趙旭，汪坤，王楠斐

河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

論著·中藥研究與開發(fā)

響應(yīng)面法優(yōu)選兩頭尖的提取工藝

趙旭，汪坤，王楠斐

河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

目的優(yōu)選兩頭尖的提取工藝條件。方法以竹節(jié)香附素A提取率為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間對(duì)兩頭尖提取工藝的影響。結(jié)果優(yōu)化的提取工藝條件為：乙醇濃度82%，液料比為11.7∶1，提取2次，每次2 h。在該優(yōu)化條件下，竹節(jié)香附素A的提取率為2.24 mg/g。結(jié)論該優(yōu)化工藝簡(jiǎn)便、預(yù)測(cè)性良好，可以為兩頭尖的開發(fā)提供參考。

兩頭尖；響應(yīng)面法；竹節(jié)香附素A

兩頭尖為毛茛科植物多被銀蓮花Anemone raddeana Regel的干燥根莖，具有祛風(fēng)濕、消癰腫功效，用于治療風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、骨節(jié)疼痛、癰腫潰爛等[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，兩頭尖抗腫瘤作用顯著，其主要化學(xué)成分為皂苷類，其中竹節(jié)香附素A含量較高，抗腫瘤活性較強(qiáng)[2-3]。

目前兩頭尖的提取工藝研究設(shè)計(jì)方法主要為正交試驗(yàn)法[4]，提取方法有超臨界提取法[5]、回流提取法[6]、微波提取法[7]等，一般以總皂苷為指標(biāo)性成分。響應(yīng)面法目前已廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8-10]，其分析方法直觀，精密度更高，預(yù)測(cè)性更好。本研究運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以竹節(jié)香附素A為考察指標(biāo)，優(yōu)選兩頭尖加熱回流提取工藝。

1 儀器與試藥

Aglient-1260高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；AE240型十萬(wàn)分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

竹節(jié)香附素A對(duì)照品（批號(hào)110718-201108），中國(guó)食品藥品檢定研究院。兩頭尖購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)河南省中醫(yī)院黃小敏副主任中藥師鑒定為毛茛科植物多被銀蓮花Anemone raddeana Regel的干燥根莖。乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 竹節(jié)香附素A含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～7 min，47%A；7～5 min，47%～55%A），檢測(cè)波長(zhǎng)206 nm，柱溫25 ℃，流速1 mL/min。理論塔板數(shù)以竹節(jié)香附素A計(jì)算不低于4000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取竹節(jié)香附素A對(duì)照品1.10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取兩頭尖粗粉3 g，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件加熱回流提取，濾紙過濾收集提取液，水浴揮干后用甲醇定容至50 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取竹節(jié)香附素A對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝513.47X－0.060 7（r2＝1），竹節(jié)香附素A線性范圍為0.22～1.32 μg。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取竹節(jié)香附素A對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算竹節(jié)香附素A峰面積RSD＝1.88%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取兩頭尖粗粉3 g，按供試品溶液制備方法制備（10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h），分別放置0、2、4、6、8 h后進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算竹節(jié)香附素A峰面積RSD＝2.14%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取兩頭尖粗粉6份，每份3 g，按供試品溶液制備方法制備（10倍量90%乙醇提取2次，每次1.5 h），分別進(jìn)樣10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算竹節(jié)香附素A峰面積RSD＝2.96%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的兩頭尖提取液6份，每份1 mL，置于10 mL量瓶中，加入相當(dāng)于兩頭尖提取液中含有量的竹節(jié)香附素A對(duì)照品，加甲醇定容，計(jì)算平均回收率為98.43%，RSD＝1.97%，結(jié)果表明本法回收率良好。

2.2 提取工藝優(yōu)選

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)為2次，選擇乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間為自變量，以竹節(jié)香附素A提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平中心復(fù)合試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 提取工藝中心復(fù)合試驗(yàn)因素水平

稱取兩頭尖粗粉，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案提取，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定竹節(jié)香附素A含量，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.06軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

經(jīng)Design Expert 8.06軟件擬合，得竹節(jié)香附素A提取率Y對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比的回歸方程Y＝2.45＋0.15A＋0.077B＋0.20C－0.007 5AB＋0.36AC＋0.097BC－0.30A2－0.086B2－0.27C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及分析結(jié)果

表3 回歸模型的顯著性檢驗(yàn)

由表3可知，模型回歸P值為0.000 4，說明模型回歸顯著可靠；失擬誤差P值為0.426 8（P＞0.05），說明失擬度不明顯；相關(guān)系數(shù)r2＝0.961 0，調(diào)整值為0.910 8，說明該方程擬合度較高，該模型可以預(yù)測(cè)兩頭尖提取工藝過程。

乙醇濃度、液料比、乙醇濃度與液料比的交互作用、乙醇濃度的平方對(duì)綜合評(píng)分的影響較顯著（P＜0.05），在3個(gè)因素之間，乙醇濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響最大。

根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，分別繪制各指標(biāo)與響應(yīng)值交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖，以確定各因素對(duì)兩頭尖提取工藝的影響，結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖2 液料比與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)面圖

圖3 液料比與提取時(shí)間交互作用的響應(yīng)面圖

通過Design Expert 8.06軟件計(jì)算并分析得到提取工藝的最優(yōu)條件為：81.56%乙醇提取2次，每次1.97 h，液料比為11.69∶1，預(yù)測(cè)竹節(jié)香附素A提取率為2.57 mg/g。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)確定優(yōu)化提取工藝為：11.7倍量82%乙醇提取2次，每次2 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取同一批兩頭尖，精密稱取粗粉3份，每份3 g，按照優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行提取，計(jì)算竹節(jié)香附素A平均提取率為2.61 mg/g，RSD＝2.58%，與預(yù)測(cè)值偏差較小，說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論

近年來，兩頭尖的抗腫瘤作用使其臨床應(yīng)用越來越廣泛，但現(xiàn)階段兩頭尖有效成分提取工藝的研究較少，主要采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行研究。響應(yīng)面法目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥提取工藝研究。

本研究在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上首先固定提取次數(shù)為2次，通過響應(yīng)面法分析提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比3個(gè)因素對(duì)兩頭尖提取工藝的影響，通過回歸分析表明，模擬的二次項(xiàng)方程具有可預(yù)測(cè)性。本研究可以為兩頭尖的提取開發(fā)提供依據(jù)。

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Optimization of Extraction Anemones Raddeanae Rhizoma by Using Response Surface Method

ZHAO Xu, WANG Kun, WANG Nan-fei
(Henan Province Hospital of TCM, Zhengzhou 450002, China)

ObjectiveTo optimize the extraction process of Anemones Raddeanae Rhizoma.MethodsThe extraction rate of raddeanin A was set as response value, and response surface method was employed to investigate the influence of ethanol concentration, extraction time and the amount of alcohol added on the extraction process of Anemones Raddeanae Rhizoma.ResultsOptimized extraction technology was: extracted 2 times with 11.7 times the amount of 82% ethanol, 2 h per time. Under this optimization process, the extraction rate of raddeanin A was 2.24 mg/g.ConclusionThe optimized extraction process can provide a reference for production.

Anemones Raddeanae Rhizoma; response surface method; raddeanin A

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.016

R284.2

A

1005-5304(2017)03-0066-03

2016-04-28）

（

2016-05-17；編輯：陳靜）

河南省科技公共計(jì)劃項(xiàng)目（132102310243）