鄭博聞，姜招峰，黃漢昌?

（北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

姜黃素抑制Cu2＋誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)APP695基因SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷和凋亡作用

鄭博聞，姜招峰，黃漢昌?

（北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

目的：研究Cu2＋誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)β-淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）基因SH-SY5Y（SHSY5Y-APP695）細(xì)胞氧化損傷、凋亡及姜黃素的抑制作用。方法：在姜黃素預(yù)保護(hù)和無姜黃素預(yù)保護(hù)條件下，50 μmol/L Cu2＋處理細(xì)胞24 h，測(cè)定細(xì)胞存活率、胞外乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平、胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen，ROS）水平、線粒體膜電位、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3、caspase-8和caspase-9活力，蛋白免疫印跡法測(cè)定核轉(zhuǎn)錄NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）Ser40位點(diǎn)磷酸化（pSer40-Nrf2）水平以及血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照相比，Cu2＋損傷組細(xì)胞存活率降低，胞內(nèi)ROS水平和胞外LDH活性升高，線粒體膜電位下降，caspase-9和caspase-3活性明顯升高，pSer40-Nrf2和HO-1含量增加，而姜黃素保護(hù)組細(xì)胞存活率升高，胞內(nèi)ROS水平和LDH釋放水平降低，線粒體膜電位恢復(fù)升高，caspase-9和caspase-3活性明顯降低，pSer40-Nrf2和HO-1表達(dá)量減少。結(jié)論：姜黃素在一定程度上減弱了Cu2＋誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡作用。

阿爾茨海默??；Cu2＋；氧化損傷；細(xì)胞凋亡；姜黃素；Nrf2/ARE信號(hào)通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征主要表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積形 成的老年斑，tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及突觸缺失損傷[1-2]。Aβ是由β-淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）經(jīng)β-裂解途徑分泌的含39～43 個(gè)氨基酸殘基的多肽。APP基因位于人類第21號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，唐氏綜合癥（Down syndrome）患者體細(xì)胞內(nèi)有3 條21號(hào)染色體。AD患者與唐氏綜合癥患者具有很多相似的病理特征表現(xiàn)，包括低的行為認(rèn)知能力、老年斑沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)等[3]。有報(bào)道顯示，在AD患者大腦中APP的mRNA表達(dá)水平升高[4]、切割A(yù)PP產(chǎn)生Aβ的限速酶β-分泌酶蛋白表達(dá)水平升高[5]。前期的實(shí)驗(yàn)也表明，在海馬區(qū)注射鏈脲佐菌素聯(lián)合頸背皮下注射D-半乳糖的AD模型大鼠中海馬區(qū)APP表達(dá)及Aβ分泌水平升高[6]。這些事實(shí)提示大腦衰老退行性病變可能與APP的表達(dá)或代謝密切相關(guān)，但是，導(dǎo)致APP異常表達(dá)和代謝的因素和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步地研究。

銅是人體必需的重要微量元素，Cu2＋的穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生[7]。與同年齡對(duì)照組相比，AD患者血液中游離Cu2＋水平明顯升高[8]，AD患者腦脊液中的Cu2＋濃度也明顯升高[9-10]。血清中未與銅藍(lán)蛋白結(jié)合的游離的Cu2＋可能與輕度認(rèn)知損傷（mild cognitive impairment，MCI）、AD的發(fā)展相關(guān)，MCI患者中4 a內(nèi)AD病情發(fā)展的概率與血清中游離Cu2＋濃度相關(guān)，濃度大于1.6 μmol/L患者的概率是小于1.6 μmol/L患者的3 倍[11]。高濃度的Cu2＋與Aβ結(jié)合后可能通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元的氧化損傷[12]。因此，Cu2＋穩(wěn)態(tài)失衡可能是AD發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素，維持神經(jīng)元氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)水平可能是AD預(yù)防或治療的有效策略。

