劉靜，徐莉莉

（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

黑果腺肋花楸黃酮提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化研究

劉靜，徐莉莉

（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

應(yīng)用黑果腺肋花楸作為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸黃酮提取工藝，并利用VC做對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)其還原力及以及·OH、O2-·、DPPH自由基清除力進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度77.67%、提取時(shí)間81min、料液比1∶20（g/mL），在此條件下，黑果腺肋花楸黃酮得率5.14%。影響黑果腺肋花楸黃酮得率因素由大到小依次為乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比。最佳工藝參數(shù)提取的黑果腺肋花楸黃酮對(duì)·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分別為3.27、3.96、3.79mg/mL，最大清除率達(dá)29.58%、70.23%、61.41%，并且其還原能力強(qiáng)，能夠說(shuō)明其體外抗氧化活性較強(qiáng)。

黑果腺肋花楸；黃酮；響應(yīng)面；抗氧化

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種蛋白質(zhì)、碳水化合物維生素等成分[1-2]；還含有一些功能性成分，均對(duì)人體有積極作用，如花色苷、多糖、黃酮、多酚類化合物[3-4]，具有消炎、降血脂、抗疲勞、降血壓等功效，還具有清除機(jī)體自由基的作用[5-6]。目前研究黑果腺肋花楸釀酒等方面較多，其功能性成分的研究并不多見，尤其在我國(guó)，功能性產(chǎn)品仍處于發(fā)展階段，保健類產(chǎn)品較少[7-8]。本研究采用對(duì)黑果腺肋花楸黃酮進(jìn)行提取，并研究其體外抗氧化活性以及對(duì)自由基的清除作用，旨在為開發(fā)黑果腺肋花楸功能性開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸：陜西藤邁生物科技有限公司；Al（NO3）3、NaOH、無(wú)水乙醇、NaNO2、VC、三氯化鐵、DPPH、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品等均為國(guó)產(chǎn)分析純：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

ohaus CP214型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；PF-40B型離心機(jī)：湖南長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；美國(guó)VortexGenie2T旋渦混合器：美國(guó)Scientific Industries公司；7230G掃描型可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；HH-6型數(shù)顯水浴鍋：南京科爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝流程

黑果腺肋花楸→淋洗→瀝水→烘干→粉碎→過(guò)篩（120目）→乙醇提取→分離→過(guò)濾→濾液濃縮→凍干→黃酮

1.3.2 黑果腺肋花楸黃酮提取單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響

在提取時(shí)間80min、料液比1∶20（g/mL）時(shí)，乙醇濃度分別為65%、70%、75%、80%、85%時(shí)，以黑果腺肋花楸黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響。

1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

在料液比1∶20（g/mL）、乙醇濃度75%時(shí)，提取時(shí)間分別為70、75、80、85、90min時(shí)，以黑果腺肋花楸黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響。

1.3.2.3 料液比對(duì)黃酮得率的影響

在提取時(shí)間80min、乙醇濃度75%時(shí)，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）時(shí)，以黑果腺肋花楸黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究料液比對(duì)黃酮得率的影響。

1.3.3 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素結(jié)果，以乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）做因素，以黃酮得率（Y）為指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，確定黃酮提取最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 因素與水平Table1 Factors and levels

1.3.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9-11]

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1 g，向其中加入無(wú)水乙醇（30%）至100mL；從容量瓶中取出5mL，再定容至100mL，可得到0.5mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；從中分別取出0、1、2、3、4、5、6mL溶液于25mL比色管內(nèi)，向比色管中加入無(wú)水乙醇（30%）至10mL，再加濃度5%的NaNO20.8mL，混合均勻，靜止5min，再加濃度10%的Al（NO3）30.8 mL，混勻后靜止5min，繼續(xù)加NaOH溶液（4%）5mL，繼續(xù)向其中加入無(wú)水乙醇（40%）至25mL，混勻后靜置20min，分別取液體于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，同時(shí)用蒸餾水做對(duì)照。以蘆丁質(zhì)量濃度為X軸、吸光值為Y軸，得回歸方程：Y=0.412X＋0.003，R2=0.9997。

