張路路，石 婷，朱夢(mèng)婷，陳 奕?

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

黑靈芝多糖對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

張路路，石 婷，朱夢(mèng)婷，陳 奕?

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

目的：研究黑靈芝多糖對(duì)丙烯酰胺（acrylamide，AA）所致的小腸上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法：構(gòu)建AA誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）-6氧化損傷型，采用噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)黑靈芝多糖對(duì)IEC-6氧化損傷的保護(hù)作用；同時(shí)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的漏出量，以及測(cè)定細(xì)胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdelyde，MDA）水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的黑靈芝多糖對(duì)細(xì)胞增殖影響無(wú)顯著性差異。與模型（AA）組相比，不同質(zhì)量濃度的黑靈芝多糖溶液能夠明顯減輕AA對(duì)細(xì)胞的毒害作用，提高細(xì)胞生存率，降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的釋放；降低MDA含量，提高細(xì)胞SOD和GSH-Px活性。結(jié)論：黑靈芝多糖可以通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的活性和抗氧化物質(zhì)GSH-Px活性從而有效地減弱AA誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞氧化損傷。

黑靈芝多糖；丙烯酰胺；IEC-6；氧化損傷

丙烯酰胺（acrylamide，AA）是人們廣泛接觸的一種重要工業(yè)化合物，最初作為合成聚AA的化學(xué)單體，廣泛應(yīng)用于污水處理、造紙工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)藥和染料等多種行業(yè)[1]，是環(huán)境中潛在的有毒污染物。在2002年 4月，由瑞典國(guó)家食品管理局與斯德哥爾摩大學(xué)的研究人員首次在多種油炸、高溫烘烤食品中發(fā)現(xiàn)了AA，引起世界衛(wèi)生組織、世界糧農(nóng)組織、科學(xué)界和大眾的廣泛關(guān)注[2]。同時(shí)研究結(jié)果表明AA具有多種毒性，其中包括神經(jīng)毒性、遺傳毒性、發(fā)育毒性、雄性生殖毒性等[3]。由于AA屬于一種水溶性的神經(jīng)毒性物質(zhì)，滲透性較強(qiáng)，人體可通過(guò)消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸并吸收AA。AA在經(jīng)口途徑隨食物進(jìn)入人體后，在消化過(guò)程中可以快速到達(dá)腸道[4]，腸上皮是實(shí)現(xiàn)腸道消化、免疫、內(nèi)分泌等功能的主要組織細(xì)胞，也是構(gòu)筑腸道黏膜屏障的主要成分，由此可見(jiàn)腸上皮是AA毒性的主要靶目標(biāo)[5]。然而目前AA對(duì)小腸細(xì)胞毒性的研究報(bào)道很少，且研究并不深入。已有的體內(nèi)體外研究已證實(shí)AA可快速進(jìn)入小腸細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）濃度顯著下降，促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基的大量生成，使細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力急劇上升，從而抑制細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡[5]。同時(shí)AA還能夠?qū)е滦∈笮∧c細(xì)胞凋亡、肌層損傷、小腸壁和黏膜結(jié)構(gòu)改變、消化吸收面積減少、吸收能力下降[6]。由此可知，AA可通過(guò)氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量ROS自由基并且能夠抑制機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性[7]，造成組織損傷[8]，引起細(xì)胞死亡[9-10]。

