劉金霞 瞿利帥 陸翠華 倪溫慨 倪潤洲

·臨床研究與應(yīng)用·

EHD2與E-cadherin在肝細胞肝癌中的表達及其相關(guān)性*

劉金霞 瞿利帥 陸翠華 倪溫慨 倪潤洲

目的：研究EHD2、E-cadherin蛋白在肝細胞肝癌中的表達及兩者相關(guān)性。方法：Western blot法和免疫組織化學(xué)法檢測肝細胞肝癌及對應(yīng)的癌旁組織中EHD2與E-cadherin表達情況，分析兩者的相關(guān)性及與患者臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：EHD2、E-cadherin蛋白在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，且兩者的表達水平與肝癌的組織分化程度、靜脈侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、腫瘤大小等參數(shù)無相關(guān)性。EHD2、E-cadherin低表達與肝癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：EHD2、E-cadherin蛋白表達與肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，兩者的聯(lián)合檢測有助于肝細胞肝癌的診斷、惡性程度及預(yù)后的評估。

肝細胞肝癌 EHD2 E-cadherin Western blot免疫組織化學(xué)

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）簡稱肝癌，是全球五大常見惡性腫瘤之一，死亡率在腫瘤性疾病中居第三位，發(fā)病率高并呈增長趨勢［1］。肝癌的發(fā)生發(fā)展是多因素多階段的連續(xù)發(fā)展過程，如原癌基因的激活和抑癌基因的失活，但其確切的發(fā)病機制仍不清楚［2］。EHD2（EH-domain containing pro?tein 2）是新近發(fā)現(xiàn)的一種C端含有EH域（Eps 15 ho?mology domain）的膜轉(zhuǎn)運調(diào)控蛋白，與EHD1、EHD3和EHD4共同組成EHD（Eps15 homology domain con?taining proteins，EHDs）蛋白家族亞類［3-4］。EHD2在食管癌、乳腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達下降且作為抑癌基因參與其發(fā)生發(fā)展［5-8］。E-cadherin是一種廣泛分布于上皮細胞的鈣依賴性糖蛋白，其表達下降或缺失亦是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［9］。目前國內(nèi)外對于EHD2、E-cadherin在肝癌中的聯(lián)合檢測報道較少。本研究旨在檢測EHD2、E-cadherin在肝癌組織中的表達，探討其表達水平與肝癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，為腫瘤治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

110例肝癌組織石蠟切片標本收集自2005年1月至2009年12月就診于南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科實施肝癌根治性切除術(shù)的患者，其中男性91例、女性19例，年齡23～70歲，平均年齡48歲。其中肝癌直徑≤5 cm為52例，直徑＞5 cm為58例。組織分化程度：低分化43例，中分化46例，高分化21例。所有組織標本均經(jīng)H＆amp;E染色病理診斷為原發(fā)性肝細胞肝癌，且標本切緣均＞1 cm。所有患者均有完整的隨訪資料，且術(shù)前未進行化療、放療或者其他治療。8例配對的新鮮肝癌及癌旁組織標本均于離體后30 min內(nèi)置于-70℃冰箱內(nèi)保存，作為后續(xù)蛋白提取。本研究通過南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理審查委員會的審查。

1.2 方法

1.2.1 Western blot實驗 各取100 mg新鮮的肝癌及癌旁組織，加入RIPA裂解液提取組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加入制備好的SDS-PAGE上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于脫脂牛奶中室溫封閉2 h，孵育稀釋的一抗EHD2（1:400）購自美國Santa Cruz公司，E-cadherin（1:1 000）購自美國Santa Cruz公司，GAPDH（1:1 000）購自美國Santa Cruz公司。4℃過夜，TBST洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗2 h，經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光（ECL）熒光底物反應(yīng)后，膠片曝光顯影，掃描灰度。目的蛋白與內(nèi)參灰度的比值即為目的蛋白的相對表達量。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP法染色 程序按照SP試劑盒說明書操作。所有的石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟、水化后，加入檸檬酸抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，3%過氧化氫封閉10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加稀釋的一抗EHD2（1:100）購自美國Santa Cruz公司，E-cadherin（1:500）購自美國Santa Cruz公司，室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后加入對應(yīng)的二抗室溫孵育30 min，PBS再次充分洗滌后DAB顯色，蘇木青襯染，0.1%HCL分化，梯度酒精、二甲苯脫水，中性樹膠封片鏡檢。采用PBS代替一抗者作為陰性對照。

