劉洋，余冬陽，李美琪，覃媚媚，赫珊，潘楚，周鴻立

（1.吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林武警總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，吉林長(zhǎng)春130000；3.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

響應(yīng)面法優(yōu)化大興安嶺金蓮花多糖提取工藝研究

劉洋1，余冬陽2，李美琪1，覃媚媚1，赫珊1，潘楚1，周鴻立3，*

（1.吉林化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.吉林武警總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，吉林長(zhǎng)春130000；3.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

利用纖維素酶解法研究大興安嶺金蓮花多糖提取工藝?？疾鞙囟取H值、提取時(shí)間及加酶量對(duì)金蓮花多糖提取的影響，利用響應(yīng)面分析法對(duì)金蓮花多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)獲得最佳工藝條件為：溫度55℃，時(shí)間102min，pH值4.15，加酶量32.23U/g，金蓮花多糖提取率達(dá)10.43%。

金蓮花；多糖；酶解；響應(yīng)面

金蓮花為毛茛科植物，花瓣為金黃色，株高30 cm～100 cm高，主要分布我國(guó)北方的高山地區(qū)，如我國(guó)北方的內(nèi)蒙和東北等地，金蓮花資源都較為豐富[1-3]。在我國(guó)清代的《本草綱目拾遺》一書中，就出現(xiàn)了金蓮花的藥用記載。后經(jīng)現(xiàn)代生物研究，經(jīng)證實(shí)金蓮花提取物具有較好的抗菌、抗病毒等藥理作用，目前有關(guān)金蓮花的應(yīng)用也多以治療呼吸道和腸道感染等疾病的藥物為主[4-6]。金蓮花中活性成分較多，其中黃酮、多糖、揮發(fā)油類及有機(jī)酸等物質(zhì)含量較為豐富[7-9]。但目前金蓮花的開發(fā)主要集中于藥物開發(fā)，相關(guān)保健產(chǎn)品的開發(fā)較為少見。

目前的大量研究表明，植物多糖毒副作用小，來源廣泛[10]，適宜進(jìn)行藥物及保健食品的開發(fā)。水提法、酸堿法、酶法、微波輔助等方法，是利用率較高的多糖提取方法[11]，其中水提法成本低、效果好，較適宜用于工業(yè)化生產(chǎn)。酶法輔助提取是指利用生物酶的專一性，降解細(xì)胞壁以及細(xì)胞間質(zhì)中的一些組成物質(zhì)，破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及其屏障作用，有助于多糖等物質(zhì)的溶出。果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶等是目前酶法提取中常選用的生物活性酶[12]。由于纖維素酶容易溶解，活性較高，因此本試驗(yàn)利用纖維素酶水解提取金蓮花多糖。金蓮花自古就素有“塞外龍井”的美譽(yù)，本研究可為金蓮花提取物保健食品的開發(fā)提供必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大興安嶺地區(qū)野生干燥金蓮花，碾磨粉碎后備用。

纖維素酶（3 000U/mg）：湖南生物科技有限公司；乙醇、硫酸、苯酚等試劑（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；AB-8大孔吸附樹脂：天津開允公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-D0料理機(jī)：九陽股份有限公司；AL204電子天平（0.0001g）：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；AKHL一Ⅲ．5804R離心機(jī)：德國(guó)Eppendo公司；UV-6100型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金蓮花多糖提取工藝

1）樣品預(yù)處理：粉碎樣品后，先用石油醚浸提2次，溫度為40℃；再經(jīng)丙酮浸提2次，溫度為50℃；80%乙醇浸提2次，溫度70℃。樣品干燥至恒重，密封備用[13-14]。

2）離心條件：轉(zhuǎn)速4 000 r/min，時(shí)間10min，取上清液備用。

3）滅酶：90℃，10min。

4）真空濃縮：濃縮多糖提取液，至原體積的1/5。

5）醇沉：4℃低溫，80%乙醇溶液醇沉過夜。

6）干燥：冷凍干燥。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及多糖含量的測(cè)定

將葡萄糖放入烘箱，在105℃溫度下烘干至恒重，精確稱取0.050 0 g，配成濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mL，分別以水補(bǔ)至1.0mL，加入6%苯酚溶液1.0mL，再迅速加入濃硫酸5.0mL，攪勻靜置20min，以試劑空白為對(duì)比，于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值，以吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，得回歸方程：C= 0.064 2A-0.001（A為樣品液在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度；C為多糖濃度，mg/mL）。R2=0.9982，在葡萄糖濃度為0～1.4mg/mL的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

金蓮花多糖含量與提取率的測(cè)定：精密稱取金蓮花粗多糖50mg，配成1.0mg/mL的樣品溶液。精密吸取0.5mL溶液，按上法測(cè)吸光值，計(jì)算金蓮花樣品中多糖含量。多糖的提取率用下式計(jì)算：