因此，探求能夠有效地抑制ROS自由基大量生成的天然產(chǎn)物，作為一種改善氧化應(yīng)激的干預(yù)措施，有望成為預(yù)防和抑制AA導(dǎo)致的腸道氧化損傷的一種切實(shí)可行的方法。黑靈芝是我國(guó)重要的藥食兼用真菌資源，也是江西省的特色資源，具有較好的營(yíng)養(yǎng)、保健、醫(yī)療價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以黑靈芝為研究對(duì)象，分離純化得到黑靈芝多糖組分。通過(guò)體內(nèi)體外研究表明黑靈芝多糖具有抗氧化防御能力[11-12]，能夠改善過(guò)氧化氫所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，具有增強(qiáng)免疫抗腫瘤的作用[13]。本實(shí)驗(yàn)利用AA誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IEC）-6細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討黑靈芝多糖對(duì)IEC-6的保護(hù)作用，以期為黑靈芝多糖的充分應(yīng)用與深度開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑靈芝采自江西贛州贛南靈芝基地；黑靈芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，GAP）由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備：采用水提醇沉提取粗多糖，然后采用不同濃度的NaCl溶液進(jìn)行洗脫得到5 個(gè)級(jí)份，分別為GAP-FW、GAP-F0.1、GAP-F0.2、GAP-F0.5、GAP-F2，經(jīng)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)，其中GAP-F2純度＞98%[14]，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；大鼠IEC-6 上海酶研生物科技有限公司（來(lái)源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）。

杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM） 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 美國(guó)BI公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazol tetrazolium bromide，MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）及BCA（bicinchonininc acid）蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Toshiba公司；倒置顯微鏡日本Olympus公司；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；TGL216G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖活躍的細(xì)胞進(jìn)行分組。

1.3.2 IEC-6氧化損傷模型的構(gòu)建

[15]，采用MTT比色法檢測(cè)存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6，以1×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒掉培養(yǎng)基，加入不含血清的完全培養(yǎng)基。每孔按濃度梯度（終濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/ L）加入AA。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（0.0 mmol/L），置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。離心（室溫條件下1 500 r/ min）5 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗一次，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，使MTT終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，3 000 r/min離心5 min。棄上清液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液。迅速用平板搖床振蕩10 min，待孔內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。計(jì)算公式如式（1）所示。

1.3.3 MTT法檢測(cè)黑靈芝多糖對(duì)IEC-6增殖的影響

參考文獻(xiàn)[16]，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6，用胰蛋白酶消化成單層細(xì)胞，用新鮮DMEM培養(yǎng)基配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔100 μL。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒掉培養(yǎng)基，加入不含血清的完全培養(yǎng)基。每孔按質(zhì)量濃度梯度（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL）加入GAP-F2，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。離心（室溫條件下，1 500 r/min）5 min，PBS清洗一次，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，使MTT終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，3 000 r/min離心5 min。棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO溶液。迅速用平板搖床振蕩10 min，待孔內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。另設(shè)空白孔，排除干擾。計(jì)算公式與式（1）相同。

1.3.4 黑靈芝多糖對(duì)氧化損傷IEC-6存活率的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒掉培養(yǎng)基，加入不含血清的完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為7 個(gè)處理組，分別為空白對(duì)照組、 AA組、陽(yáng)性對(duì)照組（N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）終濃度為10 mmol/L）、多糖氧化抑制組（使GAP-F2終質(zhì)量濃度為20、40、80、160 μg/mL），每組10 個(gè)復(fù)孔；置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，1 500 r/min離心5 min，吸去培養(yǎng)基，更換不含血清的AA終濃度為5 mmol/L的完全培養(yǎng)基，其中空白對(duì)照組AA終濃度為0 mmol/L。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4、8、16、24 h。離心（37 ℃、1 500 r/min）5 min，PBS清洗一次，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，使MTT終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，3 000 r/min離心5 min。棄上清，每孔加入150 μL的DMSO溶液。迅速用平板搖床振蕩10 min，待孔內(nèi)藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的OD值。計(jì)算公式與式（1）相同。

1.3.5 氧化損傷細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH漏出量的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6按1.3.4節(jié)方法分組，用AA損傷細(xì)胞16 h。1 500 r/min離心5 min，收集上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定上清液中LDH的漏出量。

1.3.6 氧化損傷細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性、MDA水平的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]細(xì)胞處理在6 孔板內(nèi)進(jìn)行，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IEC-6按1.3.4節(jié)方法分組，用AA損傷細(xì)胞16 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞用冷PBS清洗，然后1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液150 μL，混勻4 ℃孵育5 min。離心取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性以及過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA水平

