靳正忠,王寧,包慧芳*,侯敏,陳福雙

（1.中國科學院新疆生態(tài)地理研究所,新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所 新疆 烏魯木齊 830091；3.福雙果業(yè)有限責任公司，新疆 伽師 844300)

高產乙醇的釀酒酵母的篩選及性能檢測

靳正忠1,王寧2,包慧芳2*,侯敏2,陳福雙3

（1.中國科學院新疆生態(tài)地理研究所,新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所 新疆 烏魯木齊 830091；3.福雙果業(yè)有限責任公司，新疆 伽師 844300)

目的是從新疆葡萄酒產地篩選適合當地生境的野生酵母菌種資源。采用可培養(yǎng)方法，分離符合條件的酵母菌株，對其生理生化、分子生物學及生長耐受性等各方面進行更細致研究。從釀酒葡萄鮮果、種植土壤及白蘭地發(fā)酵基質中篩選到酵母菌36株，隨后通過WL瓊脂培養(yǎng)基初篩，獲得符合產酒精特征的菌株10株。對這10株酵母菌進行生長發(fā)酵能力的復篩檢測，編號為B5、B6、B9的三株菌經過48h的發(fā)酵，酒精發(fā)酵能力較好。進而結合生理生化及分子測序鑒定，分離的三株菌均屬于釀酒酵母。在對供試菌株進行耐受性檢測中，B5的酒精耐受性最高可達16%、B6、B9為14%；B5、B9最高可耐受2.0 mol/L KCl，B6最高可耐受2.25 mol/LKCl，同時，三株菌均能耐受50%的葡萄糖濃度，具有較廣泛的酸堿適應性，熱致死溫度都為61℃～64℃之間，耐受10d饑餓后，仍能良好生長。獲得3株有良好應用潛能的野生釀酒酵母菌株，為保護該區(qū)微生物資源及開發(fā)工業(yè)菌株具有重要意義。

釀酒酵母；乙醇；耐受性

一、引言

新疆天山北麓擁有得天獨厚的釀酒葡萄種植基地，與同處北緯44°的美國加州和法國波爾多并稱為“世界三大天堂級葡萄產區(qū)”，原生態(tài)、零污染的自然條件為釀酒酵母提供了優(yōu)勢生長環(huán)境[1]。生產實踐中對酵母菌株的生理特性有一定的要求，工業(yè)發(fā)酵生產要求發(fā)酵菌株不僅要具有良好發(fā)酵性能,同時要能耐受高溫、高糖、高滲透壓,才能夠節(jié)約冷卻用水、降低能耗、縮短發(fā)酵時間,提高乙醇的生產效率和設備的利用率。選育適合新疆葡萄酒生產工藝的菌種對本地酒業(yè)的持續(xù)發(fā)展具有重要意義。人們利用純培養(yǎng)的酵母菌生產葡萄酒已經有一個世紀的歷史，葡萄酒生產中使用的酵母多種多樣，各具特色。突變、雜交和DNA重組在釀酒酵母育種工作中也取得了廣泛的應用[2,3]?，F代葡萄酒的生產和消費不僅需要高效率地將葡萄汁中的糖轉化為酒精，更希望得到風格各異的商品化產品。此目標的實現不僅依靠工藝的改進，具有優(yōu)良特性發(fā)酵菌種的獲得也是生產中極為關鍵的技術資源。本研究從新疆葡萄酒產地篩選適合當地生境的野生酵母，并對其生理生化、分子生物學及生產應用等各方面進行更細致全面的研究，以期獲得改善本地葡萄酒釀造品質的菌種資源。

二、材料與方法

（一）材料

1.樣品來源。2014年10月，從昌吉葡萄種植園采集釀酒葡萄鮮果及土壤，并從伽師縣福雙果業(yè)有限責任公司采集自然發(fā)酵白蘭地基質用于分離酵母菌株。

2.主要試劑及來源。葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、蔗糖等均為國產分析純試劑，引物、dNTPs、Taq酶等試劑均購自上海生工生物技術服務有限公司。

3.培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基:馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA),YPD培養(yǎng)基[3]。