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在料液比固定在1∶20（g/mL）的條件下，分別考察不同提取溫度（45、50、55、60℃）、不同pH值（3.5、4.5、5.5、6.5）、不同提取時(shí)間（30、60、90、120min）和不同加酶量（9、18、27、36U/g）對(duì)金蓮花多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以溫度、pH值、時(shí)間及加酶量為主要影響因素，根據(jù)響應(yīng)面原理，設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，見表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Test design factors and levels of response surface

1.3.5 粗多糖純化

試驗(yàn)選用大孔樹脂吸附法進(jìn)行脫色處理，選用Sevag法進(jìn)行脫蛋白處理[15]。

靜態(tài)吸附法脫色：取3.0 g處理好的AB-8樹脂置于250mL三角瓶中，向其加入50mL濃度為5.0mg/mL金蓮花多糖溶液，40℃震蕩1.5 h后濾紙過濾測(cè)定。

Sevag法脫蛋白：配置混合溶劑，三氯甲烷∶正丁醇為4∶1（體積比）。將樣品與溶劑混合，取上清液。平行操作3次，計(jì)算脫蛋白率。

脫色率計(jì)算公式：

式中：A前為樹脂處理前溶液在420 nm處的吸光度；A后為樹脂處理后溶液在420 nm處的吸光度。

蛋白去除率計(jì)算公式：

式中：M前為樹脂處理前蛋白質(zhì)質(zhì)量，μg；M后為樹脂處理后蛋白質(zhì)質(zhì)量，μg。

多糖保留率計(jì)算公式：

式中：M前樹脂處理前多糖質(zhì)量，μg；M后分別為樹脂處理后多糖質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)金蓮花多糖提取的影響

溫度對(duì)金蓮花多糖提取的影響見圖1。

圖1 溫度對(duì)金蓮花多糖提取的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction of polysaccharide from Trollius chinensis

由圖1表明：在45℃至55℃溫度變化范圍內(nèi)，提取率逐漸上升，這是由于溫度升高，導(dǎo)致料液分子的運(yùn)動(dòng)速率加大，增大了金蓮花多糖向細(xì)胞外的溶出量；溫度達(dá)55℃時(shí)，金蓮花多糖提取率最大；當(dāng)溫度為60℃時(shí)，提取率下降。這可能由于溫度超過了纖維素酶適宜溫度，影響多糖物質(zhì)的溶出。因此，金蓮花多糖提取溫度選擇55℃為適宜溫度。

2.1.2 pH值對(duì)金蓮花多糖提取的影響

pH值對(duì)金蓮花多糖提取的影響見圖2。

圖2 pH值對(duì)金蓮花多糖提取的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction of polysaccharide from Trollius chinensis

從圖2可知，金蓮花多糖提取率隨著當(dāng)pH值提升而呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。金蓮花多糖提取率最大時(shí)溶液pH值為4.5，這可能是由于此時(shí)纖維素酶處于較為合適的pH值范圍內(nèi)，pH值處于不適合范圍，會(huì)影響酶的活性。因此，確定pH值為4.5為適宜的提取pH值。

2.1.3 時(shí)間對(duì)金蓮花多糖提取的影響

時(shí)間對(duì)金蓮花多糖提取的影響見圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)金蓮花多糖提取的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of polysaccharide from Trollius chinensis

從圖3可見，總體來看，金蓮花多糖提取率隨著提取時(shí)間的增加呈先升后降趨勢(shì)，提取90min時(shí)，多糖提取率最大。提取120min后，多糖提取率呈下降趨勢(shì)，這可能由于在長(zhǎng)時(shí)間酶作用下，有效成分發(fā)生降解，致使多糖提取率降低。因此確定90min為適宜的提取時(shí)間。

2.1.4 加酶量對(duì)金蓮花多糖提取的影響

加酶量對(duì)金蓮花多糖提取的影響見圖4。

圖4 加酶量對(duì)金蓮花多糖提取的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the extraction of polysaccharide from Trollius chinensis

從圖4可見，金蓮花多糖得率隨加酶量的增加而增加，在加酶量為9U/g～27U/g這一范圍內(nèi)，多糖提取率上升趨勢(shì)較為明顯。加酶量大于27U/g時(shí)，提取率增加不顯著。推測(cè)其原因，可能為加酶量為27U/g時(shí)，酶解反應(yīng)較充分，繼續(xù)增加酶用量后，酶與底物的接觸面積過剩反而會(huì)降低反應(yīng)速率。導(dǎo)致多糖提取率增加不明顯，甚至是下降。因此，酶加量控制在兩者之間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Response surface test design and results

續(xù)表2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table2 Response surface test design and results