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度AA對(duì)IEC-6存活率的影響

采用濃度為0.0（空白對(duì)照組）、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L AA處理IEC-6 24 h，構(gòu)建氧化損傷模型，結(jié)果如圖1所示。

圖1 AA對(duì)IEC-6的氧化損傷Fig.1 Oxidative damage induced by AA of IEC-6

由圖1可知，采用1～20 mmol/L AA處理24 h，均能對(duì)IEC-6造成顯著損傷，考慮到AA造成的細(xì)胞存活率的半數(shù)致死量，以及損傷程度過(guò)于嚴(yán)重可能導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行修復(fù)作用研究，因此本實(shí)驗(yàn)選取5 mmol/L AA作為最佳誘導(dǎo)濃度，構(gòu)建IEC-6氧化損傷模型，此時(shí)細(xì)胞存活率為46%。

2.2 不同質(zhì)量濃度黑靈芝多糖對(duì)IEC-6增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量的常用方法。采用不同質(zhì)量濃度（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL）GAP-F2處理IEC-6 20 h，測(cè)定不同質(zhì)量濃度GAP-F2處理IEC-6的毒性，篩選安全劑量范圍，結(jié)果如圖2所示。

圖2 黑靈芝多糖對(duì)IEC-6生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on the growth of IEC-6

由圖2可知，在1～160 μg/mL劑量范圍內(nèi)，GAP-F2均未對(duì)IEC-6造成顯著毒性，屬于安全范圍內(nèi)。說(shuō)明GAP-F2對(duì)IEC-6增殖沒(méi)有影響，不具有細(xì)胞毒性，因此在后續(xù)研究中，選擇不同質(zhì)量濃度（20.0、40.0、80.0、160.0 μg/mL）GAP-F2研究其對(duì)IEC-6氧化損傷的保護(hù)作用。

2.3 不同質(zhì)量濃度黑靈芝多糖對(duì)氧化損傷IEC-6存活率的影響

表1 黑靈芝多糖對(duì)AA誘導(dǎo)的IEC-6氧化損傷的預(yù)防作用Table1 Preventive effect ofGanoderma attrruumm polysaccharides against AA-induced oxidative damage in IEC-6

由表1可知，AA處理不同時(shí)間后，與空白對(duì)照組相比，IEC-6存活率明顯下降（P＜0.01）。相反，不同質(zhì)量濃度GAP-F2預(yù)處理20 h后，細(xì)胞存活率相對(duì)于AA組明顯增加，且黑靈芝多糖的保護(hù)效果一定程度上隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。由表1中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)80、160 μg/mL GAP-F2均能顯著地緩解AA造成的細(xì)胞存活率的降低（P＜0.01），與陽(yáng)性對(duì)照組相比細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異。而20 μg/mL GAP-F2組在AA處理4、8、16 h后，黑靈芝多糖無(wú)顯著保護(hù)作用。由此可知40、80、160 μg/mL GAP-F2預(yù)處理可有效地抑制AA造成的IEC-6死亡。

2.4 不同質(zhì)量濃度黑靈芝多糖對(duì)氧化損傷IEC-6釋放LDH的影響

圖3 黑靈芝多糖對(duì)氧化損傷IEC-6釋放LDH的影響Fig.3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on the release of LDH in IEC-6 with AA-induced oxidative damage

細(xì)胞在凋亡或者壞死過(guò)程中細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，致使細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液中。LDH水平在一定程度上能反映出細(xì)胞受損程度，因而常常作為判斷細(xì)胞氧化損傷程度的重要參數(shù)。通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清中LDH水平可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析，從而反映出細(xì)胞的損傷程度。