近來姜黃素在AD預(yù)防中的作用和效果受到很多關(guān)注[13]。姜黃素可減弱由H2O2導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷及細(xì)胞凋亡作用[14]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素能夠降低老年鼠腦內(nèi)氧化產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malonaldehyde，MDA）和核酸氧化產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）的含量[15]。姜黃素不僅可以使實(shí)驗(yàn)鼠大腦中的淀粉樣蛋白分解，還能預(yù)防這種蛋白的生成[16]，另外，姜黃素還能改善AD模型大鼠的行為能力[17]，前期研究表明，適量濃度的姜黃素減弱了Cu2＋誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)神經(jīng)元的氧化損傷[18]，在SH-SY5Y細(xì)胞中姜黃素能夠抑制Cu2＋對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活作用[19]。本研究以轉(zhuǎn)染人APP695基因的SH-SY5Y細(xì)胞（SH-SY5Y-APP695）為細(xì)胞模型，研究姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡信號(hào)的抑制作用及對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5SY-APP695細(xì)胞由生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，將APP轉(zhuǎn)錄本NM_201414.2編碼序列構(gòu)建到慢病毒表達(dá)載體、包裝成慢病毒顆粒后感染SH-SY5Y細(xì)胞，經(jīng)篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)人APP695的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。

1.2 試劑

姜黃素（≥95% HPLC，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自提）臨用時(shí)用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO 美國(guó)Sigma-aldrich公司）溶解配成20 mmol/L的儲(chǔ)備液。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、活性氧檢測(cè)試劑盒、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3活性檢測(cè)試劑盒、caspase-8活性檢測(cè)試劑盒、caspase-9活性檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Genview公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出細(xì)胞，立刻置于37 ℃水浴鍋中將其迅速解凍，4 ℃、100×g離心5 min；吸去上清液，加入1 mL PRMI 1640培養(yǎng)基清洗，反復(fù)3 次，離心條件同上；吸取上清，加入1 mL含血清培養(yǎng)基（PRMI 1640培養(yǎng)基＋10%胎牛血清＋1%鏈霉素-青霉素溶液，100 μg/mL新霉素），均勻接種于培養(yǎng)皿中，每3～4 d傳代1 次。加藥培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液換成不含血清培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組；姜黃素對(duì)照組：10 μmol/L姜黃素孵育細(xì)胞24 h；Cu2＋損傷組：50 μmol/L CuCl2孵育細(xì)胞24 h；姜黃素保護(hù)組1、2、3：分別用1、5、10 μmol/L姜黃素孵育細(xì)胞4 h，換液后加入50 μmol/L CuCl2孵育細(xì)胞24 h。

1.3.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活力測(cè)定

采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活力，將SH-SY5YAPP695細(xì)胞1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中（細(xì)胞懸液100 μL/孔），加藥培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，選定波長(zhǎng)450 nm（參比波長(zhǎng)630 nm），測(cè)定每孔的光密度（OD）值。

1.3.3 LDH活力測(cè)定

將SH-SY5Y-APP695細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，加藥處理后，按照LDH測(cè)定試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中的LDH含量。培養(yǎng)基中的LDH是細(xì)胞膜損傷的生化指標(biāo)，可催化培養(yǎng)基中的乳酸和氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）生成丙酮酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）；在堿性條件下產(chǎn)生的丙酮酸將2,4-二硝基苯肼還原成丙酮酸二硝基苯腙，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測(cè)定

將SH-SY5Y-APP695細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后吸除培養(yǎng)液，裝載無熒光的二氯二氫熒光素二乙酸酯（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）探針（終濃度為10 μmol/L），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。該探針可自由透過細(xì)胞膜，進(jìn)入胞內(nèi)的DCFH-DA可被酯酶水解成二氯二氫熒光素（dichlorodihydro-fluorescein，DCFH），該物質(zhì)不能自由穿過細(xì)胞膜。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可使無熒光性的DCFH氧化生成具有熒光性的二氯熒光素（dichloro-fluorescein，DCF），因此胞內(nèi)DCF的熒光值可反映胞內(nèi)ROS含量水平。孵育后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次，加入無酚紅PRMI 1640培養(yǎng)基，于熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）。

1.3.5 線粒體膜電位測(cè)定

將SH-SY5Y-APP695細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后吸除培養(yǎng)液加入1 mL無血清培養(yǎng)基和1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2 次，加入2 mL無血清培養(yǎng)液，于熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值（單體激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：490/530；聚集體激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：525/590）。