1.3.5 黃酮得率的測(cè)定

精確稱取10mL方法1.3.1節(jié)中濃縮濾液，加入比色管中進(jìn)行定容，再按照1.3.4中的方法試驗(yàn)，測(cè)定吸光值，根據(jù)回歸方程可計(jì)算出黃酮含量[12-13]。再根據(jù)公式（1）進(jìn)行計(jì)算黑果腺肋花楸黃酮的得率：

1.3.6 黑果腺肋花楸黃酮體外抗氧化活性試驗(yàn)

利用最佳工藝參數(shù)制取的黃酮為研究對(duì)象，研究其體外抗氧化活性。測(cè)定還原力參照鐵氰化鉀還原法；測(cè)定·OH清除率采用鄰二氮菲法；測(cè)定DPPH自由基清除率參照DPPH法；測(cè)定O2-·清除率采用鄰苯三酚自氧化法[14-15]。

1.3.7 半抑制濃度（half maximal（50%）inhibitoryconcentration，IC50）的計(jì)算

以黑果腺肋花楸黃酮質(zhì)量濃度做橫坐標(biāo)，以黃酮及VC對(duì)·OH、DPPH自由基、O2-·的清除率為縱坐標(biāo)，做出線性曲線，當(dāng)清除率為50%時(shí)黑果腺肋花楸黃酮的質(zhì)量濃度即IC50；以IC50值作為評(píng)價(jià)黑果腺肋花楸黃酮的抗氧化能力指標(biāo)[16]。

2 結(jié)果

2.1 黑果腺肋花楸黃酮提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根據(jù)圖1，當(dāng)乙醇濃度為65%時(shí)，黃酮得率最低，當(dāng)乙醇濃度升高后，黑果腺肋花楸黃酮得率逐漸升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到75%時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮得率最高，為4.52%。繼續(xù)增大乙醇濃度后，黑果腺肋花楸黃酮得率幾乎不變，原因可能是黑果腺肋花楸黃酮已經(jīng)被完全提出，故繼續(xù)提高乙醇濃度沒(méi)有效果。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根據(jù)圖2，當(dāng)提取時(shí)間為70min時(shí)，黃酮得率最低，當(dāng)提取時(shí)間增加后，黃酮得率逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮得率最高，為4.50%。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間后，黑果腺肋花楸黃酮得率幾乎不變，原因可能是黑果腺肋花楸黃酮已經(jīng)被完全提出，故繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率無(wú)影響。

2.1.3 料液比對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響

料液比對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根據(jù)圖3，當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，黑果腺肋花楸黃酮得率最低，隨著料液比的變大，黑果腺肋花楸黃酮得率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)黃酮得率最高，原因可能是，乙醇濃度較小時(shí)，不能夠使得黑果腺肋花楸黃酮完全被提出，當(dāng)液體較多時(shí)，黃酮得率較低。

2.2 黑果腺肋花楸黃酮提取工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

由單因素結(jié)果，利用軟件進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。考察乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率（Y）的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到以黃酮得率為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各因素編碼值的二次回歸方程為：Y= 4.89＋0.98A＋0.71B＋0.23C＋0.55AB＋0.065AC－0.37BC－1.48A2－1.17B2－0.78C2。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差結(jié)果見表3，可信度結(jié)果見表4。

表2 Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Benhnken the central composite experimental design and results

根據(jù)表4、5，此模型P值遠(yuǎn)小于0.01，故此模型極顯著，誤差很小，故能夠用此模型代替真實(shí)值對(duì)黑果腺肋花楸黃酮得率做出分析，R2=98.62%，此模型可靠性高。在回歸模型中，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB，二次項(xiàng)A2、B2、C2，均極顯著，一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)BC，均顯著。方差分析表明，影響黑果腺肋花楸黃酮得率因素由大到小依次為乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比。

表3 回歸方程方差分析表Table3 Analysis of variance table for regression model

表4 回歸模型的可信度分析Table4 Reliability analysis of the established regression model

2.2.2 因素間相互作用響應(yīng)面分析結(jié)果

因素間相互作用響應(yīng)面分析結(jié)果見圖4。

圖4 響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surfaces and contour plots

響應(yīng)面圖能夠說(shuō)明各個(gè)因素間的相互關(guān)系。通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，能夠得到立體圖。等高線也可直觀反映兩因素關(guān)系[17-18]。等高線中橢圓形表示兩因素之間影響極顯著，圓形表示因素間影響不顯著。乙醇濃度（A）與提取時(shí)間（B）為橢圓形，影響極顯著，提取時(shí)間（B）與料液比（C）為橢圓形，影響顯著，而乙醇濃度（A）與料液比（C）為圓形，影響不顯著。