不同處理組檢測(cè)出LDH漏出量如圖3所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，AA組中的LDH漏出量極顯著上升，表明AA可導(dǎo)致上皮細(xì)胞氧化損傷。與AA組相比，黑靈芝多糖組中LDH漏出量極顯著降低，而且160 μg/mL GAP-F2組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，細(xì)胞中LDH漏出量相當(dāng)，這表明高劑量GAP-F2能顯著降低LDH漏出量。這些結(jié)果表明黑靈芝多糖可有效降低AA對(duì)IEC-6造成的氧化損傷，具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.5 不同質(zhì)量濃度黑靈芝多糖對(duì)氧化損傷IEC-6中SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量的影響

在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)ROS的生成和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡，在內(nèi)源性或外源性的有害刺激下，這種平衡將會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的大量生成，超過(guò)機(jī)體抗氧化防御體系的清除能力，從而造成機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[18]。在機(jī)體受到氧化損傷的情況下，細(xì)胞中常見(jiàn)的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)主要包括：SOD、GSH-Px[19]。同時(shí)細(xì)胞在發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生脂質(zhì)氧化。而MDA則是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，可用作與檢測(cè)細(xì)胞中脂質(zhì)氧化的水平[20-21]。

表2 黑靈芝多糖對(duì)氧化損傷IEC-6 SOD、GSH-Px活力、MDA水平的影響Table2 Effect off Ganoderma attrruumm polysaccharides on SOD and GSH activities and MDA content in IEC-6 with AA-induced oxidative damage

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，AA組中的SOD活力顯著降低，而不同質(zhì)量濃度的多糖均能有效緩解細(xì)胞中抗氧化酶含量的降低。GSH-Px在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，能夠反映出細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平。與AA組相比，細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性呈劑量依賴性顯著增加，結(jié)果表明黑靈芝多糖能夠抑制AA造成的細(xì)胞氧化損傷，提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性。與空白對(duì)照組相比，AA組中MDA含量顯著增加；與AA組相比，黑靈芝多糖組中MDA含量顯著降低，且與陽(yáng)性對(duì)照組相比效果相當(dāng)，表明黑靈芝多糖可減輕AA引起的氧化應(yīng)激。

3 討 論

氧化應(yīng)激作為AA誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵機(jī)制之一[22]?？纱碳ぜ?xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS自由基，破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞的正常的功能，并降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，造成細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的上升，最終可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至細(xì)胞凋亡或死亡。而大鼠小腸隱窩IEC-6是腸道內(nèi)外環(huán)境的界面，是實(shí)現(xiàn)腸道消化、吸收、免疫、內(nèi)分泌等功能的主要組織細(xì)胞，也是構(gòu)筑腸道黏膜屏障的主要成分。AA可通過(guò)多種途徑迅速到達(dá)腸道，由此可見(jiàn)，腸上皮是AA誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的主要靶器官。有研究表明[23]，在腸道細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，小腸細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的有毒ROS代謝物，與此同時(shí)氧化應(yīng)激還可抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，破壞細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御體系，造成小腸黏膜損傷。AA作為一種高溫食品加工過(guò)程中產(chǎn)生的一種潛在致癌物，許多研究者都致力于尋找可用于拮抗膳食中AA對(duì)機(jī)體損傷的天然活性成分，期望通過(guò)多種天然活性成分構(gòu)建AA體內(nèi)防護(hù)的第二道障，以膳食補(bǔ)充劑的形式緩解AA對(duì)人體的潛在危害，并從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路層面著手，闡明其具體保護(hù)機(jī)制。研究結(jié)果已表明，大量天然活性成分應(yīng)用于AA對(duì)機(jī)體毒性的保護(hù)上，如葡萄果渣提取物[24]、藍(lán)莓及其提取物[25]、矢車菊素-3-葡萄糖苷[26]、橄欖油提取物[27]等均表明能夠在一定程度上緩解AA對(duì)機(jī)體造成的損傷。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，很多植物、真菌來(lái)源的多糖對(duì)生物來(lái)源的ROS具有顯著的清除和抑制作用，如黃芪多糖可清除過(guò)多的自由基，抑制炎癥因子釋放，發(fā)揮其腸道免疫保護(hù)作用[24,28]；枸杞多糖可提高機(jī)體抗氧化酶活力及清除過(guò)多自由基，對(duì)大鼠小腸缺血再灌注氧化損傷有明顯的保護(hù)作用[29]。而黑靈芝多糖則被證實(shí)在清除自由基功能方面尤其突出[30]。本研究就以黑靈芝多糖為研究對(duì)象，來(lái)確定其是否能夠提高機(jī)體的內(nèi)源性抗氧酶活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，從而減緩或預(yù)防AA誘導(dǎo)的應(yīng)激性氧化損傷發(fā)生，以期為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用AA誘導(dǎo)IEC-6氧化損傷，構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型。實(shí)驗(yàn)中選用了5 mmol/L濃度的AA誘導(dǎo)IEC-6損傷24 h能夠顯著造成細(xì)胞氧化損傷，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的可行性。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，AA組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率以及LDH漏出量均顯著增加，說(shuō)明腸上皮細(xì)胞受到顯著損傷，因此氧化應(yīng)激損傷模型建立成功。與此同時(shí)，細(xì)胞在經(jīng)過(guò)AA處理后，細(xì)胞中的抗氧化酶活性SOD、GSH-Px的活性顯著降低，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平的指標(biāo)MDA含量與空白對(duì)照組相比，AA組顯著增高。而不同質(zhì)量濃度黑靈芝多糖的氧化抑制組能夠顯著提高細(xì)胞存活率、減少細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的釋放、降低細(xì)胞的MDA的水平、提高細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性。

