余淑英 盧 艷 王星麗 瞿 亮 孫培龍 張安強(qiáng)*

?

金針菇乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選條件的優(yōu)化與應(yīng)用

余淑英1盧 艷1王星麗2瞿 亮2孫培龍1張安強(qiáng)1*

（1. 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)系，浙江杭州 310014；2. 杭州百山祖生物科技有限公司，浙江杭州 310052)

經(jīng)優(yōu)化乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選條件，結(jié)合體外乙酰膽堿酯酶的活性，篩選出具有抗阿爾茨海默的高抑制活性的均一金針菇子實(shí)體多糖組分；采用改良的Ellman法，建立乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選系統(tǒng)，考察其最大吸收波長(zhǎng)、AChE的濃度、ATCI的濃度、顯色劑DTNB的濃度，以及反應(yīng)體系的時(shí)間對(duì)系統(tǒng)的影響，最終確定反應(yīng)體系的最佳條件為：酶反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，最佳檢測(cè)波長(zhǎng)412 nm，AChE的濃度0.05 u/mL，ATCI的濃度0.10 mmol/L，pH=8.0的100 mmol/L PBS緩沖溶液，顯色劑DTNB終濃度0.066 7 mmol/L，通過(guò)乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選發(fā)現(xiàn)了金針菇多糖抑制劑。

金針菇多糖；乙酰膽堿酯酶抑制劑；篩選條件優(yōu)化

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）即老年癡呆癥，是以記憶損傷、認(rèn)知功能障礙、行為障礙和自理能力下降為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病[1,2]。研究認(rèn)為，阿爾茨海默病是一種多病因的疾病，膽堿假說(shuō)是較能夠接受的病理理論，乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療該類(lèi)疾病的有效藥物[3,4]。研究表明，乙酰膽堿酯酶抑制劑不僅能夠提高腦內(nèi)乙酰膽堿的含量，而且能夠阻止Aβ淀粉斑的形成[1~5]。這對(duì)于阿爾茨海默（AD）和很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病病理的研究和初期治療具有非常重要的作用。乙酰膽堿酯酶抑制劑是目前美國(guó)FDA唯一允許用作治療老年癡呆癥的藥物，其中有4種藥物獲得許可，分別為塔克林（Tacrine），加蘭他敏（Galantamine）、多奈哌齊（Donepezil）、利斯的明（Rivastigmine）[6,7]，多屬于生物堿類(lèi)。老年癡呆癥具有發(fā)病緩慢、持久的特點(diǎn)，需要長(zhǎng)期服藥才能見(jiàn)效，而上述幾種藥物多半衰期短，易引起患者肝、胃器官不適等副作用，嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用。而從天然產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)的適宜患者長(zhǎng)期服用、毒副作用小、作用面廣的乙酰膽堿酯酶抑制劑則成了一個(gè)研究的熱點(diǎn)[2]。

金針菇被譽(yù)為“增智菇”，富含蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等，其多糖粗提物能改善記憶障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。范青生等的研究表明，金針菇菌絲體懸液具有顯著增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)能力，鞏固和強(qiáng)化小鼠記憶的作用；并能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，增加T細(xì)胞的數(shù)目，促進(jìn)溶血素抗體的生成[8]。袁仲研究發(fā)現(xiàn)金針菇子實(shí)體可顯著改善記憶力障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，且可活化淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生免疫反應(yīng)[9]。鄒宇曉等研究發(fā)現(xiàn)，金針菇多糖粗提物可有效改善模型小鼠、大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，從動(dòng)物行為學(xué)指標(biāo)上證明了多糖的改善記憶功能[10]。楊文建等通過(guò)研究金針菇不同提取物（水相、石油醚相、乙酸乙酯相和乙醇）的體外乙酰膽堿酯酶活性，發(fā)現(xiàn)水提物具有較強(qiáng)的乙酰膽堿酯酶的抑制活性[11]。為了探索金針菇改善記憶力的作用機(jī)制，本課題對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性的篩選條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了金針菇多糖抑制乙酰膽堿酯酶活性的最佳條件，為新型乙酰膽堿酯酶抑制劑的設(shè)計(jì)合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇子實(shí)體由杭州百山祖生物科技有限公司提供，粉碎成細(xì)粉狀備用。試劑有碘代硫代乙酰膽堿（Acetyhhiocholine, ATCI，美國(guó)sigma公司）、乙酰膽堿酯酶（Acetyl cholinesterase, AChE，美國(guó)sigma 公司）、二硫二硝基苯甲酸（5,5`-Dithio bis-2- nitrobenzoic acid，DTNB，美國(guó)sigma公司）、十二烷基磺酸鈉（SDS，分析純，純度＞99.0%，美國(guó)sigma 公司）、陽(yáng)性對(duì)照石杉?jí)A甲（Huperzine A，純度＞99.0%），均購(gòu)自阿拉丁試劑公司，其他均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi（日立）公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司），Spectra Max M5微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Molecular Devices公司），96孔酶標(biāo)板（美國(guó)康寧公司），DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），ALPHA 2-4 LD冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司），Waters1525 高效液相儀（美國(guó)Waters公司），Waters2414 示差檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司），TSKgel G4000PWXL 高效液相色譜柱（日本TOSOH公司）。