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table3 Analysis of variance of two polynomial models

經(jīng)軟件分析，得到金蓮花多糖提取的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=10.08+0.16A+0.60B+0.079C+0.093D+0.056AB-0.63AC+0.04AD+0.26BC+1.18BD-0.33CD+0.063A2-0.84B2-0.62C2-0.78D2。其中，Y為多糖提取率。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，由表3可以看出：P＜0.000 1，表明該模型極顯著。

2.3 金蓮花多糖提取的響應(yīng)面分析

利用Design-Expert8.05軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，各因素響應(yīng)效果如圖5～圖10所示。

圖5 pH與溫度對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.5 Effects of temperature and pH on extraction ratio

圖6 溫度與時(shí)間對(duì)提取率的響應(yīng)面Fig.6 Effects of temperature and time on extraction ratio

圖7 溫度與加酶量對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.7 Effects of extraction temperature and enzyme amount on extraction ratio

圖8 pH值與時(shí)間對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.8 Effects of extraction pH and tim eon extraction ratio

圖9 加酶量與pH對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.9 Effects of extraction pH and enzyme amount on extraction ratio

圖10 加酶量與時(shí)間對(duì)提取率的響應(yīng)面圖Fig.10 Effects of extraction time and enzyme amount on extraction ratio

試驗(yàn)對(duì)溫度、時(shí)間、pH及加酶量4個(gè)因素中的一個(gè)因素取零水平時(shí)，另兩個(gè)因素對(duì)金蓮花多糖提取的影響進(jìn)行分析。據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖，圖形形狀與3D圖傾斜度都能反映出各因素之間的相互關(guān)系。等高線為圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著；3D圖傾斜度越高，坡度越陡，說明兩因素交互作用越顯著[16-17]。從圖可以直觀地看出，各試驗(yàn)因素的交互作用較顯著。pH值與溫度為金蓮花多糖提取率有顯著影響的兩個(gè)因素。經(jīng)優(yōu)化后，金蓮花多糖的最佳提取工藝為：溫度55℃，提取時(shí)間102min，pH值4.15，加酶量32.23U/g，金蓮花多糖提取率達(dá)10.43%。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

以上述工藝進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，多糖提取率的平均值為10.40%，與預(yù)測(cè)值相比，兩者相對(duì)誤差僅為0.295%，證明響應(yīng)面法優(yōu)化金蓮花多糖提取率回歸模型較可靠。

2.5 多糖初步純化試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果

多糖初步純化試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果見表4。

從表4中可以看出粗多糖純化試驗(yàn)采用AB-8樹脂聯(lián)合Sevag法純化金蓮花粗多糖，脫色率、脫蛋白率、多糖保留率分別為23.33%、41.778%、85.5%。

表4 多糖初步純化結(jié)果Table4 Purification test results of crude polysaccharide

3 結(jié)論

利用酶解法提取金蓮花多糖，響應(yīng)面法優(yōu)化金蓮花多糖的最佳提取工藝，結(jié)果為：溫度55℃、時(shí)間102min，pH值4.15，加酶量32.23 U/g，多糖提取率達(dá)10.43%。采用AB-8樹脂與Sevag法對(duì)樣品進(jìn)行純化金蓮花多糖，樣品脫色率、脫蛋白率及多糖保留率分別為23.33%、41.778%、85.5%。這為金蓮花的保健食品開發(fā)提供了必要理論依據(jù)。

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Optimization of Extraction of Polysaccharide from Trollius chinensis Bunge in Daxing'an Mountain by Response Surface Method

LIU Yang1，YU Dong-yang2，LI Mei-qi1，QIN Mei-mei1，HE Shan1，PAN Chu1，ZHOU Hong-li3，*
（1.College of Biological and Food Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin132022，Jilin，China；2.Pharmacy Department，Jilin Armed Police Corps Hospital，Changchun 130000，Jilin，China；3.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

Enzymatic extraction and alcohol precipitation method was used to extract polysaccharide from Trollius chinensis Bunge.On the basis of single factor experiments，polysaccharide extraction conditions were studied by response surface analysis method，the effects of temperature，time，pH and enzyme amount on the polysaccharide extraction were studied.The best technological conditions were obtained：temperature 55℃，time 102min，pH 4.15，enzyme amount32.23 U/g，the extraction yield was up to 10.43%under this condition.

Trollius chinensis Bunge；polysaccharide；enzymatic extraction；response surface method

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.011

2016-05-11

吉林市科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（20162011）；吉林化工學(xué)院科研項(xiàng)目（2016065）

劉洋（1984—），男（漢），講師，博士，主要從事現(xiàn)代食品檢測(cè)及食品中活性成分的提取與分離方向的研究。

*通信作者：周鴻立，教授，主要研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。