1.3.6 caspase-3、caspase-8、caspase-9活力測(cè)定

將SH-SY5Y-APP695細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后吸除培養(yǎng)液，用冰PBS清洗3 次，加入裂解液收集細(xì)胞，于冰上裂解30 min后4 ℃、20 000×g離心13 min。將上清轉(zhuǎn)移至預(yù)冷EP管中，而后按照caspase-3、caspase-8、caspase-9活力測(cè)定試劑盒測(cè)定其酶活力。

1.3.7 蛋白免疫印跡（Western blot）分析

將SH-SY5Y-APP695細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，藥物處理24 h后收集細(xì)胞，每孔加入150 μL含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，將細(xì)胞收集至1.5 mL離心管中，冰上裂解30 min；12 000 r/min離心10 min；收集上清液，一部分用BCA法測(cè)蛋白濃度，另一部分按V（5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液）：V（樣品）＝1∶4混合處理，100 ℃煮10 min后置于冰上。經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electropheresis，PAGE）分離不同分子質(zhì)量的蛋白，電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，4 ℃ 條件下一抗過夜；TBST清洗3 次，常溫條件下二抗孵育2 h，TBST清洗3 次后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（enhanced chemiluminescence，ECL）測(cè)定蛋白質(zhì)條帶光密度，并用軟件Quantity One分析條帶灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對(duì)銅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1 不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞形態(tài)觀察（×4400）Fig.1 Images of cell morphology (×40)

與野生型細(xì)胞（圖1A）相比，轉(zhuǎn)APP基因SH-SY5YAPP695細(xì)胞（圖1B）突起變短，胞體增大，有的細(xì)胞胞體出現(xiàn)空泡。在10 μmol/L姜黃素孵育下，SH-SY5Y-APP695細(xì)胞突起延展較好，胞體較完好，表明姜黃素沒有明顯的細(xì)胞損傷作用（圖1C）。經(jīng)50 μmol/L CuCl2處理24 h后，較多細(xì)胞胞體皺縮，突起收縮（圖1D）。首先由姜黃素預(yù)保護(hù)4 h、再經(jīng)CuCl2處理24 h后，細(xì)胞胞體較為完整，突起延展較為充分（圖1E、F），表明姜黃素在一定程度上減輕了Cu2＋誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用。

2.2 姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y-APP695細(xì)胞膜損傷的影響

SH-SY5Y-APP695細(xì)胞經(jīng)50 μmol/L Cu2＋處理后，培養(yǎng)液中LDH活力與對(duì)照組相比顯著上升（P＜0.05），表明Cu2＋可造成細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致胞漿LDH釋放到胞外；與Cu2＋損傷組相比。姜黃素保護(hù)組1、2、3（1、5、10 μmol/L姜黃素）LDH活力顯著降低（P＜0.05），這表明姜黃素對(duì)SH-SY5Y-APP695細(xì)胞預(yù)保護(hù)后，可減輕Cu2＋對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度（圖2）。

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性（n＝6）6Fig.2 LDH activity in culture medium (n = 6)

2.3 姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y-APP695細(xì)胞存活力的影響

與空白對(duì)照組相比，SH-SY5Y-APP695細(xì)胞經(jīng)Cu2＋處理后（Cu2＋損傷組），細(xì)胞存活力隨Cu2＋濃度升高而顯著下降（P＜0.05）（圖3A）。與Cu2＋損傷組相比，5 μmol/L和10 μmol/L姜黃素保護(hù)組細(xì)胞存活力顯著升高（P＜0.05）（圖3B）?？梢?，姜黃素在一定濃度條件下能夠提升Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y-APP695細(xì)胞存活力。

圖3 細(xì)胞相對(duì)存活力（n＝66）Fig.3 Relative cell viability (n = 6)

2.4 姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y-APP695細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

圖4 胞內(nèi)ROS相對(duì)水平（n＝66）Fig.4 Relative intracellular ROS (n = 6)