綜上所述，黑靈芝多糖對(duì)AA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，此作用可能與提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性有關(guān)。此研究能為緩解或抑制AA誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損失提供一定的理論依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅限于細(xì)胞水平的體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)黑靈芝多糖在氧化應(yīng)激損傷下對(duì)細(xì)胞保護(hù)的具體分子生物學(xué)機(jī)制及其在體內(nèi)的抗氧化保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

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Protective Effect of Ganoderma atrum Polysaccharides on Oxidative Damage Induced by Acrylamide in IEC-6 Cells

ZHANG Lulu, SHI Ting, ZHU Mengting, CHEN Yi?
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective： To investigate the protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides (GAP) against oxidative injury induced by acrylamide (AA) in intestinal epithelial cells (IEC)-6. Methods： The MTT assay was used to evaluate the proliferation of IEC-6. After cultivation, the cells and culture medium were collected for determining the activities of lactate dehydrogenase (LDH), malondialdelyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and reduced glutathione peroxidase (GSH-Px). Results： GAP had no toxic effect on the cultured IEC-6 at the tested concentrations. Compared with the AA-treated group, GAP significantly attenuated AA-induced oxidative damage and increased cell viability by decreasing LDH activity and MDA content, and increasing SOD and GSH-Px activities in IEC-6 line. Conclusion： These results suggested that GAP showed a protective effect against AA-induced oxidative damage in IEC-6 through inhibiting lipid peroxidation, and increasing antioxidant system activity.

Ganoderma atrum polysaccharides; acrylamide; IEC-6; oxidative damage

10.7506/spkx1002-6630-201703028

TS201.4

A

1002-6630（2017）03-0170-06

張路路, 石婷, 朱夢(mèng)婷, 等. 黑靈芝多糖對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3)：170-175. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703028. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Lulu, SHI Ting, ZHU Mengting, et al. Protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides on oxidative damage induced by acrylamide in IEC-6 cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 170-175. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703028. http：//www.spkx.net.cn

2016-06-25

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（21467016）；全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)資金項(xiàng)目（201357）；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對(duì)象計(jì)劃項(xiàng)目（20142BCB23005）

張路路（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：1126304817@qq.com

?通信作者：陳奕（1982—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析、食品營(yíng)養(yǎng)與安全、食品質(zhì)量與安全。E-mail：chenyi-417@163.com