，，，

（1. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250100；2. 山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250022；3. 威海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東威海 264200）

水貂中大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌三重?zé)晒釶CR方法的建立

王貴升1，2，尹斐斐3，田夫林2，王金寶1

（1. 山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250100；2. 山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250022；3. 威海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東威海 264200）

依據(jù) GenBank 中大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌的部分已知序列，選取大腸桿菌的uidA基因、肺炎克雷伯氏菌的khe基因和不動(dòng)桿菌的secE基因，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，選出擴(kuò)增序列的3對(duì)引物及相應(yīng)的Taqman探針，uidA、khe、secE探針5'端分別標(biāo)記FAM、HEX、CY5熒光發(fā)射基因，3'端標(biāo)記BHQ1淬滅熒光基因。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌的診斷方法。特異性和敏感性試驗(yàn)顯示，該方法能特異地檢測(cè)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌，其最低檢測(cè)限分別為2×10-1CFU/μL、9.2×10-1CFU/μL和4.3×10-1CFU /μL。整個(gè)檢測(cè)擴(kuò)增在2小時(shí)內(nèi)完成。該結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的三重?zé)晒舛縋CR方法的靈敏度、重復(fù)性及特異性均較好，可用于同時(shí)快速檢測(cè)三種病原菌。

大腸桿菌；肺炎克雷伯氏菌；不動(dòng)桿菌；熒光定量PCR

近年來(lái)，隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展與資源約束的矛盾日趨嚴(yán)重，隨之也帶來(lái)了多種動(dòng)物共患病的易發(fā)、高發(fā)和頻發(fā)，抗生素濫用，以及飼料源耐藥基因擴(kuò)散等問(wèn)題，而細(xì)菌性疫病已經(jīng)成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。尤其是大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、不動(dòng)桿菌能夠穿過(guò)毛皮動(dòng)物的血腦屏障，致死率很高，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。因此，為了提高診斷檢測(cè)的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，建立快速檢測(cè)和鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌這三種細(xì)菌的方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源

文中所涉及的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、大腸桿菌（Escherichia coli）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、 弗式檸檬酸桿菌（Freundii Citrobacter）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）均為2012年1月至2014年7月從發(fā)病水貂的肝、肺、腦中分離鑒定的。以上菌株除了肺炎克雷伯氏菌陽(yáng)性對(duì)照保存于中國(guó)微生物菌種保藏普通微生物中心（登記入冊(cè)編號(hào)11222）外，其余均保存在山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心。

1.2主要試劑與儀器

TSA瓊脂、TSB肉湯培養(yǎng)基，10×PCR 反應(yīng)液、Taq酶、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（25 mmol/L），均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌DNA柱式提取試劑盒，購(gòu)自北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

細(xì)胞計(jì)數(shù)板；顯微鏡；生化培養(yǎng)箱；熒光定量PCR儀（羅氏公司生產(chǎn)）；Centrifuge 5417R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)）；生物安全柜（海爾公司生產(chǎn)）。

1.3引物及探針設(shè)計(jì)

分別選取大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌的基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)引物及探針（表1）。引物和探針均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用前用滅菌超純水配成10 μmol/L的濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物及探針信息

1.4核酸提取

參照北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌DNA柱式提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取核酸。

1.5熒光PCR體系建立

反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立25 μL檢測(cè)體系，10 μmol/L引物及探針的加入量分別為0.6 μL、0.8 μL、1 μL、1.2 μL 、1.5 μL；25 mmol/L MgCl2的加入量分別為1 μL、1.2 μL、1.4 μL、1.6 μL、1.8 μL、2 μL；25 mmol/L dNTP的加入量分別為0.5 μL、1 μL、1.5 μL 、2 μL、2.5 μL；Taq酶的加入量分別為0.1 μL、0.2 μL、0.3 μL、0.4 μL、0.5 μL。反應(yīng)程序的優(yōu)化中分別試驗(yàn)退火步驟為50 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、65 ℃ 1 min。

1.6菌液濃度的調(diào)整

選取經(jīng)鑒定純化的水貂源大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌各1株，分別挑單個(gè)菌落于10 mL無(wú)菌試管中過(guò)夜搖菌，得原菌液，做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8十進(jìn)位倍比稀釋。取稀釋好的10-6、10-7、10-8倍三種細(xì)菌的菌液各200 μL，接種于TSA瓊脂上，用無(wú)菌的涂布器均勻涂布后，每個(gè)稀釋度、每種細(xì)菌做3個(gè)重復(fù)，待平板干燥后放于37 ℃烘箱中培養(yǎng)12 h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取3組細(xì)菌計(jì)數(shù)的平均數(shù)為最終活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，乘以稀釋倍數(shù)，再除以0.2。