與空白對(duì)照組相比，50 μmol/L Cu2＋損傷組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.05），而5 μmol/L和10 μmol/ L姜黃素保護(hù)組與Cu2＋損傷組相比胞內(nèi)ROS則顯著下降（P＜0.05），說明姜黃素可在一定程度上起到抑制Cu2＋誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS水平升高的作用（圖4）。細(xì)胞內(nèi)ROS主要來源于電子傳遞鏈，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶以及一氧化氮合酶等。

2.5 姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化作用的影響

圖5 細(xì)胞線粒體相對(duì)膜電位（n＝66）Fig.5 Relative mitochondrial membrane potential (n = 6)

由圖5可知，與空白對(duì)照組相比，Cu2＋損傷組細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降（P＜0.05）；隨著姜黃素濃度升高，線粒體膜電位呈上升趨勢(shì)，其中5 μmol/L和10 μmol/L姜黃素保護(hù)組相比于Cu2＋損傷組線粒體膜電位顯著升高（P＜0.05），說明姜黃素在一定濃度范圍內(nèi)起到抑制Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y-APP695細(xì)胞線粒體膜電位的去極化作用。

2.6 姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y-APP695細(xì)胞caspases活性的影響

圖6 caspases相對(duì)活性（n＝66）Fig.6 Relative activity of caspase enzymes (n = 6)

線粒體膜電位下降與細(xì)胞凋亡的發(fā)生關(guān)系密切，線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞色素c等促凋亡因子的釋放，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[20]。本研究進(jìn)一步分析了凋亡相關(guān)caspases活性。如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，Cu2＋損傷組中caspase-3和caspase-9活力上升顯著（約為空白對(duì)照組的1.6 倍）（P＜0.05）、caspase-8活力也有一定的升高（約為空白對(duì)照組的1.2 倍）（P＜0.05）。與Cu2＋損傷組相比，姜黃素保護(hù)組中caspase-3和caspase-9活力均顯著降低（P＜0.05）、caspase-8活力呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)；姜黃素保護(hù)組中，與caspase-8活力相比，caspase-9活力抑制更為明顯。涉及caspase-9的內(nèi)源性線粒體途徑凋亡和涉及caspase-8的胞表面受體或死亡受體等激活的外源性凋亡是重要的細(xì)胞凋亡途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，姜黃素主要通過抑制線粒體損傷途徑抑制Cu2＋誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.7 姜黃素對(duì)Cu2＋誘導(dǎo)的Nrf2-ARE通路激活作用的影響

核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，受到胞質(zhì)接頭蛋白（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）調(diào)控，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)抗氧化酶系和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。Nrf2與Keap1的雙甘氨酸重復(fù)區(qū) （double glycine repeat，DGR）結(jié)合，以復(fù)合物形式存在于細(xì)胞漿[21]；當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激或化學(xué)藥物刺激時(shí)，胞內(nèi)產(chǎn)生的親電子化合物等與Keap1的半胱氨酸殘基作用，或在刺激狀態(tài)下Nrf2或Keap1發(fā)生磷酸化修飾，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離，隨后Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與ARE結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化相關(guān)酶系基因的表達(dá)[22-23]。最近研究發(fā)現(xiàn)，患有輕度認(rèn)知障礙患者腦中的外周血單核細(xì)胞內(nèi)，其Nrf2磷酸化水平升高，且大腦皮層細(xì)胞核中Nrf2含量增加[24]。Joshi等[25]發(fā)現(xiàn)APP/PS1轉(zhuǎn)基因大鼠敲除Nrf2的基因后，胞內(nèi)APP水平、Aβ42和Aβ40生成量均有所增加，這些說明細(xì)胞內(nèi)源性Nrf2-ARE抗氧化信號(hào)通路可能是AD治療的靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步探討了Cu2＋對(duì)SH-SY5Y-APP695細(xì)胞中Nrf2-ARE信號(hào)通路的影響及姜黃素的抑制作用。

圖7 pSer40-Nrf2相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of pSer40-Nrf2

圖8 HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.8 Relative expression level of HO-1