初篩培養(yǎng)基:WL瓊脂培養(yǎng)基。

復篩發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%,氯化銨0.15%,磷酸氫二鉀0.15%,硫酸鎂0.1%,氯化鈣0.28%, 0.06MPa滅菌15 min。

（二）方法

1.產酒精酵母菌株的篩選。酵母菌的分離:將采集到的新鮮樣品適當稀釋后涂布于酵母菌分離培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)2～3d,挑取具有典型酵母菌菌落特征的單菌落,在PDA固體平板上經劃線分離純化后鏡檢,初步去重復，保存?zhèn)溆谩?/p>

產酒精酵母菌株的初篩:將分離獲得的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基活化24 h后接種至WL瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5 d后觀察，篩選出菌落顏色為奶油色（淺黃色）至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株。

產酒精酵母菌株的復篩：將初篩獲得的酵母菌按相同的接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗,30℃培養(yǎng)，發(fā)酵結束后通過測定其總失重、酒精度和殘還原糖,復篩出性狀良好的酵母菌株。

酒精度的測定:取100 mL成熟發(fā)酵液到蒸餾瓶中,加入100 mL水,混勻后蒸餾,準確取餾出液100 mL,用酒精計(標溫20℃)測酒精度(下緣為準),同時測定溫度,然后換算成20℃時的酒精度[4]。

CO2失重量的測定：將活化后的菌液轉接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng),以空白的發(fā)酵液作對照。每隔12 h稱重一次,以相鄰2次的質量差值作為CO2失重量。當CO2失重量小于0.1g時發(fā)酵結束。

殘還原糖測定:菲林試劑直接滴定法[4]。

2.酵母菌的分類鑒定。生理生化鑒定：糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化試驗，具體參見文獻[5]。

分子生物學鑒定：挑取新鮮單菌落置于30μl 0.2%SDS中；漩渦混勻器上混勻15秒；90℃熱激4min；4℃13000rpm×1min，離心，取上清液20μl至新的無菌離心管中，-20℃保藏。利用通用引物（ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增。反應體系為：10×ExTaq Buffer 5μl，dNTPs 4μl，ExTaq酶0.5μl，模板DNA1μl，引物各2μl，加超純水至50μl。反應程序為95℃5min；94℃1min；52℃1min；72℃1min20s，循環(huán)36次；72℃延伸8min。

3.供試酵母菌耐性實驗[6,7]。酒精耐受性測定：將滅菌后的YPD瓊脂培養(yǎng)基降溫至40℃左右，按10%、12%、14%、16%、18%(v/v)的濃度加入乙醇，接種新鮮單菌落在YPD固體平板進行生長實驗，一周后以生長狀況表征其酒精耐受性。

滲透脅迫耐受性測定:配制終濃度為1.0mol/L、1.5 mol/L、1.75 mol/L、2.0 mol/L、2.25 mol/L、2.5 mol/LKCl到YPD液體培養(yǎng)基中，接種新鮮單菌落培養(yǎng)2d，以生長狀況表征其滲透脅迫耐受性。

高糖耐受性測試：在含有10%、20%、30%、40%、50%的葡萄糖的YPD斜面培養(yǎng)基進行生長實驗，以生長狀況表征其對不同濃度糖的耐受性。培養(yǎng)兩周后觀察生長差異。

熱致死溫度測定：將接種后的YPD液試管浸入水浴鍋中,以不接種的空白試管作為對照,其中插入溫度計,當空白管的溫度達到40℃時,開始記錄時間,并保持10 min,然后立即拿出,在冷水中冷卻至室溫,最后將試管置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同法測定45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下的活菌數。

營養(yǎng)饑餓耐受性測定：將各菌株在無菌水中30℃分別靜置饑餓5d、6d、7d、8d、9d、10d，在YPD液體培養(yǎng)基進行生長實驗，培養(yǎng)2d后以活菌數表征其營養(yǎng)饑餓耐受性。

酸堿耐受性測試：配制不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的發(fā)酵培養(yǎng)基,接種后于30℃培養(yǎng)48h,測定不同pH值條件下酵母菌的OD600值及發(fā)酵力。