1.2.3 陽性結(jié)果判斷標準 EHD2以細胞漿或細胞膜出現(xiàn)彌漫分布的棕黃色或棕黃色顆粒為陽性。E-cadherin以細胞膜出現(xiàn)棕黃色或者棕黃色顆粒為陽性，細胞質(zhì)表達而細胞膜不表達者為陰性。雙盲法讀片。每張切片隨機選取10個高倍視野（×200倍），分別計數(shù)100個細胞，總共計數(shù)1 000個細胞，得到陽性細胞百分比。陽性細胞百分比定義為1（＜10%）、2（11～50%）、3（51～80%）、4（＞80%）。染色強度評分定義為：0（陰性）、1分（弱陽性）、2分（陽性）、3分（強陽性）。最終染色評分以染色強度得分×陽性細胞百分比計算［10］，0～4分為低表達，＞4分為高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)采用SPSS 21.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。EHD2、E-cadherin在肝癌組織中的表達和臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗分析，EHD2、E-cad?herin兩者表達的相關(guān)性Spearman等級相關(guān)分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EHD2、E-cadherin在肝癌和癌旁組織中的表達

Western blot結(jié)果表明，EHD2、E-cadherin在癌旁組織中均可檢測到表達，對應(yīng)的肝癌組織中低表達或者缺失表達（圖1）。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，EHD2、E-cadherin在肝癌組織中低表達或者缺失表達（圖2A，B）。EHD2、E-cadherin在癌旁組織高表達，主要定位于細胞漿或者細胞膜，染色呈棕黃色（圖2C，D）。

?A.Expression of EHD2 and E-cadherin protein in eight fresh HCC specimens and adjacent noncancerous tissues. B.The preceding bar chart demonstrates the ratio of EHD2 and E-cadherin protein to GAPDH by densitometry; T:HCC tissues;N:adjacent noncancerous tissues圖1 EHD2、E-cadherin在新鮮肝癌及癌旁組織中的表達Figure 1 EHD2 and E-cadherin expression in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues

2.2 EHD2、E-cadherin的表達與肝癌臨床病理因素的關(guān)系

肝癌組織中EHD2、E-cadherin的表達與組織分化程度、靜脈侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、腫瘤大小、腫瘤包膜、乙肝病毒感染、肝硬化、血清AFP等無相關(guān)性（表1）。

2.3 EHD2、E-cadherin在肝癌組織表達的相關(guān)性分析

在110例肝癌組織中對EHD2、E-cadherin的表達進行免疫組織化學(xué)染色分析，發(fā)現(xiàn)兩者的表達在肝癌組織中存在正向變化趨勢，Spearman等級相關(guān)分析顯示兩者的表達呈正相關(guān)（r=0.580，P＜0.001）。

2.4 EHD2、E-cadherin對肝癌患者生存期的影響

經(jīng)Kaplan-Meier法分析，EHD2高表達的53例患者生存率明顯高于57例低表達或者缺失表達的患者（P＜0.05，圖3A），E-cadherin高表達的48例患者生存率也明顯高于其62例低表達或者缺失表達的患者（P＜0.05，圖3B），且EHD2、E-cadherin同時高表達的40例患者生存率亦明顯高于其他患者（n=70），預(yù)后較好（P＜0.05，圖3C）。

圖2 EHD2、E-cadherin在肝癌和癌旁石蠟組織中的表達（SP×200）Figure 2 Expression of EHD2 and E-cadherin in HCC tissues and adjacent noncancerous tissues(SP×200)

表1 肝癌中EHD2、E-cadherin表達水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Table 1 Association of EHD2 and E-cadherin expression with clinicopathological parameters in 110 hepatocellular carcinoma specimens

表1 肝癌中EHD2、E-cadherin表達水平與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系（續(xù)表1）Table 1 Association of EHD2 and E-cadherin expression with clinicopathological parameters in 110 hepatocellular carcinoma specimens

圖3 EHD2、E-cadherin表達與患者生存率的關(guān)系Figure 3 Association of EHD2 and E-cadherin expression with the overall survival of HCC patients by Kaplan-Meier analysis

3 討論

肝細胞肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)性死亡的重要原因之一，特別是在亞洲［11］。盡管近年來肝癌發(fā)病率和死亡率有所降低，但是肝癌切除術(shù)后的患者5年生存率低，預(yù)后差［12］。目前對于肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展的精確分子機制尚未明確，因此探索研究在肝癌進程中所涉及的癌基因及抑癌基因可為設(shè)計分子生物學(xué)預(yù)防及治療提供依據(jù)。

胞吞作用通過調(diào)節(jié)核信號、核轉(zhuǎn)錄和腫瘤致瘤性促進腫瘤的進展［13］。EHD2作為新發(fā)現(xiàn)的膜轉(zhuǎn)運蛋白可以調(diào)節(jié)包括神經(jīng)生長因子受體、類胰島素生長因子受體等在內(nèi)的多種受體的循環(huán)和胞吞，從而參與調(diào)節(jié)細胞黏附、形態(tài)發(fā)生、遷移和細胞分裂等生理病理過程［14-16］。文獻報道EHD2能與參與肌動蛋白微絲組裝的重要分子EHBP1相互作用，調(diào)節(jié)細胞骨架和極性從而促進腫瘤的惡性進展［17］。EHD2也能夠與Nek3和Vav1相互作用調(diào)節(jié)Rac1的活性從而調(diào)節(jié)肌動蛋白重組促進胞吞作用影響腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移［18］。近年研究發(fā)現(xiàn)，EHD2在多種腫瘤中均存在異常表達。EHD2在惡性漿液卵巢癌中表達明顯降低［19］，且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中作為抑癌基因缺失表達，EHD2在食管鱗狀細胞癌中的表達障礙可以引起食管鱗狀細胞結(jié)構(gòu)的改變而促進其遷移。在乳腺癌中，EHD2的表達水平隨著其腫瘤病理學(xué)分級的升高而逐漸降低，與其不良預(yù)后密切相關(guān)，且在乳腺癌細胞中抑制EHD2的表達可以促進E-cadherin表達下降和N-cadherin表達上調(diào)從而促進細胞的增殖和遷移，由此推測EHD2可以通過調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生影響乳腺癌的進展。E-cadherin的缺失或降低也會影響細胞黏附，造成腫瘤擴散浸潤轉(zhuǎn)移，是腫瘤發(fā)展過程中的重要步驟［20］。但是兩者在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)性鮮有報道。

本研究通過Western blot檢測8例新鮮的肝癌組織和癌旁組織中EHD2和E-cadherin的表達，結(jié)果顯示兩者存在差異性表達，且在肝癌組織中的表達顯著低于癌旁組織的表達。通過免疫組織化學(xué)檢測進一步證實了EHD2、E-cadherin在肝癌組織中低表達或者缺失表達，在癌旁組織中高表達，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。分析兩者的表達與肝癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EHD2、E-cadherin的表達與肝癌的組織分化程度、靜脈侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），且隨著腫瘤組織分化程度的降低，靜脈侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，表達水平逐漸降低，而與年齡、性別、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、腫瘤大小、腫瘤包膜、乙肝病毒感染、肝硬化、血清AFP等參數(shù)無相關(guān)性。通過Kaplan-Meier法對患者生存時間及預(yù)后進行分析，提示EHD2高表達的患者生存率明顯高于低表達或者缺失表達的患者（P＜0.05），EHD2、E-cadherin同時高表達的患者生存率亦明顯高于其他患者（P＜0.05）。這些結(jié)果均表明EHD2、E-cadherin在肝癌組織中的表達與患者預(yù)后有關(guān)，可以作為判斷患者預(yù)后的重要指標。此外，EHD2、E-cadherin在肝癌組織中的表達呈正相關(guān)（r=0.580，P＜0.001），提示兩者在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能存在協(xié)同作用。由于EHD2是可調(diào)節(jié)多種受體內(nèi)吞的膜轉(zhuǎn)運蛋白，且E-cadherin為重要的跨膜受體，推測兩者之間存在相互作用，EHD2的表達下降可以促進E-cadherin的循環(huán)從而促進肝癌的進展。因此聯(lián)合檢測肝癌組織中EHD2、E-cadherin有助于判斷腫瘤的惡性程度及進展，也為預(yù)后判斷和輔助治療提供了依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示EHD2可能作為肝癌新的抑癌基因與E-cadherin協(xié)同在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是肝癌基因治療潛在的靶點。但是EHD2協(xié)同E-cadherin參與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機制尚需要在肝癌細胞系中進行深入研究。

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（2016-11-18收稿）

（2017-01-13修回）

Expression and correlation of EHD2 and E-cadherin in hepatocellular carcinoma

Jinxia LIU,Lishuai QU,Cuihua LU,Wenkai NI,Runzhou NI
Correspondence to:Runzhou NI;E-mail:Nirunzhou@yeah.net

Department of Gastroenterology,The Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81401985)

Objective:To investigate the expression and correlation of EHD2 and E-cadherin in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Western blot and immunohistochemistry were used to detect the expression of EHD2 and E-cadherin in HCC specimens and adjacent noncancerous tissues.The correlations of EHD2 and E-cadherin with the clinicopathological characteristics and prognosis of patients were further analyzed using Pearson χ2test and Kaplan-Meier method.Results:EHD2 expression,along with E-cadherin,was markedly reduced in HCC tissues than in adjacent noncancerous tissues.Moreover,EHD2 and E-cadherin expression were correlated with histological grade,microvascular invasion,and lymph node metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that HCC patients with decreased EHD2 and E-cadherin expression had shorter overall survival time than those with higher expression.Conclusion:The abnormal expression of EHD2 and E-cadherin possibly promote HCC.Detection of EHD2 and E-cadherin may be valuable for diagnosing HCC and evaluating malignancy extent and prognosis.

hepatocellular carcinoma,EHD2,E-cadherin,Western blot,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.329

南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（江蘇省南通市226001）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項目（編號：81401985）資助

倪潤洲 Nirunzhou@yeah.net

劉金霞 專業(yè)方向為肝細胞肝癌的分子生物學(xué)研究。

E-mail：liujinxia1985@yeah.net