1.3 方法

（1）金針菇多糖的制備。稱(chēng)取烘干至恒重的金針菇子實(shí)體1 600 g進(jìn)行粉碎，95%乙醇回流（脫去部分脂類(lèi)、色素以及其他一些小分子物質(zhì)），超聲輔助水提醇沉法[5] 提取，離心，得到的上清液分別用40%、60%、80%乙醇沉純，再離心得上清液40%、60%、80%組分。采用savage法，即用氯仿︰正丁醇（4︰1）溶液反復(fù)萃取3～4次，離心除去有機(jī)試劑層，濃縮揮干殘余有機(jī)試劑，除去粗多糖中游離的蛋白，各組分溶液冷凍干燥得到黃色固體粉末，分別命名為FVP40、FVP60和FVP80。

（2）乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選優(yōu)化條件。

AChE在100 mmol/L、37 ℃、pH=8.0的PBS中保持良好的活性[12]，選用該條件下的PBS及反應(yīng)溫度。根據(jù)Ellman法[13]，反應(yīng)體系檢測(cè)波長(zhǎng)選擇412 nm。配置1 U/mL的AChE稀釋液400 μL，分別吸取上述AChE稀釋液10、20、40、60、80、100 μL于6個(gè)編號(hào)的潔凈干燥離心管中，用PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液補(bǔ)充體積到100 μL，得到不同濃度的AChE標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 μL上述不同濃度的AChE溶液，70 μL pH=8.0的PBS，20 μL 1 mmol/L的DTNB溶液于96孔酶標(biāo)板中，37 ℃、預(yù)孵2 min，加入20 μL1 mmol/L的底物ATCI溶液，37 ℃恒溫反應(yīng)，每隔90 s測(cè)定412 nm處吸光度值（OD），PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液為空白對(duì)照，60 min，重復(fù)3次，確定酶反應(yīng)終濃度[14]。

圖1 總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：為雙倒數(shù)圖，縱軸上的截距為1/Vm，橫軸上的截距為-1/Vm，直線的斜率為Km/Vm。

底物ATCI終濃度的確定[15]：PBS（c=100 mmol/L，pH=8.0）緩沖溶液為空白對(duì)照，對(duì)0.1、0.13、0.2、0.3、0.6、0.8、1.2 mmol/L的ATCI溶液反應(yīng)初速度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試條件同上，每隔60 s測(cè)定412 nm處吸光度值，共45 min，平行測(cè)3次，以確定最終ATCI濃度。

顯色劑DTNB終濃度的確定[16]：配置1.0 mmol/L DTNB儲(chǔ)備液。PBS緩沖溶液為空白對(duì)照，分別對(duì)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L不同濃度的DTNB溶液的反應(yīng)初速度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試條件同酶反應(yīng)終濃度。3次平行試驗(yàn)。