三、結果與分析

（一）釀酒酵母的初篩及復篩結果

利用PDA培養(yǎng)基對10份樣品（5份鮮果、3份土壤、2份發(fā)酵基質）進行酵母菌的篩選，通過形態(tài)觀察及鏡檢結果，初步去重，共篩選酵母菌36株，多數為多端出芽的橢球型菌株。隨后將分離的所有酵母菌株經YPD固體培養(yǎng)基活化，24h后接種到WL瓊脂培養(yǎng)基上，各菌株分別作三個重復，獲得符合產酒精特征的菌株10株，即菌落顏色為奶油色（淺黃色）至綠色，球形突起，光滑，不透明，編號為B1-B10。對這10株酵母菌進行生長發(fā)酵能力的復篩檢測，編號為B5、B6、B9的三株菌經過48h的發(fā)酵，酒精發(fā)酵能力較好，結果見表1。

表1 復篩發(fā)酵結果比較

（二）釀酒酵母菌的分類鑒定

對復篩獲得的3株酵母菌進行生理生化檢測，結果見表2。在氮源基礎培養(yǎng)基中，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖，檢測菌株的糖發(fā)酵能力，結果顯示所有菌均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不能發(fā)酵乳糖；在對碳源同化的檢測中，均能同化半乳糖、棉籽糖，不能同化鼠李糖、纖維二糖、菊糖、肌醇、L-阿拉伯糖、D-木糖、可溶性淀粉和山梨糖。在碳源基礎培養(yǎng)基中，分別加入硫酸銨、天門冬素、硝酸鉀和亞硝酸鈉，檢測三株菌的氮源同化能力，結果表明所有菌均能發(fā)酵硫酸銨、天門冬素，不能同化硝酸鉀和亞硝酸鈉。對糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化的結果與菌種鑒定手冊中釀酒酵母鑒定結果一致。

表2 三株酵母菌的生理生化特性比較

進一步對酵母菌進行ITS區(qū)分子鑒定，將所測結果提交至Genebank數據庫中進行相似性比較，與這3株菌相似性最高的菌株均屬于Saccharomyces cerevisiae，相似性為99%～100%，因此，將分離的菌株鑒定為Saccharomyces cerevisiae，Genebank注冊號為：KR063021-KR063023。圖1為與選定的同源性較高的相關菌株26Sr RNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹。生理生化檢測及分子鑒定結果均證明分離的菌株應屬于釀酒酵母。

圖1 各菌株系統(tǒng)發(fā)育樹狀關系

（三）釀酒酵母耐受性實驗

酵母菌在發(fā)酵液中發(fā)酵,到某一時刻即停止,其最大原因是由于乙醇濃度增大所致,高乙醇濃度對酵母的生長繁殖有延滯作用,會抑制其發(fā)酵活性。因此,酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于它們自身對乙醇耐受力的大小。本實驗檢測到B5的酒精耐受性最高可達16%、B6、B9為14%，高于此濃度均不能生長。

在自然繁殖或工業(yè)培養(yǎng)過程中，酵母常常會受到高鹽、高糖等條件的影響，所以細胞自身的滲透調節(jié)是其非常重要的生物學反應。發(fā)酵醪的滲透壓高可引起細胞內水分活度、細胞質組成發(fā)生顯著變化，從而抑制酵母的生長和發(fā)酵。因此，酵母具有耐高滲和耐高糖性能就可以很好地為生產服務。經檢測，B5、B9最高可耐受2.0 mol/LKCl，B6最高可耐受2.25 mol/LKCl，三株菌均能耐受50%的葡萄糖濃度。

液態(tài)培養(yǎng)的微生物,在某溫度下10 min即被殺死,此溫度稱為微生物的熱致死溫度。通常情況下以測得的能發(fā)酵的最高溫度加1～2℃為該菌的熱致死溫度。通過活菌計數，三株菌均能在60℃生長，不能在65℃以上的溫度生長。因此，B5、B6、B9的熱致死溫度為61～64℃之間。