1.7熒光PCR特異性試驗(yàn)

選取經(jīng)鑒定純化的水貂源大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌各1株，分別挑單個(gè)菌落于10 mL無(wú)菌試管中過(guò)夜搖菌，得原菌液，各取200 μL于1.5 mL離心管中，共3份菌液。同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室保存的3株綠膿桿菌、3株弗式檸檬酸桿菌、3株沙門(mén)氏菌，共9株細(xì)菌，復(fù)蘇于TSA瓊脂上，培養(yǎng)出單個(gè)菌落后，挑取單個(gè)菌落于裝有TSB肉湯的10 mL離心管中，過(guò)夜搖菌。將3株綠膿桿菌、3株弗式檸檬酸桿菌、3株沙門(mén)氏菌的核酸及大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌菌液，采用北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的柱式提取試劑盒提取核酸，運(yùn)用建立好的熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.8熒光PCR靈敏性試驗(yàn)

各取1.7中復(fù)蘇并稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的大腸桿菌菌液、肺炎克雷伯氏菌菌液、不動(dòng)桿菌的菌液200 μL各1份，放入1.5 mL離心管中，共21份200 μL菌液。采用北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的柱式提取的試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)提取21份菌液的核酸。將稀釋濃度相同的3種細(xì)菌的核酸各取10 μL后充分混合，最后形成7份不同稀釋度的3種細(xì)菌混合核酸。把不同稀釋度的3種細(xì)菌混合核酸作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板，熒光定量PCR反應(yīng)采用15 μL反應(yīng)液，10 μL模板，共25 μL的體系。

1.9熒光PCR重復(fù)性試驗(yàn)

取1.7中復(fù)蘇的3種菌液（原菌液）各200 μL，即取10株大腸桿菌菌液各200 μL于10個(gè)不同的1.5 mL離心管中，10株肺炎克雷伯氏菌菌液各200 μL于10個(gè)不同的1.5 mL離心管中，10株不動(dòng)桿菌菌液各200 μL于10個(gè)不同的1.5 mL離心管中。采用北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司的柱式提取的試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)提取30份菌液的核酸。在10株大腸桿菌的核酸、10株肺炎克雷伯氏菌的核酸、10株不動(dòng)桿菌的核酸中，各隨機(jī)挑選其中的1株，將3種細(xì)菌的核酸混合，最后形成10份3種細(xì)菌混合核酸。把3種細(xì)菌混合核酸作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板，熒光定量PCR反應(yīng)采用15 μL反應(yīng)液，10 μL模板，共25 μL的體系。

2 結(jié)果

2.1反應(yīng)條件的優(yōu)化

摸索反應(yīng)條件，建立了25 μL的反應(yīng)體系：10 μmol/L的K1-F 1 μL；10 μmol/L的K1-R 1 μL；10 μmol/L的 T1 1 μL；10 μmol/L的 K2-F 1 μL；10 μmol/L的K2-R 1 μL；10 μmol/L的T2 1 μL；10 μmol/L的K3-F 1.1 μL；10 μmol/L的K3-R 1.1 μL；10 μmol/L的T3 1.1 μL；10×PCR 2.2 μL；25 mmol/ L的MgCl21.8 μL；25 mmol/L的dNTP 2 μL；Taq酶 0.3 μL；核酸10 μL。

優(yōu)化后的程序?yàn)椋旱谝浑A段，預(yù)變性50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；第二階段，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 60 sec，共40個(gè)循環(huán)，最后40 ℃ 10 sec。在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)收集熒光。

2.2菌液濃度的測(cè)定

大腸桿菌菌液稀釋到10-6、10-7、10-8這3個(gè)稀釋度的細(xì)菌平均數(shù)分別為392 CFU、40 CFU、5 CFU，乘以稀釋倍數(shù)，再除以0.2，菌液濃度分 別 為1.96×109CFU/mL、2.00×109CFU/mL、2.50×109CFU/mL，最終得出原菌液濃度為2.15×109CFU/mL。肺炎克雷伯氏菌菌液稀釋到10-6、10-7、10-8這3個(gè)稀釋度的細(xì)菌平均數(shù)分別為184 CFU、21 CFU、3 CFU，菌液濃度分別為9.20×108CFU/mL、1.05×109CFU/mL、1.50×109CFU/mL，最終得出原菌液濃度為1.16 CFU/mL。不動(dòng)桿菌菌液稀釋到10-6、10-7、10-8這3個(gè)稀釋度的細(xì)菌平均數(shù)分別為397 CFU、43 CFU、5 CFU，菌液濃度分別為1.99×109CFU/mL、2.15×109CFU/mL、2.50×109CFU/mL，最終得出原菌液濃度為2.21 CFU/mL。