2.2.3 優(yōu)化黑果腺肋花楸黃酮提取工藝參數(shù)

為確定最佳參數(shù)，對(duì)擬合的回歸方程求分別一階偏導(dǎo)數(shù)，并設(shè)其為0，得到三元一次方程組如下：

求解得：A＝0.533、B＝0.200、C＝0，即最佳條件為乙醇濃度為77.67%、提取時(shí)間為81 min、料液比為1∶20（g/mL），在此條件下黑果腺肋花楸黃酮得率為5.14%。

2.3 黑果腺肋花楸黃酮的體外抗氧化活性

黑果腺肋花楸黃酮的體外抗氧化活性見圖5。

圖5 黑果腺肋花楸黃酮的還原力及·OH、O2-·、DPPH自由基清除率Fig.5 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of black fruit Aronia flavonoids

根據(jù)圖5能夠看出，在所試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，黑果腺肋花楸黃酮和VC的還原力均隨著濃度的增大而增大，線性關(guān)系較好，其中4.1mg/mL的黑果腺肋花楸黃酮的還原能力與250μg/mL的VC幾乎一致。黑果腺肋花楸黃酮對(duì)·OH、O2-·、DPPH自由基均能夠起到清除作用，劑量效果明顯，當(dāng)黑果腺肋花楸黃酮質(zhì)量濃度為5.14mg/mL時(shí)，其自由基最大清除率可分別為2 9.58%、70.23%、61.41%，抗氧化活性較好。對(duì)黑果腺肋花楸黃酮的·OH、O2-·、DPPH自由基清除率與質(zhì)量濃度做線性回歸分析，其線性回歸方程分別是：Y（·OH）= 0.0998X－0.0301，R2=0.9976；Y（O2-·）=0.183 2X－0.022 3，R2=0.998 6；Y（DPPH·）=0.160 4X＋0.006，R2=0.999 7，線性關(guān)系很好且劑量關(guān)系明顯；由此能夠計(jì)算出黑果腺肋花楸黃酮的·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分別為3.27、3.96、3.79mg/mL。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果腺肋花楸黃酮提取工藝，并研究其體外抗氧化活性。最佳參數(shù)為乙醇濃度77.67%、提取時(shí)間81min、料液比1∶20（g/mL），在此條件下，黑果腺肋花楸黃酮得率為5.14%。方差分析表明，影響黑果腺肋花楸黃酮得率因素由大到小依次為乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比。制得的黑果腺肋花楸黃酮對(duì)·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分別為3.27、3.96、3.79mg/mL，最大清除率分別達(dá)29.58%、70.23%、61.41%，且表現(xiàn)出很強(qiáng)的還原能力，說(shuō)明其體外抗氧化活性較強(qiáng)。

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Study on Black Fruit Aronia Flavonoids Extraction Process and Its Antioxidant Activity

LIU Jing，XU Li-li
（Department of Food Engineering，Inner Mongolia Business&Trade Vocational College，Huhhot 010070，Inner Mongolia，China）

Black fruit Aronia as raw material，single factor and response surface analysis black fruit Aronia the extraction process，and VCas control its antioxidant capacity and 1，1-diphenyl-2 trinitrobenzene hydrazine radical（DPPH·），superoxide anion radical（O2-·），hydroxyl radical（·OH）scavenging were studied.The resultsshowed that the optimum parameters for the ethanol concentration77.67%，extraction time81min，1∶20（g/mL），in this condition，black fruit Aronia flavonoids yield an average of 5.14%.Effect of black fruit Aronia yield of flavonoids descending factor ethanol concentration>extraction time>solid-liquid ratio.The optimal parameters extracted black fruit Aronia flavonoids on·OH，O2-·，DPPH radical IC50were 3.27，3.96，3.79mg/mL，the maximum clearance rate of29.58%，70.23%，61.41%and showed a strong reducing power，has strong antioxidant activity in vitro.

black fruit Aronia；flavonoids；response surface；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.014

2016-09-04

內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院項(xiàng)目（NSZY1103）

劉靜（1972—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與加工。