反應(yīng)時(shí)間的確定[17]：體系反應(yīng)時(shí)間確定的測(cè)試條件同酶反應(yīng)終濃度，每隔60 s測(cè)定一次412 nm處OD值。PBS緩沖溶液代替AChE溶液為空白對(duì)照。測(cè)定3次，3次平行試驗(yàn)。

樣品抑制率：將樣品配成各種濃度待測(cè)。吸取10 μL 不同濃度的樣品溶液，70 μL pH=8.0的PBS，20 μL DTNB溶液于96孔酶標(biāo)板中，37 ℃、預(yù)孵2 min，后加20 μL ATCI溶液，37 ℃恒溫反應(yīng)30 min再加入20 μL SDS終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀412 nm處測(cè)定吸光度值。完全抑制組用10 μL石杉?jí)A甲溶液代替10 μL樣品溶液；空白組用10 μL PBS（pH=8.0）代替10 μL樣品溶液，樣品對(duì)照組用15 μL LPBS（pH=8.0）代替15 mL AChE溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗多糖的分離

（1）總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)苯酚－硫酸法所測(cè)定的結(jié)果畫(huà)出散點(diǎn)圖的總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），散點(diǎn)擬合的直線方程為=0.008 5+0.024 9，2=0.995 5。其中為葡萄糖含量（μg），為490 nm處的吸光值。

（2）還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNS比色法測(cè)得還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），散點(diǎn)擬合直線方程為=0.008 5+0.024 9，2=0.997 7。其中為葡萄糖含量（μg），為520 nm處的吸光值。

（3）FVP40、FVP60、FVP80組分的多糖。 采用水提醇沉法得到的各組分，根據(jù)還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可求得FVP40、FVP60、FVP80粗多糖的還原糖和總糖的含量。HPLC測(cè)得各組分的液相數(shù)據(jù)，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到分子量范圍（表1）。

表1 三組分的粗多糖產(chǎn)量、糖含量及分子量

2.2 乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選優(yōu)化條件

（1）酶反應(yīng)終濃度[18]。以不同酶濃度下的反應(yīng)初速度0為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸圖（圖3），得到線性回歸方程：=0.207 5+0.000 4，相關(guān)系數(shù)=0.994 2。結(jié)果表明，直接反應(yīng)酶濃度與吸光值成正比例關(guān)系，乙酰膽堿酯酶在0～0.066 7 U/mL范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系，故反應(yīng)體系酶終濃度應(yīng)控制在0.066 7 U/mL以內(nèi)。由于實(shí)驗(yàn)室條件限制，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，乙酰膽堿酯酶的終濃度確定為0.05 U/mL。

圖3 乙酰膽堿酯酶濃度與反應(yīng)初速度的關(guān)系

圖4 乙酰膽堿酯酶活性的Lineweaver-Burk曲線

圖5 顯色劑DTNB終濃度與吸光值的關(guān)系

圖6 乙酰膽堿酯酶反應(yīng)過(guò)程曲線圖

（2）底物ATCI終濃度[19]。按Lineweaver-Burk法作雙倒數(shù)圖（圖4）[20]，可得米氏常數(shù)Km的值為0.095 mmol/L。由于在篩選酶抑制劑時(shí)，并不知道抑制劑的作用類(lèi)型，為減少I(mǎi)C50的誤差，使篩選體系靈敏度更高，所用底物的濃度應(yīng)接近Km值，因此該反應(yīng)體系的底物ATCI終濃度確定為0.10 mmol/L。

（3）顯色劑DTNB終濃度。在酶濃度0.05 U/mL和底物濃度0.10 mmol/L條件下，吸光度值隨著衍生劑DTNB的濃度增大而增大（圖5）。當(dāng)顯色劑DTNB濃度達(dá)到0.007 mmol/L時(shí)吸光值不再增大，說(shuō)明反應(yīng)已達(dá)飽和，結(jié)合實(shí)際操作，顯色劑DTNB的終濃度確定為0.066 7 mmol/L。

