C含量極顯著降低（P＜0.01）。相比模型對照組，實驗組T G含量均顯著降低（P＜0.05），HDL-C含量升高（P＜0.05）。此外，實驗組可有效降低動脈硬化指數（LDL-C含量/HDL-C含量），說明金槍魚胰臟酶解肽有調節(jié)糖尿病小鼠血脂紊亂的作用。3.3 基因表達

喂食金槍魚胰臟肽的db/db小鼠基因表達出現了明顯的變化，實驗組相對于模型對照組下調的基因數量明顯多于上調基因的數量，差異基因包括能量代謝相關、糖代謝、細胞生長、合成及分解代謝、信號傳遞因 子等。

醛固酮是體內最重要、作用最強的鹽皮質激素，以往一直認為醛固酮僅由腎上腺皮質球狀帶分泌，主要作用于腎，起滯鈉排鉀的作用，這是醛固酮的經典效應。最近越來越多的研究發(fā)現醛固酮水平除受血管緊張素Ⅱ、促腎上腺皮質激素、血鉀、體位、生物節(jié)律等因素影響外，更與醛固酮合成酶的活性相關[23-24]。醛固酮是維持心血管結構與功能重要的神經體液因子，能夠調節(jié)腎臟血液流量和腎小球濾過率，動物實驗發(fā)現醛固酮有促進腎臟纖維化的作用[25-26]?，F有的資料分析認為，除了低鉀血癥導致的胰島素分泌受損和胰島素敏感性下降外，體內過高的醛固酮對胰島素作用所產生的直接效應可能是導致糖尿病更主要的因素[27-28]。體內醛固酮是由膽固醇在一系列酶的催化作用下，經過孕烯醇酮、黃體酮等中間產物最終生成。該過程涉及兩個重要基因：CYP11B1（醛固酮合酶1）和CYP11B2（醛固酮合酶2）。過去認為，CYP11B1基因只能編碼類固醇11β-羥化酶，調控皮質類固醇的生物合成。但研究表明[29-30]，CYP11B1基因也編碼21-羥化酶，參與調控醛固酮合成的早期階段。本實驗基因芯片結果顯示喂食金槍魚胰臟酶解多肽的db/db糖尿病小鼠CYP11B1基因下調明顯（10 倍），故可推斷醛固酮合成早起階段的關鍵酶21-羥化酶合成減少，故醛固酮合成受到抑制，進而緩解小鼠糖尿病病癥。

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Protective Effect of Enzymatic Hydrolysate of Tuna Pancreatic Proteins on Kidney in db/db Diabetic Mice

SUN Tingting1, LI Yanyan2, ZHOU Jun1, ZHANG Dijun1, LI Ye1, ZHANG Chundan1, HE Shan1, HUANG Zhongbai1, SU Xiurong1,?
(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, Ithaca 14850, USA)

The present study aimed to evaluate the effect of peptides produced by enzymatic hydrolysis of tuna pancreatic proteins on body weight, fasting serum insulin (FINS), glycated hemoglobin (HbA1c), and serum lipid levels of db/db diabetic mice for the purpose of providing theoretic evidence for the development of new healthy foods from tuna pancreas. Methods： Ten male Db/m mice were used as blank control group. A total of 30 male leptin gene knockout db/db mice were divided into model control group, positive drug control group and experimental group. The mice in the experimental group were gavaged with the peptides derived from tuna pancreatic proteins. After 10 weeks, the body weight, FINS, HbA1c, and serum lipid biochemical indexes in all groups of mice were examined. The gene expression levels in the kidney were evaluated using gene chip technology. Results： In comparison with the control group, the experimental group demonstrated a significant decrease in body weight, FINS, HbA1c, serum total cholesterol, triglyceride and low-density lipoprotein cholesterol levels and an obvious increase in high-density lipoproteincholesterol. The gene expression levels in experimental group were also significantly different from those in the control group. A total of 678 differentially expressed genes were found, 161 of which were up-regulated and 517 of which were down-regulated. Conclusion： The peptides derived from tuna pancreatic proteins by enzymatic hydrolysis can effectively control body weight, FINS, HbA1c and serum lipid levels in db/db diabetic mice, likely by decreasing the expression of aldosterone synthase gene (CYP11B1).

tuna pancreas; enzymatic hydrolysate; diabetes; db/db mice; CYP11B1

10.7506/spkx1002-6630-201703030

TS201.4

A

1002-6630（2017）03-0182-06

2016-04-04

海洋經濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項目（2013710）；寧波市科技局農業(yè)與社發(fā)重大科技項目（2010C10040）；寧波市教育局重點學科資助項目

孫婷婷（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品功能。E-mail：suntingting0320@126.com

?通信作者：蘇秀榕（1956—），女，教授，博士，研究方向為食品安全、生物與分子生物學。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn

孫婷婷, 李妍妍, 周君, 等. 金槍魚胰臟酶解多肽對db/db糖尿病小鼠腎臟的保護作用[J]. 食品科學, 2017, 38(3)：182-187. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703030. http：//www.spkx.net.cn

SUN Tingting, LI Yanyan, ZHOU Jun, et al. Protective effect of enzymatic hydrolysate of tuna pancreatic proteins on kidney in db/db diabetic mice[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 182-187. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703030. http：//www.spkx.net.cn