由圖7、8可知，與空白對(duì)照組相比，50 μmol/L Cu2＋損傷組顯著增強(qiáng)了pSer40-Nrf表達(dá)水平以及HO-1蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），這說明Cu2＋激活了Nrf2，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)下游抗氧化酶HO-1等的表達(dá)。與Cu2＋損傷組相比，姜黃素保護(hù)組顯著降低pSer40-Nrf2表達(dá)水平以及HO-1蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），說明姜黃素抑制了細(xì)胞對(duì)Cu2＋氧化應(yīng)激反應(yīng)，這可能與姜黃素本身具有較強(qiáng)的自由基清除能力有關(guān)。

3 結(jié) 論

AD患者腦脊液Cu2＋水平明顯高于正常成人，腦中Cu2＋升高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷可能是神經(jīng)細(xì)胞凋亡的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2＋可在一定程度上引起SH-SY5Y-APP695細(xì)胞損傷，導(dǎo)致ROS水平升高、線粒體膜電位發(fā)生去極化，增強(qiáng)了caspase-9、caspase-3蛋白酶活性、誘發(fā)細(xì)胞凋亡。另外，Cu2＋導(dǎo)致細(xì)胞自身抗氧化防御系統(tǒng)的激活以抵抗細(xì)胞應(yīng)激水平。姜黃素能夠減弱Cu2＋誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡作用，也在一定程度上減弱了Nrf2/ARE通路的激活作用，即在姜黃素的保護(hù)作用下，細(xì)胞在一定程度上不必加強(qiáng)過多的Nrf2/ARE防護(hù)系統(tǒng)來抵御氧化損傷。

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Inhibitory Effects of Curcumin on Cu2+-Induced Oxidative Damage and Cell Apoptosis in Transgentic APP695SH-SY5Y Cells

ZHENG Bowen, JIANG Zhaofeng, HUANG Hanchang?
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective： This study was focused on the protective effect of curcumin on cellular oxidative damage and cell apoptosis induced by Cu2＋in human neuroblastoma SH-SY5Y cells transfected by human amyloid-β precursor protein (APP) (SH-SY5Y-APP695). Methods： SH-SY5Y-APP695cells were treated with 50 μmol/L Cu2＋at 37 ℃ for 24 h with or without curcumin pre-protection. Cell viability was detected by cell counting kit-8 (CCK-8). Extracellular lactate dehydrogenase (LDH), intracellular reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential were determined by commercial assay kits. The enzymatic activities of caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were assessed. Phosphorylation levels of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) at Ser-40 (pSer40-Nrf2) and HO-1 were detected by Western blot analysis. Results： Compared with the control group, Cu2＋administration led to decreased cell viability and mitochondrial membrane potential, increased levels of LDH, intracellular ROS and caspase-3, caspase-8 and caspase-9 activities, and elevated levels of pSer40-Nrf2 and HO-1. Conversely, curcumin increased cell viability and mitochondrial membrane potential, decreased the levels of LDH and intracellular ROS, significantly mitigated caspase-9 and caspase-3 activities, and reduced the expression levels pSer40-Nrf2 and HO-1. Conclusion： Curcumin can attenuate Cu2＋-induced cellular oxidative damage and cell apoptosis.

Alzheimer’s disease; Cu2+; oxidative damage; cell apoptosis; curcumin; Nrf2-antioxidant response element pathway

10.7506/spkx1002-6630-201703027

Q26

A

1002-6630（2017）03-0164-06

2016-03-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471587）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD201504034）作者簡(jiǎn)介：鄭博聞（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锘钚晕镔|(zhì)功能評(píng)價(jià)。E-mail：tz19901111@163.com

?通信作者：黃漢昌（1975—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞窠?jīng)分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：hanchang@buu.edu.cn

鄭博聞, 姜招峰, 黃漢昌. 姜黃素抑制Cu2＋誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)APP695基因SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷和凋亡作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(3)： 164-169. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201703027. http：//www.spkx.net.cn

ZHENG Bowen, JIANG Zhaofeng, HUANG Hanchang. Inhibitory effects of curcumin on Cu2+-induced oxidative damage and cell apoptosis in transgentic APP695SH-SY5Y cells[J]. Food Science, 2017, 38(3)： 164-169. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201703027. http：//www.spkx.net.cn