（4）反應(yīng)時(shí)間[21]。AChE催化水解ATCI需要一定的時(shí)間，若反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，吸光度值太小，背景干擾比較大；反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，AChE活性則會(huì)出現(xiàn)衰減，不能準(zhǔn)確測(cè)定酶的活性。結(jié)果如圖6所示，在30 min之內(nèi)乙酰膽堿酯酶的反應(yīng)呈良好的線性關(guān)系，反應(yīng)處在穩(wěn)態(tài)階段[22]。為了在較短的時(shí)間內(nèi)得到較為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取30 min作為反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)的OD412可間接反映其反應(yīng)速率。

2.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性的篩選條件

反應(yīng)體系的總體積120 μL，緩沖體系pH=8.0的100 mmol/L PBS緩沖溶液，AChE終濃度為0.05 U/mL，ATCI終濃度為0.10 mmol/L，顯色劑DTNB終濃度為0.066 7 mmol/L，體系反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，測(cè)定波長(zhǎng)為412 nm。此外，當(dāng)石杉?jí)A甲的濃度為70 μg/L[2]時(shí)，已達(dá)到了酶篩選模型的標(biāo)準(zhǔn)，所以陽(yáng)性對(duì)照為70 μg/L的石杉?jí)A甲。

2.4 FVP40、FVP60、FVP80三組分乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究

分別配制三組分0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液。采用2.3節(jié)的酶活測(cè)試條件，酶標(biāo)儀中反應(yīng)30 min后測(cè)412 nm處的吸光值。結(jié)果如圖7所示，F(xiàn)VP60組分濃度為0.8 mg/mL時(shí)對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制率最高，達(dá)到46.17%，此時(shí)FVP80組分的乙酰膽堿酯酶活性抑制率最低。總的來(lái)看，三組分對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制能力為FVP80＜FVP40＜FVP60，并隨樣品濃度的增加呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，F(xiàn)VP60表現(xiàn)出較好的乙酰膽堿酯酶的抑制活性。

3 討 論

采用改良的Ellman法建立了金針菇乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選優(yōu)化條件：100 mmol/L、pH=8.0 PBS緩沖溶液，AChE、ATCI、顯色劑DTNB的終濃度分別為0.05 u/mL、0.10 mmol/L、0.066 7 mmol/L，陽(yáng)性對(duì)照石杉?jí)A甲70 μg/L，體系反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，測(cè)定波長(zhǎng)412 nm。該法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠達(dá)到對(duì)抑制物的快速篩選。且在此條件下測(cè)定從金針菇子實(shí)體中提取的三個(gè)組分均對(duì)乙酰膽堿酯酶表現(xiàn)顯著的抑制活性，其中FVP60組分在0.8 mg/mL濃度下對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制率最高，達(dá)46.17%。以上結(jié)果表明，金針菇多糖對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究具有巨大的潛力，為金針菇多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為老年癡呆癥的治療藥物研制提供一種新的思路。

[1] Pang YP, Quiram P, Jelacic T, et al. Highly potent, selective, and low cost bis-tetrahydroaminacrine inhibitors of acetylcholinesterase-steps toward novel drugs for treating Alzheimer disease[J]. J Biol Chem, 1996, 271(39): 23649.

[2] 鄒磊, 全明海, 程永強(qiáng), 等. 乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2005, S1: 105-108.

[3] Perry E K. The cholinergic hypothesis, ten years on[J]. Br Med Bull, 1986, 42: 63-69.

[4] Munoz-Torrero D, Camps P. Dimeric and hybrid anti-Alzheimer drug candidates[J]. Curr Med Chem, 2006, 13(4): 399-422.

[5] 王穎, 姚笛, 王憲青, 等. 超聲波輔助熱水浸提法制備金針菇粗多糖工藝條件的優(yōu)化[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào), 2011(3): 47-50.

[6] Bernd Ibach, Ekkeha rd Haen. Ace ty lcho linesteraseinhibitionin alzheimers disease[J]. Current PharmaceuticalDesign, 2004 , 10(3): 231-251 .

[7] 張赟彬, 宋慶, 胡劉巖. 天然產(chǎn)物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究現(xiàn)狀[J]. 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011(1): 1-6.