隨著發(fā)酵過程的進行，營養(yǎng)物質的消耗會影響微生物發(fā)酵能力，釀酒酵母對營養(yǎng)饑餓耐受性好是發(fā)酵工藝特別是連續(xù)發(fā)酵工藝所要求的良好性質。本實驗中，各菌株在25℃溫箱分別靜置饑餓培養(yǎng)10d后，均能良好生長。

酵母菌進行繁殖的適宜環(huán)境根據不同的菌株而有所區(qū)別，通過測定不同pH值條件下菌株的生物量及發(fā)酵力,以確定其耐酸堿性。結果表明，B5在pH值1.0～9.0范圍內生長良好,B6的pH耐受范圍為2.0～8.0，B9為2.0～9.0。相比之下，B5具有更廣泛的酸堿適應性，尤其pH4.0時發(fā)酵力最強。

四、討論

在葡萄汁和葡萄酒中存在著很多不同的酵母種類，其分類地位、形態(tài)特征和生物、化學特征各有不同，其中有的有利于葡萄酒釀造，有的則不利于葡萄酒釀造[8]。與葡萄酒釀造相關的酵母中以酵母屬最為重要，通常使用該屬的酵母有釀酒酵母和貝酵母等種的菌株。從自然生境中篩選對釀造有利的菌株必須先對篩選到的菌株進行分類地位的確定。傳統(tǒng)的鑒定方法是通過形態(tài)學、生理生化性狀等對釀酒酵母進行鑒定，將實驗結果與標準系統(tǒng)進行對比得出鑒定結論，但存在繁瑣耗時費力，操作不方便，因實驗條件不同，重現性不好的缺陷。分子生物學方法因可快速鑒定，目前得到廣泛使用，兩種鑒定方法結合可使結果更加準確。

在酵母酒精發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵作用和其他代謝活動同時存在，酵母除了將葡萄汁92%～95%的糖發(fā)酵生成酒精、CO2和熱量外，還能夠利用剩余的糖產生一系列的其他化合物，稱為酒精發(fā)酵副產物[9]。酵母菌的代謝副產物不僅影響著葡萄酒的風味和口感，而且有些副產物如辛酸還會對酵母的生長具有抑制作用。本研究中篩選獲得的菌株發(fā)酵后期均顯示符合發(fā)酵成熟曲指標且有較好的生長耐受性，但是否能改善葡萄酒的特色和風味尚需進一步驗證。

五、結論

從釀酒葡萄鮮果、種植土壤及白蘭地發(fā)酵基質中篩選到酵母菌36株，隨后通過WL瓊脂培養(yǎng)基初篩，獲得符合產酒精特征的菌株10株。對這10株酵母菌進行生長發(fā)酵能力的復篩檢測，編號為B5、B6、B9的三株菌經過48h的發(fā)酵，酒精發(fā)酵能力較好。進而與菌種鑒定手冊比較糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化試驗結果，確認篩選的3株菌為釀酒酵母，通過26Sr RNA基因序列測序分析，使用Blast在線軟件進行相似性分析,測序結果查詢GenBank數據庫，得到結果證實篩選出的酵母的確是釀酒酵母。

對篩選的3株釀酒酵母菌株進行一系列耐受性檢測，結果檢測到B5的酒精耐受性最高可達16%；B6、B9為14%；B5、B9最高可耐受2.0 mol/L KCl，B6最高可耐受2.25 mol/L KCl，B5在pH值1.0～9.0范圍內生長良好,B6的pH耐受范圍為2.0～8.0，B9為2.0～9.0。相比之下，B5具有更廣泛的酸堿適應性；同時，三株菌均能耐受50%的葡萄糖濃度，熱致死溫度都為61～64℃之間，在25℃溫箱分別靜置饑餓培養(yǎng)10d后，均能良好生長。因此，這三株菌（尤其B5）具有良好的應用開發(fā)潛能，可進一步擴大發(fā)酵檢測的規(guī)模。

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（編輯：魏翔）

S641.2

A

1673-9019(2017)01-0034-04

2016-5-10

靳正忠（1978-），男，甘肅環(huán)縣人，副研究員，主要從事微生物多樣性研究；

包慧芳（1978-），女，湖南華容人，副研究員，主要從事發(fā)酵工程研究。