2.3熒光PCR特異性試驗(yàn)

分別用大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌做陽(yáng)性對(duì)照，去離子水做陰性對(duì)照，同時(shí)選取綠膿桿菌、弗式檸檬酸桿菌和沙門(mén)氏菌各3株做試驗(yàn)樣品。結(jié)果顯示：該方法能夠特異地檢測(cè)出大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌（圖中顯示為S型曲線），3株綠膿桿菌、3株弗式檸檬酸桿菌、3株沙門(mén)氏菌均未檢測(cè)出擴(kuò)增曲線（圖1～3），說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的特異性。

圖1 大腸桿菌的特異性

圖2 肺炎克雷伯氏菌的特異性

2.4熒光PCR陽(yáng)性結(jié)果重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)檢測(cè)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、不動(dòng)桿菌各10株，均出現(xiàn)特異性S型擴(kuò)增曲線，且CT值均未超過(guò)28，表明檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值，變異系數(shù)為7.4%，可見(jiàn)三重?zé)晒釶CR對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、不動(dòng)桿菌陽(yáng)性結(jié)果的重復(fù)性試驗(yàn)比較穩(wěn)定（圖4～6）。

2.5熒光PCR靈敏度試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果顯示：此方法對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌檢測(cè)到的最小菌落個(gè)數(shù)分別為40 CFU、184 CFU和86 CFU（圖7～9）。

圖4 大腸桿菌的重復(fù)性

圖5 肺炎克雷伯氏菌的重復(fù)性

圖6 不動(dòng)桿菌的重復(fù)性

圖7 大腸桿菌的靈敏度

圖8 肺炎克雷伯氏菌的靈敏度

圖9 不動(dòng)桿菌的靈敏度

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，具有高度特異性、靈敏性等特點(diǎn)[5]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、藥物研究、病原菌的檢測(cè)[6-7]。此方法避免了電泳及成像拍照等步驟，減少了交叉污染[8-9]。

在常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)中，大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和不動(dòng)桿菌在普通培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)相似，眼觀不易分辨；采用經(jīng)典細(xì)菌形態(tài)觀察方法，發(fā)現(xiàn)涂片鏡檢下的菌體特點(diǎn)相似，很難區(qū)分；采用細(xì)菌的生化鑒定和16sRNA鑒定，約需3～4天時(shí)間。同時(shí)，16sRNA鑒定還需要測(cè)序，成本也較高。普通的PCR鑒定，靈敏度差，有時(shí)不能直接從樣品中檢測(cè)出細(xì)菌。本研究所建立的檢測(cè)方法具有很好的擴(kuò)增曲線，結(jié)果判定直觀醒目，能為臨床快速檢測(cè)診斷奠定基礎(chǔ)。但本方法由于靈敏度較高，所以操作過(guò)程中仍需要小心操作，避免污染，一旦發(fā)生氣溶膠污染，則需開(kāi)窗通風(fēng)，排出污染性氣溶膠。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Establishment of Triple Fluorescent Quantitative PCR for Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter in Minks

Wang Guisheng1，2，Yin Feifei3，Tian Fulin2，Wang Jinbao1
（1. College of Life Science，Shandong University，Jinan，Shandong 250100；2. Shandong Animal Disease Prevention and Control Center ，Jinan，Shandong 250022；3. Weihai Animal Disease Prevention and Control Center，Weihai，Shandong 264200）

According to the partially known sequences of Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter in GenBank，the uidA gene of Escherichia coli，khe gene of Klebsiella pneumoniae and secE gene of Acinetobacter were selected. Then 3 pairs of primers and Taqman probes of which 5' end were labeled with fl uorophores（FAM，HEX，CY5）respectively ，and 3' end marked with BHQ1 quenchers were designed by Primer Premier 5. By optimizing the reaction conditions，a diagnostic method which could detect Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter simultaneously was established. Experiments of speci fi city and sensitivity showed that this method could speci fi cally detect the above three genes，while the lowest detection limits were 2×10-1CFU/μL，9.2×10-1CFU/μL and 4.3×10-1CFU /μL，respectively. The whole ampli fi cation was completed within two hours. In conclusion，a triple quantitative PCR with good sensitivity，reproducibility and speci fi city was established ，it could be used for rapid and simultaneous detection of the three pathogens.

Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Acinetobacter； fl uorescent quantitative PCR

S851.3

：A

：1005-944X（2017）02-0096-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.028

山東省毛皮動(dòng)物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-18-011-05）

王金寶