[8] 范青生, 魏華, 謝俊杰, 等. 培養(yǎng)的富鋅金針菇對(duì)小鼠學(xué)習(xí)能力和免疫功能的影響[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 1995, 17(1): 89-91.

[9] 袁仲. 金針菇的保健功能與加工利用[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊, 2005, 6(7): 125-128.

[10] 鄒宇曉, 廖森泰, 吳娛明, 等. 金針菇多糖提取物對(duì)記憶障礙模型大鼠、小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2010, 10(1): 26-29.

[11] Wenjian Yang,Yong Fang, Jin Liang, et al. Optimization of ultrasonic ofpolysaccharides and evaluation of its acetylcholinesterase inhibitory activity[J]. Food Research International, 2011, 44: 1269-1275.

[12] Kang S.R., Lee K.Y., Park M.J., et al.Decursin from Angelica gigas mitigates amnesia induced by scopolamine in mice[J]. Neurobiology of learning and memory, 2003, 79(1): 11-18.

[13] Ellman GL, Courtney KD, Andres V, et al. A New and Rapid Colorimetric Determinatio of Acetylcholinesterase Activity[J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7: 88-95.

[14] Ellman Man GL, Courtney K.D., et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J]. Biochem Pharmacol, 1961, 2(7) : 88-95.

[15]Ferreira A, Proenca C, Serralheiro ML, et al．The in vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidantactivity of medicinal plants from Portugal[J]. J Ethnopharmacol, 2006, 108(1) : 31-37.

[16 ] 張耀東, 蔡亞楠, 張琦, 等. 淫羊藿苷對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(9): 1141-1146.

[17] 楊付梅, 孫黔云. 丁酰膽堿酯酶抑制劑微量篩選模型的研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2009, 25(5) : 690 – 692.

[18] 孫黔云, 楊付梅. 乙酰膽堿酯酶抑制劑微量篩選模型的比較研究[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2008, 24(10): 1387- 1392.

[19] 夏宗玲, 許建平, 鄒素蘭. 探針?biāo)幬锓y(cè)定CYP450 3A的活性[J]. 藥學(xué)與臨床研究, 2010(02): 142-144, 148.

[20] 陳惠黎, 李文杰. 分子酶學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社. 1983: 197.

[21] 馮章英, 周丹, 楊然耀, 等. 乙酰膽堿酯酶抑制劑高通量篩選方法的優(yōu)化及應(yīng)用[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2013, 11: 1246-1251.

[22]張翼, 馮妍, 李曉明, 等. 海藻組分抑制乙酰膽堿酯酶活性研究[J]. 海洋與湖沼, 2005, 36(5): 459-463.

Optimization and application of acetylcholinesterase inhibitor screening criteria from the fruiting body of

Yu Shuying Lu Yan Wang Xingli Qu Liang Sun Peilong Zhang Anqiang

（1. Department of Food Science and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China）（2. Hangzhou Baishanzu Biological Science and Technology Co. Ltd, Hangzhou 310052, China）

In order to optimize the screening conditions for acetylcholinesterase inhibitors and combine with in vitro activity of acetylcholinesterase and screen with high inhibiting activity of anti-Alzheimer uniformpolysaccharide. The improved Ellman method was used to establish an acetylcholinesterase inhibitor screening system and investigate influences on the system by the maximum absorption wavelength, the concentration of AChE, ATCI concentration, the concentration of reagent DTNB, time of system, and ultimately determine the optimum conditions of the reaction system. A screening model for AChEIs was optimized with temperature 37 ℃, reaction time 30 min, wavelength 412 nm, the concentration of AChE 0.05 u/mL, a concentration of ATCI 0.10 mmol/L, 100 mmol/L PBS buffer solution pH=8.0, color agent DTNB final concentration 0.066 7 mmol/L; Through the screening of acetylcholinesterase inhibitors found FVP inhibitors.

polysaccharide of; acetylcholinesterase inhibitor; screening and optimization

S646

A

2095-0934（2017）01-034-06

國(guó)家十二五科技支撐項(xiàng)目“食用菌深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與產(chǎn)業(yè)化”（2013BAD16B07）

，E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn